正常和肿瘤组织细胞培养(课件)
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
《组织细胞培养技术》PPT课件
2．Hanks使用液配制法 取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释 10 倍，即成使用液。用前高压灭菌。 例如配制100 ml Hank使用液，则取三 蒸水 900ml 加入甲液 50ml 、乙液 50ml 混 匀，用高压灭菌15min。临用时，用 7.5％NaHCO3调至所需pH。
附 ： 为配 制 上述 Hanks 液 ， 应先 配 好 0.4 ％酚红溶液待用。配制方法如下： 称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐 渐加入 0.1mol/L NaOH 边滴边研至酚红 完全溶解，记好加 NaOH 的量，共加至 11.28ml 为止，将研好的酚红液用吸管 移入烧瓶中加三蒸水 88.72ml ，高压灭 菌15min。
组织细胞培养技术
授课教师 左 丽
贵阳医学院免疫学教研室 2008年4月10日
第三章
培养用液
培养用液是维护组织细胞生存、生 长及进行细胞培养各项操作过程中所 需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、 常用试剂及培养基三大类，培养基又 分为天然培养基与合成培养基.
平 衡 盐 溶 液 （ balanced salt solution， BSS）具有维持渗透压，调 控酸、碱平衡的作用，并可供细胞生存 所需的能量和无机离子成分，另外尚可 用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养 用液的基础溶液。常用试剂是制备细胞、 培养细胞及检查细胞所必需的，为细胞 培养提供了方便、有利的条件。
BSS内还含有少量的酚红，作为pH 变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄 色，变碱性时呈紫红色，中性时呈 桃红色。
目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和 PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下： （1）作为配制培养基的基础溶液： （2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。 （3）用于洗涤组织和细胞。
肿瘤细胞培养方法及步骤
肿瘤细胞培养方法及步骤
一、机械刮除法
1．标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。
2．刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。
3．用Hanks液冲清洗一两次，洗除被刮掉的细胞。
4．注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
二、反复帖壁法
1．待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。
2．取编号为A、B、C三个培养瓶。
首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后，向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。
3．培养B瓶中细胞5～20分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶补加完全培养基。
三、消化排除法
1．先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养基细胞一次，然后再换成新的混合继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。
2．把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养，向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
四、胶原酶消化法
1．可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化。
2．用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
《肿瘤的微环境》课件
基于肿瘤微环境的免疫治疗策略
免疫检查点抑制剂
通过抑制肿瘤微环境中免疫细胞的抑制信号，激 活免疫细胞的攻击能力。
细胞免疫治疗
利用患者自身的免疫细胞，经过体外培养和扩增 后回输到患者体内，以攻击肿瘤细胞。
肿瘤疫苗
通过激发机体免疫系统对肿瘤抗原的免疫反应， 预防或延缓肿瘤的发生和发展。
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细胞学方法
细胞培养
将肿瘤细胞从组织中分离出来，在体外进行培养，用于研究肿瘤细胞的生长、增 殖和分化等特性。
细胞共培养
将肿瘤细胞与其他类型的细胞共同培养，模拟肿瘤细胞在体内的生长环境，研究 肿瘤细胞与周围细胞的相互作用。
分子生物学方法
基因表达分析
利用基因芯片或测序技术检测肿瘤组织中基因的表达水平，了解肿瘤细胞的基因组学特 征。
肿瘤微环境的信号转导途径
01
MAPK信号转导途径
MAPK信号转导途径是肿瘤微环境中 重要的信号转导途径之一，它可以影 响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。
02
PI3K/Akt信号转导 途径
PI3K/Akt信号转导途径是肿瘤微环境 中重要的信号转导途径之一，它可以 影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。
03
JAK/STAT信号转导 途径
营养物质供应与代谢产物排除
肿瘤微环境中的血管为肿瘤提供营养物质，同时排出代谢产物，对肿瘤的生长和扩散具有重要影响。
肿瘤发展对肿瘤微环境的影响
肿瘤细胞对周围组织的侵袭与重塑
肿瘤细胞通过分泌酶类等物质对周围组织进行侵袭，同时重塑微环境以利于自 身的生长和扩散。
血管生成与血液供应
肿瘤在生长过程中诱导新血管生成，以获取更多的营养物质，从而影响肿瘤微 环境的血液供应。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。
它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。
本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养的基本原理肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。
培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。
二、肿瘤细胞培养的方法1. 细胞来源选择肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。
可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。
