烟草亚细胞定位
亚细胞定位的原理和流程
亚细胞定位的原理和流程
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亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;
估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;
3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;
4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;
5、重复步骤4;
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;
使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;
用高压灭菌的超纯水稀释;
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;
烟草亚细胞定位
1. 100 ml农杆菌菌液接种于10 ml LB，加利福平，抗性标记，AS（100 mM）10 ul；
2. 28 ℃，200 rpm培养过夜，至OD600 = 1.0-1.2；
3. 4000 rpm，4℃，离心10 min集菌，用重悬液重悬菌体，OD600 = 1.0；
4. 室温暗培养2-3 h，注射烟草叶片；
5. 正常培养2-3 d，激光共聚焦观察荧光。
6. DAPI marker使用：50 ul DAPI浸润叶片，黑暗培养30-120 s，ddH2O冲洗3次，DAPI 通道观察。
7. 储存液配方：
500 mM MES：5.33 g溶于50 ml ddH2O
500 mM Mgcl2 6H2O: 5.0825 g溶于50 ml ddH2O 1 M AS: 0.196 g溶于1 ml DMSO
8. 工作液（50 ml体系）调PH=5.7：
1 ml 500 mM MES （终浓度10 mM）
+ 1ml 00 mM Mgcl2 6H2O （终浓度10 mM）
+ 7.5 ul 1 M AS，ddH2O（终浓度150 uM）
补齐50 ml
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理
利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插
入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。100 mM 乙酰丁香酮：
称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。25 mg/mL Rif (母液)：称取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20 mL，不需要过滤除菌，直接分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mM MgCl2：称取1.0165 g的氯化镁六水（BBI: A610328），用去离子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。100 mL浸染液：2 mL的500 mM MES + 0.15 mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl2，用去离子水溶解定容至100 mL即可。1 L的LB 培养基：5 g酵母提取物 + 10 g胰蛋白胨 + 10 g NaCl，相应的抗生素工作浓度为50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)
MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）
1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇
床20h至第四天早上；
2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床
培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；
4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，
室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；
5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析
所用试剂：
1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）
1M Na2PO4 11.54ml
1M NaH2PO4 8.46ml
Add ddH2O TO 200ml
2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)
0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml
10% SDS 2ml
0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml
Tritonx-100 200ul
β-巯基乙醇 200ul
add ddH2O TO 200ml
121℃灭菌室温保存
3、gus蛋白分析buffer
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位
亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构
烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术
亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。电子显微镜
技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展
亚细胞定位方法
亚细胞定位方法
随着分子生物学的发展，人们对于细胞内分子的定位也越来越感兴趣。亚细胞定位方法就是用来确定细胞内分子在细胞中的位置的一种方法。本文将介绍几种常用的亚细胞定位方法。
1. 免疫荧光染色法
免疫荧光染色法是一种常用的亚细胞定位方法。该方法利用特异性抗体与目标分子结合，然后再用荧光标记的二抗或直接荧光标记的一抗来检测目标分子的位置。这种方法可以用来确定细胞内蛋白质、核酸、糖等分子的位置。该方法的优点是速度快、灵敏度高，可以同时检测多种分子的位置。
2. 蛋白质标记法
蛋白质标记法是一种通过标记蛋白质来确定其位置的方法。该方法可以利用荧光染料、酶标记物或放射性同位素等标记蛋白质，然后用特异性抗体来检测标记的蛋白质的位置。该方法的优点是可以直接标记蛋白质，不需要额外的抗体，因此可以减少非特异性结合的问题。
