百合鳞茎蔗糖合成酶活性检测体系的建立

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兰州百合蔗糖代谢关键酶基因的克隆及原核表达

兰州百合蔗糖代谢关键酶基因的克隆及原核表达淀粉含量是决定百合种球质量的最关键因素。

蔗糖作为百合鳞茎中可溶性碳水化合物的主要形态,可在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)和可溶性酸性转化酶(Soluble Acid Invertase,SAI)调控下参与淀粉合成。

为探究百合SuSy和SAI的基因功能及其在蔗糖-淀粉代谢途径中的调节机理,本研究首先克隆得到兰州百合(Lilium davidiivar.unicolor)两个SuSy基因SuSy1和SuSy2的全长cDNA序列,并对其序列进行了生物信息学分析,将其过表达载体和RNAi载体通过农杆菌介导转化兰州百合。

而后构建了兰州百合SuSy及SAI基因的原核表达载体,并在适宜条件诱导融合蛋白表达,为进一步研究百合SuSy和SAI基因功能奠定了基础。

主要研究结果如下:1.SuSy1和SuSy2基因cDNA全长克隆及生物信息学分析以兰州百合扦插鳞片的总RNA为模板,采用RT-PCR及RACE法成功克隆获得SuSy 基因SuSy1和SuSy2全长cDNA序列,其长度分别为2,877 bp和2,865 bp.序列分析结果显示,基因SuSy1和SuSy2的同源性为85.73%,与同科植物同源性为65%-88%,分别编码807和810个氨基酸,其蛋白等电点均为6.10.结构域分析表明,SuSy1和SuSy2均编码含有188个氨基酸的保守结构域,其中包含一个糖基转移酶结构域,与糖基转化酶家族GT1有很高的相似性。

2.SuSy基因转化兰州百合研究利用农杆菌介导转化法,将带有兰州百合SuSy1和SuSy2基因的过表达载体和RNAi载体导入兰州百合。

为优化遗传转化过程,进行了兰州百合小鳞片对潮霉素(Hyg)和头孢霉素(Cef)浓度敏感试验,并对影响转化的各因素进行筛选。

获得最适条件为:20 mg L-1 Hyg为抗性芽筛选的适宜浓度;300 mg L-1 Cef为最适抑菌浓度;预培养2 d,农杆菌菌液培养至OD600为0.6,侵染鳞片20 min,重悬液和共培养基中加入终浓度为100 μM的乙酿丁香酮(AS),共培养3 d.最终获得了 3株带有基因SuSy2片段的RNAi载体的转基因抗性苗,目前正处于筛选阶段。

植物蔗糖酶活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4281

微量法植物蔗糖酶活性检测试剂盒说明书货号:UPLC-MS-4281规格:100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体2mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1支4℃保存试剂三液体4mL×1瓶常温保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：用时加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周；2、标准品：用时加入1mL蒸馏水充分溶解，制备10mg/mL葡萄糖标准溶液待用；用不完的试剂4℃保存一周。

产品说明：蔗糖酶（EC3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。

本试剂盒采用3,5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。

其原理是3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、标准品的制备：将标准品用蒸馏水稀释至2.5、2、1.5、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL（0mg/mL为空白管）。

3、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：试剂名称（μL）对照管测定管标准管试剂一151515蒸馏水15样本3030标准品30试剂二1515置于25℃准确水浴10min试剂三303030混匀，100℃水浴10min左右（盖紧，防止水分散失），冷却至室温蒸馏水210210210混匀，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中测定各管540nm吸光值，ΔA=A测定管-A对照管。

亚洲百合鳞茎发育和低温贮藏过程中蔗糖代谢机制研究

亚洲百合鳞茎发育和低温贮藏过程中蔗糖代谢机制研究蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是百合植株碳水化合物长距离运输至鳞茎的主要形态,系统研究蔗糖代谢机制对于明确百合鳞茎发育机理、生产优质种球具有重要意义。

本试验研究了不同缓冲液、pH值、时间及温度对百合鳞茎中SAI(可溶性酸性转化酶)活性的影响；研究了不同规格亚洲百合‘穿梭’鳞茎生长发育及低温贮藏过程的蔗糖代谢。

主要研究结果如下：首次建立了百合鳞茎SAI活性检测体系。

以百合外层鳞片为试材,研究了不同提取及反应缓冲液、pH值和反应时间、温度对百合鳞茎中SAI活性的影响。

结果表明,最适提取缓冲液为pH 8.0的Hepes-NaOH;最佳反应缓冲液为pH 4.8的HAc-K3PO4,最适反应温度为40℃,最适反应时间为30 min。

