发酵工艺综合实验
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取样时间：0、8、16、24、32、40、48h 测定：pH、总糖含量、还原糖含量
注意！0h培养液要留一部分放置冰箱作为菌体浓 度测定的对照。
内容2 总糖与还原糖含量的测定
DNS法
总糖的水解和提取
取2.5mL发酵上清液，加入装有5mL6moL/L HCL及 10mL蒸馏水的50mL的三角瓶中，微沸加热水解30min。 待三角瓶冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6moL/L NaOH中和至微红色，将水解液全部收集在50mL的容 量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为总糖待测液。
准备
每班选出1-2个同学跟着实验室毛会丽老师准备实 验，配制试剂，活化菌种，准备时间段在第十五周。 选出人员后报与毛会丽老师。
分组
每个实验室由班长总负责，分为2大组； 每一大 组分2小组，自由组合分别作液体、固体发酵实验； 分组名单由班长报给辅导老师，向辅导老师留联系 方式。
辅导老师联系方式：
李 端： 周晨妍： 刘振华： 明 红： 毛会丽：
生命科学技术系 发酵工程综合实验
发酵工程教研室
2012.05
实验内容
发酵工程实验Ⅰ ------酵母的液体发酵 发酵工程实验Ⅱ ------黑曲霉的固体发酵
内容
本次实验分酵母的液体发酵和黑曲霉固体发酵两个 内容；以实验小组为单位，分发、清洗本小组实验所 需要玻璃仪器、结束后清洗回收；配制本小组所需基 本试剂。
内容1摇瓶酵母的接种与培养
斜面菌种的制备
无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取 适量孢子涂在PDA斜面上，然后置28-30℃的恒温箱培 养2-3d。
种子培养基的制备
斜面培养基 种子培养基
按照 配方 称量
种子培养基
分装250mL 锥形瓶(50mL)
冷却备用
置于超净工作台上
121℃下 灭菌30min
注意！微沸加热水解时一定注意锅内的水不要烧干！
标准曲线的绘制
1mg/mL葡 萄糖标准液
0mL 2.0mL 0.2mL 1.8mL 0.4mL 1.6mL
0.6mL 1.4mL 0.8mL 1.2mL 1.0mL 1.0mL 1.2mL 0.8mL
1.5mLDNS
注意！测定前一定要检 查波长是否正确！
发酵工程实验Ⅰ ------液体发酵
实验一 酵母的液体摇瓶发酵实验
❖实验目的 ❖实验材料和器材 ❖实验内容 ❖作业及思考题
一、实验目的
➢掌握液体发酵种子液的制备和摇瓶发酵技术及
方法
➢掌握总糖和还原糖含量的测定方法 ➢掌握常用的比色分析方法的操作技术 ➢熟悉酵母菌的微生物学特性及培养方法
二、实验材料和试剂配制方法
四、作业及思考题
1.观察记录酵母菌细胞液体发酵过程中发酵液的颜色， 粘度，菌丝形态以及气味。 2.测定酵母菌的简单分批发酵中每次取样中菌体细胞 生长量、总糖和还原糖含量和pH值，绘制发酵曲线。
(4)6moL/L HCL: 先于1000mL容量瓶中加入约200mL蒸 馏水，然后取540mL浓盐酸沿瓶壁缓慢加入，加水定容 至1000mL。
(5)6moL/L NaOH ：称取240g NaOH ，溶于800mL 蒸 馏水中，待散热冷却后，加水定容至1000mL。
（每个实验室！）
三、实验内容
➢摇瓶酵母的接种与培养 ➢总糖含量的测定 ➢还原糖含量的测定 ➢pH值的测定
加封口膜
种子液制备流程
PDA酵母斜面 刮取2-3环
种子液
加入无菌水 洗下细胞
菌体细胞悬浮液
移液管吸 取孢子液 加入摇瓶 接种量10%
28℃摇床 140rpm 摇瓶接种
培养2d
发酵设置及培养
种子液
接种量10% 发酵培养基
140rpm 发酵培养物
28℃
Ps：每个瓶子设一个平行
取样和需测定的指标
发酵培养物
1.实验菌种：酵母菌
平板照片
菌丝显微照片
2.实验仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1mL，2mL，
10mL）、吸耳球、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 mL， 500mL）、量筒（250mL，500mL，1000mL）、 玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振 荡培养箱、恒温箱、台秤等。
3.培养基
⑵ DNS试剂：称取20.00g 3,5-二硝基水杨酸溶解于 1.5L水，一边不断地搅拌一边逐渐加入32.0gNaOH， 让其溶解。然后逐渐加入苯酚10g，亚硫酸钠10g， 酒石酸钾钠600g，加热至45℃，冷却后在2.0L的容量 瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。（已经配制！）