选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。
2. 细胞分离和传代细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。
分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。
3. 细胞培养条件细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。
首先是选择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。
4. 细胞检测和鉴定培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。
常用的方法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。
鉴定后的细胞可以用于进一步的实验研究。
三、肿瘤细胞培养的应用1. 药物筛选和耐药性研究肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。
此外，肿瘤细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。
2. 基因功能研究通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。
肿瘤细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1、取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
2、培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMII640.DMEM s Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子
的需求都存在着差异。
但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。
有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。
总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
细胞培养PPT课件
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／
2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹
打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种 渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高 胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻 结过程，能使细胞内水分在冻结前透出 细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰 晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3
小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将
培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，
（4）酶标仪检测各孔OD值（检 测波长为570 nm）。记录结果，绘 制细胞生长曲线
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细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少 入力、经费，减少污染，减少细胞生物 学特性变化。
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冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰 晶。
抑制可能存在的细菌的生长。
通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉
素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳
肿瘤细胞培养
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癌细胞系的建立
（2）反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特 点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类 细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。
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癌细胞系的建立
待细胞生长达一定数量后用胰酶消化，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培
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癌细胞系的建立
（一）癌细胞原代培养
癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标 本收集和处理、原代培养、传代、换液、冻存、复 苏等过程。
培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适 宜的培养液和培养底物等几个方面。
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癌细胞系的建立
养液，吹打制成细胞悬液；
取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A瓶中，置温箱中静止 培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部 培养液，再接种入B瓶中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C瓶中；再 向B瓶中补加完全培养基。
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3、癌基因和抑癌基因方面的研究
实验证明癌的发生和发展与癌基因（原癌基因）和抑癌基因两 种基因的表达调控密切相关。
体外细胞培养既利于测定癌基因及癌基因表达产物，又可以 测定抑癌基因的表达水平。癌细胞的体外培养是定量研究癌 基因和抑癌基因表达调控的理想工具。
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癌细胞系的建立
（1）机械刮除法
肿瘤分子生物学(共46张PPT)
③染色体易位和基因重排
Ⅲ体外不能使培养的细胞发生转化。
C-myb：白血病，淋巴瘤，卵巢癌
易位是指某一段基因从染色体正常位置转移到另 若等为基因中一个基因突变与腺瘤形成有关，另一个也突变，则发生结肠癌。