该结果与其他植物中的SAI活性检测方法有所不同,说明不同植物的SAI对外界因素的敏感度不同,也进一步表明了建立百合鳞茎SAI活性检测体系的重要性。

不同规格的百合鳞茎发育进程不同。

对鳞茎Ⅰ[m=(15±1)g]而言,鳞茎体积的膨大和重量的增加是从现蕾期开始的,植株现蕾期至花后20 d为其快速生长期；而鳞茎Ⅱ[m=(4.5-4-1)g]体积的膨大和重量的增加则是从出苗后20 d开始,其快速生长期为出苗后20 d至80 d且鳞茎Ⅱ迅速增长时期较鳞茎Ⅰ早。

在百合鳞茎生长发育过程中,鳞茎Ⅰ和鳞茎Ⅱ的淀粉、蔗糖含量变化趋势基本一致。

在发育前期(鳞茎Ⅰ栽种期至开花期,鳞茎Ⅱ栽种期至出苗后60 d)淀粉降解,蔗糖总体呈下降趋势；鳞茎发育后期(鳞茎Ⅰ开花期至枯萎期,鳞茎Ⅱ出苗后60 d至枯萎期)蔗糖上升,淀粉含量上升,说明淀粉与蔗糖代谢密切相关。

SAI和SuSy(蔗糖合成酶)是百合鳞茎蔗糖代谢关键酶。

在鳞茎发育期间,SuSy分解方向的活性远远小于合成方向的活性,说明SuSy主要起到分解蔗糖的作用。

SAI活性变化趋势与SuSy分解方向活性变化趋势基本一致,但其活性显著高于SuSy活性,一方面说明在百合鳞茎发育过程中SAI在蔗糖分解代谢上起主要作用,另外可以看出鳞茎中蔗糖代谢的分解酶类具有相同的变化趋势,协同作用参与蔗糖代谢过程。

蔗糖酶活力实验报告

一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。

二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。

2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。

3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。

蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法

蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号:BC4310规格:50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。

临用前加入2.5mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。

标准品：粉剂×1支，20mg果糖；4℃保存。

临用前加入1mL蒸馏水溶解，配成20mg/mL果糖溶液备用。

4℃保存一周。

产品简介：蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。

分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。

3、操作表：(在1.5mL离心管中操作)试剂名称（µL）对照管测定管标准管空白管样本2020--标准溶液--20-蒸馏水---20试剂一808080试剂二-80--混匀，30℃水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，防止水分散失）。

百合组培鳞茎一次性成球技术体系的构建

赵乙琏，席梦利．百合组培鳞茎一次性成球技术体系的构建［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（９）：１６２－１６５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．０９．０２２百合组培鳞茎一次性成球技术体系的构建赵乙琏，席梦利（南京林业大学林学院，江苏南京２１００３７）摘要：为简化百合组培操作流程，减少鳞茎培养基配方的种类，缩短种球繁育周期，满足企业及种球生产用户百合繁育的需求，以百合品种“幸运花束”为试材，通过对百合组培生长过程中的温度、光照等培养环境及激素、蔗糖、培养基等进行优化，并结合实际生产进行了筛选。

结果表明，２５℃条件下有利于百合鳞茎的发育，温度过高（≥３０℃）或过低（≤１５℃）都会严重抑制鳞茎的生长；而在光照培养过程中，全暗培养不仅有利于鳞茎的发育，而且节约能源，更能满足实际生产的需求；在激素组合诱导鳞片成芽及促进鳞茎发育的过程中，６－ＢＡ和ＮＡＡ依然是百合组培的最佳组合，但在鳞片诱导成芽及小鳞茎发育膨大的过程中，其激素组合浓度虽有差异，但通过对比研究表明６－ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ激素组合能够同时满足百合鳞片不定芽诱导和小鳞茎发育的需求；在蔗糖的添加中，６０ｇ／Ｌ的蔗糖浓度有利于百合鳞茎的生长发育，过高易造成鳞茎发育畸形，过低导致营养不足；１／２ＭＳ、ＭＳ等２种培养基对组培鳞茎根的发育差异性较小、生根状态都良好，且都显著好于１／４ＭＳ和２ＭＳ。