(3) 酚酞指示剂：称取5g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。
加 入
沸水浴5min CW定容至25mL
后冷却至室温
后 混 匀
540nm波长处比 色，以0管调零
总糖和还原糖的测定
管号
总糖待测液 （mL）
总糖测定管号 ⅠⅡ Ⅲ
11 1
管号
还原糖测定管号 1 23
上清液（mL） 0.5 0.5 0.5
蒸馏水（mL） 1 1
1
蒸馏水（mL） 1.5 1.5 1.5
DNS（mL） 1.5 1.5 1.5
(1)斜面培养基
麦芽汁培养基：10o麦芽汁100mL，琼脂2g(2%)， 加热 煮沸溶解，蒸发所失体积用水补足，定容至100mL。
PDA培养基：取去皮马铃薯20g，切成小块，加水100mL。 微沸30min，用纱布过滤，加2g葡萄糖，加热煮沸后加 入2g琼脂，继续加热融化并补足失水，定容至100mL。
DNS（mL） 1.5 1.5 1.5
然后沸水浴5分钟，冷却到室温，于540nm波长处进行测定。
计算公式
葡萄糖质g量 ） （ 反应体积
还原糖（μg/mL）=
样品体积m数 ） l （
Байду номын сангаас
总糖（μg/mL）=
葡萄糖质 g） 水 量解 （ 体 反积 应体
样品体m 积 ） l 数（
内容3 pH值的测定
将发酵液混匀后，用玻璃 棒沾取发酵液，用4.0-5.8或 5.5-9.0pH试纸检测，测出发 酵液的pH值。
(2)种子培养基：10°麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%， 玉米浆1%，尿素0.2%，pH5.0。
(3)发酵培养基：玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓 度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。
装量：30mL/250mL
4.试剂的配制
(1) 1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄 糖，置于小烧杯中用少量的蒸馏水溶解后，定容转移 到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀， 冰箱保存备用。（每小组！）
注意！0h培养液要留一部分放置冰箱作为菌体浓 度测定的对照。
内容2 总糖与还原糖含量的测定
DNS法
总糖的水解和提取
取2.5mL发酵上清液，加入装有5mL6moL/L HCL及 10mL蒸馏水的50mL的三角瓶中，微沸加热水解30min。 待三角瓶冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6moL/L NaOH中和至微红色，将水解液全部收集在50mL的容 量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为总糖待测液。
准备
每班选出1-2个同学跟着实验室毛会丽老师准备实 验，配制试剂，活化菌种，准备时间段在第十五周。 选出人员后报与毛会丽老师。
分组
每个实验室由班长总负责，分为2大组； 每一大 组分2小组，自由组合分别作液体、固体发酵实验； 分组名单由班长报给辅导老师，向辅导老师留联系 方式。
辅导老师联系方式：
李 端： 周晨妍： 刘振华： 明 红： 毛会丽：
生命科学技术系 发酵工程综合实验
发酵工程教研室
2012.05
实验内容
发酵工程实验Ⅰ ------酵母的液体发酵 发酵工程实验Ⅱ ------黑曲霉的固体发酵
内容
本次实验分酵母的液体发酵和黑曲霉固体发酵两个 内容；以实验小组为单位，分发、清洗本小组实验所 需要玻璃仪器、结束后清洗回收；配制本小组所需基 本试剂。
内容1摇瓶酵母的接种与培养
斜面菌种的制备
无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取 适量孢子涂在PDA斜面上，然后置28-30℃的恒温箱培 养2-3d。
种子培养基的制备
斜面培养基 种子培养基
按照 配方 称量
种子培养基
分装250mL 锥形瓶(50mL)
冷却备用
置于超净工作台上
121℃下 灭菌30min
注意！微沸加热水解时一定注意锅内的水不要烧干！
标准曲线的绘制
1mg/mL葡 萄糖标准液
0mL 2.0mL 0.2mL 1.8mL 0.4mL 1.6mL
0.6mL 1.4mL 0.8mL 1.2mL 1.0mL 1.0mL 1.2mL 0.8mL
1.5mLDNS
注意！测定前一定要检 查波长是否正确！
发酵工程实验Ⅰ ------液体发酵