主要通过阻止细胞生长繁殖，抑制瘤细胞进入S期，是细胞周期固有的抑制成分，一旦异常，引发多种肿瘤。 ⑥表达调控细胞凋亡的Bcl-2癌蛋白
中，C-sis的活性蛋白PDGF对C-myc表达起协同作用。
，重排后形成bcr-abl融合基因，使P145变为P210 ⑴与肿瘤细胞锚定黏附能力有关的分子机制
通过GTP到GDP的转换释放磷酸和能量，可将细胞表面的刺激信号（生长因子、激酶或神经递质）传到细胞内效应器上。
，表达酪氨酸激酶，从而异常激活。（ ⒊细胞寿命长，有的在体外可长期培养、传代建系
④GTP酶类的癌蛋白
H-rab、K-rab、N-ras、C-gip2、C-gsp的表达产物 为GTP酶、信号传递蛋白。通过GTP到GDP的转换 释放磷酸和能量，可将细胞表面的刺激信号（生 长因子、激酶或神经递质）传到细胞内效应器上 。
GTP转换成GDP需与GAP结合，上述原癌基因点突 变后的产物p21含改变GAP与GTP结合，影响GTP向 GDP转换，使细胞刺激信号传递到效应器的时间大 为延长而致癌。
⑤表达核内转录调控的癌蛋白
C-enbA、C-ets-1、C-ets-2、C-fos、C-jun 、C-mgc等这些基因有一些区域具有与蛋 白质结合的功能结构域，其基因产物可 与DNA结合，也可先与蛋白质结合形成 二聚体后，再与DNA结合，然后调控下 游靶基因转录。如C-myc产物在核内与 DNA结合后，可调控DNA复制，使细胞 持续增生，不能进入终末分化，呈幼稚 类型，即癌。
肿瘤课件ppt课件
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【病理】 恶性肿瘤的发生过程包括癌前期、原位癌、及浸 润癌三个阶段。致癌因素作用约30—40年，经过 约10年癌前期阶段恶变为原位癌。原位癌历经3— 5年，在促癌因素作用下发展成浸润癌。浸润癌的 病程约一年，长者可达10年左右。癌前期为上皮不 典型增生，如萎缩性胃炎、乳腺增生等。
肿瘤细胞的分化分为高、中、低（或未分化） 三类，或称三级。
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肿瘤良恶性的鉴别
良性肿瘤
恶性肿瘤
发生发展 生长缓慢
生长快、且不断
生长
生长方式 膨胀性生长、
浸润性生长、无包膜
包膜完整
边界清楚、活动性好 界限不清、活动性差
转移
无
有
组织形态 分化程度高
分化程度底
机体危害 小
大、可出现全身衰竭
治疗结果 易治愈、不复发
不易治疗、易复发
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【诊断】 病史：家族史、居住与工作环境、症状、年龄、月经生育
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【临床表现】 肿物：肿瘤的主要表现，浅表易发现常是第一症
状。内脏出现相应症状才引起注意。 肿痛：早期少疼痛，晚期侵犯神经而发生疼痛。 溃疡：癌肿致组织坏死而形成溃疡，表现为出
血；胃癌—黑便 直肠癌—粘液血便 肺 癌—咯血。 受损器官症状：肝癌—肝功损坏、肝昏迷；肺 癌—呼吸困难；骨肉瘤—病理性骨折。 局部淋巴结转移和远处转移的症状： 癌细胞转移至局部—淋巴结肿大；肺癌—血性胸水。 全身症状：晚期消瘦、贫血、发热呈恶病质。
治疗：手术切除。
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四、血管瘤 1毛细血管瘤
由真皮内增生、扩张的毛细血管构成。血管瘤与淋巴管瘤或脂肪瘤并存而 发生淋巴血管瘤或脂肪血管瘤。也可与先天动静脉瘘同时并存。 ⑴草莓状毛细血管瘤：好发于面颈部，表面高低不平，似草莓状，界限清楚，
不同类型细胞的培养特点
(3) 用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞； (4) 剩余内皮细胞岛如小(5 ~ 20 个细胞) 而少时，生长
增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3等饲 细胞；饲细胞接种量为4000 细胞／cm2； (5) 当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消 化、离心、加入肿瘤条件培养基； (6) 接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰)， 细胞增殖生长汇合后，按1:5 传代。
皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。
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❖ 上皮细胞培养有三个难点： ①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则
利于细胞生长； ②需求特殊培养基； ③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞
同时混杂生长，并常压过上皮细胞。 ❖ 纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养
的关键之一。
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(一)表皮细胞培养 1．特点：
(4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。
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2．表皮细胞培养程序：
(1) 取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳， 早产流产儿皮肤更好，切成0.5 ~ 1cm2小块；
(2) EDTA 处理：先置入0.02％ EDTA 中室温置5 分钟。 (3) 冷消化：换入0.25% 胰蛋白酶中，置4℃过夜； (4) 分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；
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❖【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养
细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理 的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。
❖饲细胞作用：
❖ 有同化营养液的能力。 ❖ 饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。
克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。
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饲细胞的制备：
(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90% 汇 合时制成细胞悬液，再按103 细胞/毫升重新接种 培养；
细胞培养技术 ppt课件
PPT课件
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂
（7）其他
谷氨酰胺： 终浓度2 mmol/L HEPES： 丙酮酸钠： 10-25 mmol/L 终浓度1 mmol/L
2-巯基乙醇：终浓度50 uM
PPT课件
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三、培养细胞技术 （一）基本操作
1. 无菌操作
防止微生物污染； 培养用一切物品、液体都无菌。 （37度预热，或室温平衡） 2. 操作区消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和着装 4. 实验操作
• 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开 发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 • 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
PPT课件 4
细胞培养目的和作用
基础研究
(1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生机理。
2、生物制药
• 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗 等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
二、培养细胞相关条件
• 血清分类
• 1、特级胎牛血清（最高级别的） （1）Hyclone 北美特级胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特级胎牛血清（16000-044）
• 2、优等级胎牛血清 （1）Hyclone加拿大优等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亚优等胎牛血清（SH30084） （3）Gibco澳大利亚胎牛血清（10099-141）
PPT课件 3
细胞培养目的和作用
1、科学研究
药物研究与开发
• 新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分 筛选与鉴定等。 • 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎 病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
肿瘤细胞的实训报告
一、实训目的本次实训旨在通过实验室操作，深入了解肿瘤细胞的基本特性、培养方法及其与正常细胞的区别，从而加深对肿瘤细胞生物学行为的认识，为后续的肿瘤研究奠定基础。
二、实训内容1. 实训材料与仪器- 材料：肿瘤细胞系（如HeLa细胞）、正常细胞系（如HEK293细胞）、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、细胞计数板、显微镜等。
- 仪器：细胞培养箱、超净工作台、细胞培养皿、移液器、离心机等。
2. 实训步骤- 细胞复苏：将冻存的肿瘤细胞和正常细胞分别加入适量DMEM培养基，37℃水浴箱中孵育至细胞恢复活性。
- 细胞传代：将复苏后的细胞以1:3的比例进行传代培养，每隔24小时更换一次培养基。
- 细胞计数：使用细胞计数板对肿瘤细胞和正常细胞进行计数，观察细胞生长情况。
- 细胞形态观察：使用显微镜观察肿瘤细胞和正常细胞的形态差异，如细胞大小、形状、核质比等。
- 细胞培养液检测：检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性，评估细胞毒性。
3. 实训结果- 肿瘤细胞和正常细胞均能在DMEM培养基中正常生长，且生长速度较快。
- 肿瘤细胞和正常细胞在显微镜下形态存在明显差异，肿瘤细胞体积较大，核质比较高，细胞形态不规则。
- LDH活性检测结果显示，肿瘤细胞培养液中的LDH活性显著高于正常细胞培养液，表明肿瘤细胞具有一定的细胞毒性。
三、实训分析与讨论1. 肿瘤细胞与正常细胞的区别- 肿瘤细胞具有无限增殖能力、侵袭性和转移性等特点，与正常细胞相比，在形态、生长速度和细胞毒性等方面存在显著差异。
- 本实训中，肿瘤细胞和正常细胞在形态、生长速度和细胞毒性等方面的差异进一步证实了这一观点。
2. 肿瘤细胞培养方法- 肿瘤细胞培养是肿瘤研究的重要手段，通过体外培养肿瘤细胞，可以研究肿瘤细胞的生物学特性、基因表达和信号通路等。
- 本实训中，我们采用了DMEM培养基和胎牛血清进行肿瘤细胞培养，取得了较好的效果。
3. 细胞毒性检测- 细胞毒性检测是评估细胞培养过程中细胞损伤程度的重要方法。
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正常和肿瘤组织细胞培养内容正常组织细胞培养上皮细胞的体外培养不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在血管内皮细胞的体外培养体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。
肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养上皮细胞的体外培养上皮细胞的基本特征：1.上皮组织的形态结构2.上皮细胞的极性 3 . 上皮细胞间的连接群体依赖性贴壁依赖性细胞-贴壁生长接触抑制生长基质体外培养的上皮组织细胞的生长生物学1. 形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征(1) 体外培养的特殊条件：✧防范微生物污染：根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。
要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。
培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。
✧生长基质的支持：皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。
在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。
特殊的培养基✧M199 RPMI1640 DMEM Fam F12（无血清培养基）：M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。
DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。
可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。
HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。
在实际培养时，将DMEM 与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。
✧去成纤维细胞：上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。
取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。