研究表明，ＭＳ＋６－ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ＋蔗糖６０ｇ／Ｌ，琼脂６ｇ／Ｌ，ｐＨ值５．８～６．０，在２５℃和全暗条件下培养４５ｄ的百合组培技术体系，可以满足百合组培规模化实际生产的需求，为百合种球繁育提供技术支撑。

关键词：百合；组培；一次性成球；规模化繁育中图分类号：Ｓ６４４．１０４＋．３文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０２３）０９－０１６２－０４收稿日期：２０２３－０２－０５基金项目：国家自然科学基金（编号：３１６７０６０３）。

百合鳞茎发育生物学研究进展_吕英民

生组织形成子鳞茎(bulblet)。百合鳞茎属于无皮鳞茎(nontunicated bulb), 鳞片沿鳞茎中轴呈覆瓦状叠生。外层鳞茎在一个生长季内不完全消耗。生长点每年形成新鳞茎 , 使球体逐年增大 , 外层鳞茎的鳞片
在新形成球体的外围 , 并依次营养消耗殆尽而衰亡[ 3] 。
百合(Lilium spp .)为百合科(Liliaceae)百合属所有植物的总称[ 1] , 是世界著名的园艺植物 , 有很高的观赏价值和经济价值。作为球根类植物 , 百合已经成为仅次于郁金香(Tulipa spp .)的第二大球根类产品 ;作为花卉类植物 , 百合是仅次于月季(Rosa spp .)、菊花(Chrysanthemum spp .)和郁金香的第四大花卉类产品 , 在国内外花卉产业中占有重要地位[ 2] 。本文对百合鳞茎发育生物学的研究进行综述 , 旨在为百合种球的国产化繁育生产提供理论参考。
百合鳞茎中作为细胞主要能量和碳架贮藏库的
造粉体中贮藏的淀粉粒 , 其数量和形态的变化与植物发育密切相关[ 23] 。利用I2--KI染色后在光学显微
镜下能够明显地观察到百合鳞片中的淀粉颗粒的显
微结构。近几年随着扫描电子显微镜在园艺植物研究中广泛应用 , 其也被用来进行百合鳞片淀粉粒的亚显微结构变化的研究。
1 百合鳞茎的生长发育特点
1.1 鳞茎的形态起源百合的地下贮藏器官从形态起源上属于鳞茎
(bulb), 其地下茎短缩形成鳞茎盘(basal plate), 鳞茎盘上着生肉质肥大的变态叶 , 成为鳞片(scales), 是
主要的营养贮存部位。成年鳞茎顶芽发育成地上
茎、叶后开花 , 而幼龄鳞茎的顶芽为营养芽 , 不能抽生地上茎只能形成基生叶。鳞茎盘上鳞片的腋内分

百合高效再生体系的建立和萜类合成酶基因的遗传转化的开题报告

百合高效再生体系的建立和萜类合成酶基因的遗传转化的开题报告题目：百合高效再生体系的建立和萜类合成酶基因的遗传转化研究背景：百合是一种广泛分布于世界各地的重要花卉之一，具有重要的经济价值和药用价值。

但是，现有的百合育种工作主要依靠传统杂交和选择性育种，表现出效率低、周期长、改良难度大等缺点。

因此，建立高效再生体系和基因转化技术是进行百合遗传育种的关键。

萜类化合物是百合中重要的活性成分，具有广泛的生物学活性和医药价值。

而萜类化合物的合成主要依靠萜类合成酶。

因此，利用遗传转化技术将萜类合成酶基因导入百合，可以实现百合中萜类化合物含量的有效提升。

研究内容：本研究旨在建立高效的百合再生体系，并探索在该体系中进行萜类合成酶基因遗传转化的可行性。

具体内容如下：1. 优化百合组织培养条件，建立高效的百合再生体系；2. 筛选合适的萜类合成酶基因，利用遗传转化技术将其导入百合中；3. 检测遗传转化百合的生长和发育情况，并分析其中萜类化合物的含量和种类变化。

研究意义：本研究通过建立高效的百合再生体系和遗传转化技术，可以实现百合的高效育种和萜类化合物含量的有效提高，具有重要的经济和环境意义。

计划进度：1月份：制备百合植株，优化组织培养条件；2月份：筛选合适的萜类合成酶基因，设计引物；3月份：利用遗传转化技术将萜类合成酶基因导入百合中；4-6月份：对遗传转化百合进行生长发育观察和萜类化合物含量检测；7-8月份：数据分析和研究总结。