实验一 酵母的液体摇瓶发酵实验
❖实验目的 ❖实验材料和器材 ❖实验内容 ❖作业及思考题
一、实验目的
➢掌握液体发酵种子液的制备和摇瓶发酵技术及
方法
➢掌握总糖和还原糖含量的测定方法 ➢掌握常用的比色分析方法的操作技术 ➢熟悉酵母菌的微生物学特性及培养方法
二、实验材料和试剂配制方法
四、作业及思考题
1.观察记录酵母菌细胞液体发酵过程中发酵液的颜色， 粘度，菌丝形态以及气味。 2.测定酵母菌的简单分批发酵中每次取样中菌体细胞 生长量、总糖和还原糖含量和pH值，绘制发酵曲线。
(4)6moL/L HCL: 先于1000mL容量瓶中加入约200mL蒸 馏水，然后取540mL浓盐酸沿瓶壁缓慢加入，加水定容 至1000mL。
(5)6moL/L NaOH ：称取240g NaOH ，溶于800mL 蒸 馏水中，待散热冷却后，加水定容至1000mL。
（每个实验室！）
三、实验内容
➢摇瓶酵母的接种与培养 ➢总糖含量的测定 ➢还原糖含量的测定 ➢pH值的测定
加封口膜
种子液制备流程
PDA酵母斜面 刮取2-3环
种子液
加入无菌水 洗下细胞
菌体细胞悬浮液
移液管吸 取孢子液 加入摇瓶 接种量10%
28℃摇床 140rpm 摇瓶接种
培养2d
发酵设置及培养
种子液
接种量10% 发酵培养基
140rpm 发酵培养物
28℃
Ps：每个瓶子设一个平行
取样和需测定的指标
发酵培养物
1.实验菌种：酵母菌
平板照片
菌丝显微照片
2.实验仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1mL，2mL，
10mL）、吸耳球、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 mL， 500mL）、量筒（250mL，500mL，1000mL）、 玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振 荡培养箱、恒温箱、台秤等。
3.培养基
⑵ DNS试剂：称取20.00g 3,5-二硝基水杨酸溶解于 1.5L水，一边不断地搅拌一边逐渐加入32.0gNaOH， 让其溶解。然后逐渐加入苯酚10g，亚硫酸钠10g， 酒石酸钾钠600g，加热至45℃，冷却后在2.0L的容量 瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。（已经配制！）
(3) 酚酞指示剂：称取5g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。
加 入
沸水浴5min CW定容至25mL
后冷却至室温
后 混 匀
540nm波长处比 色，以0管调零
总糖和还原糖的测定
管号
总糖待测液 （mL）
总糖测定管号 ⅠⅡ Ⅲ
11 1
管号
还原糖测定管号 1 23
上清液（mL） 0.5 0.5 0.5
蒸馏水（mL） 1 1
1
蒸馏水（mL） 1.5 1.5 1.5
DNS（mL） 1.5 1.5 1.5
(1)斜面培养基
麦芽汁培养基：10o麦芽汁100mL，琼脂2g(2%)， 加热 煮沸溶解，蒸发所失体积用水补足，定容至100mL。
PDA培养基：取去皮马铃薯20g，切成小块，加水100mL。 微沸30min，用纱布过滤，加2g葡萄糖，加热煮沸后加 入2g琼脂，继续加热融化并补足失水，定容至100mL。
DNS（mL） 1.5 1.5 1.5
然后沸水浴5分钟，冷却到室温，于540nm波长处进行测定。
计算公式
葡萄糖质g量 ） （ 反应体积
还原糖（μg/mL）=
样品体积m数 ） l （
Байду номын сангаас
总糖（μg/mL）=
葡萄糖质 g） 水 量解 （ 体 反积 应体
样品体m 积 ） l 数（
内容3 pH值的测定
将发酵液混匀后，用玻璃 棒沾取发酵液，用4.0-5.8或 5.5-9.0pH试纸检测，测出发 酵液的pH值。
(2)种子培养基：10°麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%， 玉米浆1%，尿素0.2%，pH5.0。
(3)发酵培养基：玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓 度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。
装量：30mL/250mL
4.试剂的配制
(1) 1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄 糖，置于小烧杯中用少量的蒸馏水溶解后，定容转移 到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀， 冰箱保存备用。（每小组！）