由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。
因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。
(2)体外培养上皮细胞的形态学变化体外培养上皮组织细胞的观察与检测1.一般形态学观察2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原、VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞的体外培养人脐静脉内皮细胞的培养1.主要材料：组织来源：婴儿脐带培养用液：M199+20%FCS、D-Hanks、0.1%胶原酶溶液2.培养方法：分离细胞培养法1 ). 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2 ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。
肾小管上皮细胞的培养1.原代培养：切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3→ 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段→0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数→接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养→每隔3~4天，更换培养液2.传代培养：3.培养结果：3d长出细胞5~7d 进入对数生长期7~9d 融合成单细胞层4.鉴定：抗角蛋白抗体染色（+）巨噬细胞的培养获取巨噬细胞的方法（一）肺泡巨噬细胞：支气管肺泡灌洗法、支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞：实验动物: 6周龄小鼠、培养液：10%FCS RPMI1640巨噬细胞的纯化1、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2、方法：用帖壁法纯化巨噬细胞，用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞淋巴细胞的培养各类淋巴细胞的主要特征T淋巴细胞：表面标志：1.表面受体：TCR、SRBC R、Fc R、MR、Measles viruse R2. 表面抗原：MHC、CDB淋巴细胞：1. 表面受体：BCR、FcR、CR、丝裂原受体、EBV R2. 表面抗原：MHC抗原、CD抗原（CD19、20、21、23、45）血淋巴细胞的分离（一）单个核细胞的分离密度梯度离心法：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
（二）纯淋巴细胞的制备 1. 玻璃黏附法 2. 羰基铁粉法（三）T、B淋巴细胞的分离 1. T细胞花环沉降法 2. 尼龙毛柱分离法血淋巴细胞的体外外培养应用：①淋巴细胞转化试验②B细胞产生Ig的检查③T细胞介导的细胞毒试验④NK细胞毒性试验⑤K细胞毒性试验⑥LAK细胞的制备⑦TIL细胞的制备⑧淋巴细胞的体外长期培养1. 用IL-2建立T淋巴细胞克隆2. 用EB病毒转化B淋巴细胞3. 用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株肿瘤细胞体外培养肿瘤细胞在体外的生长生物学特性㈠形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
㈡生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
㈢肿瘤细胞永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（四）浸润性（五）异质性（六）细胞遗传（七）肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。
一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。
体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。
肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
肿瘤组织细胞的原代培养取材：人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细针头穿刺、内窥镜活检等。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
关键：新鲜、无菌、及时、准确技术- 分离纯化分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分离纯化：反复贴壁去除成纤维细胞、自然淘汰去除正常细胞、利用特异抗原标志筛选法分亚型、流式细胞仪分选、克隆建株、高转移株的建立：反复接种技术-培养原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的需要细胞适当密度, 基本长满后传代, 前10代不稳定，注意适当调整培养条件。
技术- 鉴定与建株鉴定：组织来源、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况注意：不是每一肿瘤组织都能建株正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
成纤维细胞的排除：（肿瘤细胞培养中的关键）1、机械刮除法：2、反复贴壁法：3、消化排除法：4、胶原酶消化法：5、其它方法：体外培养肿瘤细胞生物学检测一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：1. 所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞；2. 均具有瘤种特异性；3. 阐明一般生物学性状。
测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。
形态观察：主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
细胞生长增殖：检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
细胞核型分析：检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
凝集试验：检测凝集力。
软琼脂培养：检测集落形成能力。
异体动物接种：向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。
其它：除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。
当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抑癌基因等的检测。
肿瘤细胞培养的应用一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究三、肿瘤细胞的体外分化实验四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验。