预期成果：本研究预期可以建立高效的百合再生体系，并利用遗传转化技术将萜类合成酶基因导入百合中。

通过对遗传转化百合的生长、发育和萜类化合物含量的检测分析，可以为百合的遗传育种提供重要的技术支持。

分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。

蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。

对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。

【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。

该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。

蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。

实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。

酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。

蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。

蔗糖在泸定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的信号作用初探

蔗糖在泸定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的信号作用初探泸定百合CLilium sargentiae Wilson)拥有极高的园林观赏价值、经济价值、食用和药用价值。

然而传统的分球繁殖方法存在繁殖系数低、易感染病毒导致百合优良品种退化等问题。

在百合生产中,利用离体再生技术能加快百合的繁殖速度,提高繁殖率。

然而与自然状态下生长的幼苗相比,采用此方法生长的百合组培苗,在形态、生理等方面均有着较大的差异,移栽后组培苗生长能力更差,不易存活。

这些问题的存在已成为我国研究百合鲜切花及种球规模化生产的主要障碍。

为解决这个问题,我们可以在试管内结鳞茎并使其膨大,以此达到壮苗和提高移栽成活率的目的。

要达到该目的,不仅要研究试管鳞茎膨大的技术,更应该解释清楚膨大的机制是什么。

为此,本实验以泸定百合种球的鳞片为外植体诱导形成的无菌丛芽为材料,采用不同浓度的蔗糖(30、60、90、120 g/L)处理,为泸定百合试管鳞茎形成与膨大寻求最适的蔗糖浓度,为生产优质泸定百合种球提供科学技术支撑和实践指导。

并进一步通过不同的可溶性糖、渗透势处理、糖类似物及抑制剂处理,测定鳞茎发生和膨大的形态指标及其内源性糖与相关酶变化,研究蔗糖在泸定百合试管鳞茎形成及膨大过程中的特异性信号功能,以此回答其扮演的角色。

为此做了以下实验并得出相应研究结果：1、百合试管鳞茎膨大实验处理及其方案优选结果在整个蔗糖处理梯度中,鳞茎膨大出现随着浓度增加逐渐由低到高的单峰曲线,在60g/L时达到峰值,之后,随着蔗糖浓度继续提高,鳞茎的膨大效果开始减弱。

当蔗糖浓度达到90～120g/L时,膨大效果减弱至对照处理的水平。

所以本实验中,诱导百合鳞茎形成及膨大的最佳蔗糖浓度应为60 g/L。

2、渗透势在蔗糖处理过程中是否参与鳞茎膨大作用的实验结果为了研究外源蔗糖对试管鳞茎的形成及膨大作用是否与高浓度蔗糖所产生的渗透势有关,实验用与60g/L的蔗糖具有相同渗透势的甘露醇来处理材料。

蔗糖酶的提取及活力测定

蔗糖酶的提取及活力测定啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定原理1、细胞破壁:就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。

提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。

材料不同，破壁的方法也不同。

我们用的菌体(微生物)细胞破壁方法是:自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。

自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。

自溶法的缺点是时间较长。

，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理 2、3(1)DNS试剂+ D-葡萄糖氨基化合物(还原糖) (棕红色)(2)在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系(可用于比色测定)，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。

(3)该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。

试剂与器材恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。

3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯操作方法细胞破壁?抽提?两次乙醇分级?透析?装柱?洗涤?洗脱?收集酶活力峰?制冻干粉 ? 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力 ? 测定三种酶样品的蛋白浓度计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值关键步骤与注意事项乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样 ? 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向 ? 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。

酶活力测定及作图一定要准确。

蔗糖合成酶的测定方法

蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI2，20μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。

基于RNA-Seq的兰州百合鳞茎淀粉-蔗糖代谢关键酶SuSy和INV基因的挖掘

基于RNA-Seq的兰州百合鳞茎淀粉-蔗糖代谢关键酶SuSy和INV基因的挖掘淀粉是百合鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形式,而蔗糖是百合鳞茎中糖分运转的主要形式,淀粉-蔗糖代谢在百合生长发育中起重要作用。

蔗糖在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, SuSy)和转化酶(Invertase, INV)调控下参与淀粉的合成,而SuSy和INV基因家族都有多个成员组成,而在不同植物中不同成员功能也不尽相同。

因此,明确百合SuSy和INV的生理作用、基因功能成为进一步弄清淀粉合成途径及小鳞茎形成与发育机制的首要任务。

为阐明百合SuSy和INV基因调控蔗糖进入淀粉合成途径的机制,本研究在转录组水平筛选在百合鳞茎发育过程中差异表达的SuSy和INV基因,并构建其过表达与RNAi载体。

本研究的主要研究结果如下：1.采用改良CTAB、SDS法与TRIzol法,提取百合鳞茎中的总RNA。

结果表明,SDS法和CTAB法经改良后,均可从外、中、内层鳞片中提取出电泳条带清晰、28S条带亮度约为18S条带亮度2倍、A260/A280在1.8-2.2之间的总RNA; TRIzol法虽然快捷易操作,但不能有效去除多糖污染。

经RT-PCR检验,三种方法提取的RNA反转录后的cDNA,TRIzol法扩增后无条带出现,SDS法扩增得到的条带亮度较弱,而改良CTAB法能够扩增得到亮度很高的目的条带,并且CTAB法经验证可用于鳞茎不同部位(外层鳞片、中层鳞片、内层鳞片、顶芽和鳞茎盘)RNA的提取。

2.对百合小鳞茎形成与发育过程进行转录组测序,选取鳞片扦插0 d、15d(小鳞茎出现)和35 d(小鳞茎基本形成)三个阶段,最终得到52901个unigene,平均长度为630 nt,N50为926 nt。

对获得的unigene进行BLAST比对,共有37 385条unigene成功注释,占转录组数据的70.67%。

通过COG比对,有11 150条unigene成功比对,根据功能分为24类,涉及了大多数的生命活动,其中一般功能预测(general function prediction only) unigene数目最多。

蔗糖酶的测定原理

蔗糖酶的测定原理
蔗糖酶（Sucrase）是一种催化蔗糖（麦芽糖）水解为葡萄糖
和果糖的酶。

测定蔗糖酶的活性常用的方法是通过测定其催化蔗糖水解生成葡萄糖的速率来间接测定。

测定蔗糖酶活性的实验步骤如下：
1. 准备反应体系。

一般采用含有蔗糖酶的提取物或纯化酶溶液作为反应体系，同时加入含有蔗糖的缓冲液。

2. 加入底物。

将一定量的蔗糖溶液加入反应体系中，使反应开始。

3. 控制反应条件。

将反应体系保持在适当的温度和pH值下进
行反应，通常蔗糖酶的最适催化温度为37°C，最适pH为6.8。

4. 反应时间控制。

反应一定时间后，停止反应。

5. 停止反应。

通常通过加入一定体积的酸性溶液来停止反应，将剩余的蔗糖转化为葡萄糖和果糖。

6. 对产生的葡萄糖进行测定。

葡萄糖的测定可以采用多种方法，如酶促发色法、底物比色法等。

通过测定蔗糖酶催化蔗糖水解生成的葡萄糖的量，可以间接测定蔗糖酶的活性。

活性通常以每分钟生成的葡萄糖的微摩尔数来表示。

需要注意的是，在文中不能再出现和标题相同的文字，以免造成重复。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。

本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。

一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。

2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。

一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。

3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。

1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。

2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。

3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。

1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。

2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。

3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。

蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。

1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。

2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。

3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。

总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。

其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。

实验五泸定百合鳞茎的生根培养技术

泸定百合鳞茎的生根培养技术
一、实验目的
1．熟悉无菌接种技术，克服不良操作习惯；
2．掌握百合鳞茎的生根培养技术。

二、材料和用具
无菌的百合鳞茎、75%酒精、酒精灯、灭菌器、镊子、解剖刀、接种盘、支架、超净工作台2台等。

三、方法和步骤
1、配制百合鳞茎生根培养基（MS+NAA0.5mg/L+蔗糖6%+琼脂7g/L+活性炭1g/L），具体步骤请自行总结。

2、接种室的清洁和消毒（同前），请详写。

3、百合鳞茎生根培养:
①在无菌条件下，用无菌的镊子从培养瓶中取出已经增殖的百合鳞茎，将它们放在无菌的接种盘中。

②用无菌解剖刀把百合鳞茎叶片去掉且分割成若干个小鳞茎，并把已坏死的区域弃去。

③用无菌镊子将小块鳞茎放入新鲜的培养基上，每瓶培养基可以放3~5个，盖上瓶盖。

④将转接后的培养瓶置于培养室中黑暗培养，温度为25±2℃。

四、思考题
1、本实验培养基中的NAA、活性炭对百合生根的作用？
2、蔗糖浓度提高到6%的原因。