3. 基因标记法
基因标记法是一种通过将目标分子的基因进行标记来确定其位
置的方法。该方法可以利用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等标记基因来标记目标分子，然后用荧光显微镜来观察目标分子的位置。该方法的优点是可以直接标记目标分子的基因，不需要额外的抗体，因此可以减少非特异性结合的问题。
4. 电子显微镜法
电子显微镜法是一种通过电子显微镜来观察细胞内分子位置的
方法。该方法可以利用金标记或碳标记的抗体来标记目标分子，然后用电子显微镜来观察目标分子的位置。该方法的优点是可以观察到分子的超微结构，但缺点是需要非常高的分辨率，因此需要专业的设备和操作技术。
5. 光学显微镜法
光学显微镜法是一种通过光学显微镜来观察细胞内分子位置的
亚细胞定位实验步骤
亚细胞定位实验步骤
亚细胞定位实验是一种用于确定蛋白质在细胞中特定位置的实验方法。以下是一般的亚细胞定位实验步骤的简要描述：
1. 细胞培养和准备：选择适当的细胞系，并在培养皿中将其培养到适当的密度。确保细胞处于健康状态并以适当的方式生长。
2. 蛋白标记：选择一种适当的方法来标记您感兴趣的蛋白质。常用的方法包括荧光标记、放射性标记或抗体标记。这将使您能够观察蛋白质在细胞中的分布情况。
3. 细胞固定：使用适当的固定剂 如甲醛或乙醛）处理细胞，以保持蛋白质的位置和结构不变。注意，不同的固定剂可能适用于不同类型的分析。
4. 渗透化：使用适当的渗透剂 如Triton X-100）处理固定的细胞，以使细胞膜通透，从而使抗体或其他探针更容易进入细胞内部。
5. 抗体染色：将与您标记的蛋白质特异性结合的抗体添加到细胞中，并允许其与目标蛋白质发生反应。这些抗体可以是一种特定的单克隆抗体或多克隆抗体。
6. 洗涤：通过洗涤细胞来去除未结合的抗体和其他非特异性结合物，以减少非特异性信号。
7. 显微镜观察：使用荧光显微镜或其他适当的显微镜技术观察标记的蛋白质在细胞内的位置。您可以使用相关的控制样品和参考标记来验证结果。
请注意，具体的实验步骤可能因所使用的方法和实验设计而有所不同。因此，在进行亚细胞定位实验之前，最好查阅相关文献并遵循特定方法的详细步骤和建议。
亚细胞定位实验操作步骤
亚细胞定位实验操作步骤
亚细胞定位
⼀、实验材料
玻⽚，镊⼦，75%酒精，细胞转染⽤物品，PBS，4%多聚甲醛，Trixon-X-100，铝箔，摇床，DAPI染⾊液，荧光封⽚液，指甲油，载玻⽚，激光扫描共聚焦显微镜（型号：ZEISS LSM 510 META），光盘
⼆、实验原理
亚细胞定位是指某种蛋⽩或表达产物在细胞内的具体存在部位，如胞核，胞浆内，细胞膜或某⼀特定细胞器上存在。通常是将⽬的蛋⽩与报告基因（如绿⾊荧光蛋⽩基因EGFP、红⾊荧光蛋⽩基因Dsred等）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从⽽致使⽬的蛋⽩在细胞内的定位。
DAPI，4，6-联脒-2-苯基吲哚，是⼀种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有⾼度的亲和⼒，与DNA结合后会发出强烈的荧光。
激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是⼀种⾼分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进⾏观察时，来⾃观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较⼤的⼲扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的⼀个点（焦点）进⾏成像，再通过计算机控制的⼀点⼀点的扫描形成标本的⼆维或者三维图象。在此过程中，来⾃焦点以外的光信号不会对图像形成⼲扰，从⽽⼤⼤提⾼了显微图象的清晰度和细节分辨能⼒。
三、操作程序与结果判定（结合⾃⼰的经验将可能遇到的问题及解决办法也列出）
1、细胞爬⽚的处理
细胞爬⽚可以买专门的爬⽚（⼀般直径14mm的⼩圆玻⽚正好适合24孔板的⼤⼩），在超净台中取出后⽤75%酒精浸
亚细胞定位结果解读
亚细胞定位结果解读
在生物学中，亚细胞定位是指确定一种特定蛋白质在细胞中的位置，它是一项重要的研究，可以帮助我们更深入了解细胞内的生化过程和运作机制，以及一些疾病的发生和发展过程。本文将解读亚细胞定位结果，并进行详细阐述。
一、亚细胞定位结果表示
亚细胞定位结果一般表示某种特定蛋白质在细胞中的位置，通常分为以下几种：
1. 细胞膜：蛋白质位于细胞表面或细胞内膜上
2. 细胞质：蛋白质在细胞质中或与细胞器或基质相关联
3. 细胞核：蛋白质在细胞核内或与其相关
4. 线粒体：蛋白质在线粒体内或与之相关
5. 内质网：蛋白质在内质网内或与其相关
6. 高尔基体：蛋白质在高尔基体内或与之相关
7. 核糖体：蛋白质在核糖体中或与之相关
二、亚细胞定位结果解读
亚细胞定位结果不仅可以反映蛋白质在细胞中的位置，还能提示该蛋
白质的功能和作用。例如，若一个蛋白质的亚细胞定位结果为线粒体，那么它很可能是一个线粒体酶，能够参与线粒体内的能量代谢。如果
一个蛋白质的亚细胞定位结果为细胞质，那么该蛋白质很可能是参与
代谢反应运作的酶。
通过亚细胞定位结果，我们还可以了解到蛋白质在细胞内的分布情况
和数量，帮助我们更好的了解细胞内的生物学过程和疾病机制。
此外，亚细胞定位结果也能透露蛋白质与其它分子相互作用的相关信息。例如，某个蛋白质被定位在内质网上，说明该蛋白质可能与内质
网相关蛋白质有相互作用，或者该蛋白质参与内质网的功能。
三、亚细胞定位结果的意义
亚细胞定位结果为我们深入研究细胞学，了解蛋白质在细胞中的作用
以及生化代谢过程提供了一个非常重要的手段。通过蛋白质在细胞中
亚细胞定位名词解释
亚细胞定位名词解释
亚细胞定位是指生物体内的细胞结构或分子在细胞内的特定位置或亚细胞结构中的定位。通过研究亚细胞定位可以揭示细胞内各种结构和分子的功能以及它们在细胞内的相互作用。
在细胞内，许多蛋白质、核酸和其他分子都需要在特定的亚细胞结构中完成其功能。例如，细胞核是储存和传递遗传信息的重要结构，细胞质是许多细胞代谢活动的主要场所，线粒体是细胞内能量产生的中心，高尔基体是蛋白质合成和分泌的重要场所，溶酶体是细胞内废物降解的主要地点等等。这些亚细胞结构的定位对于维持细胞正常功能和活动至关重要。
亚细胞定位的研究方法多种多样，包括荧光染色、免疫组化、蛋白质标记等。通过这些方法，科学家可以观察到特定蛋白质、核酸或其他分子在细胞内的定位，并通过定量分析和图像处理来获取定量的信息。同时，生物学家还可以利用细胞生物学、分子生物学和生物化学等技术手段来研究亚细胞定位的机制和功能。这些研究对于揭示细胞内生物过程的调控机制以及疾病的发生和发展具有重要意义。
总之，亚细胞定位研究是生物学领域中重要的一部分，对于我们了解细胞内的结构和功能以及相关疾病的发生机制具有重要意义。随着技术的不断进步，我们相信亚细胞定位研究将为生物学研究带来更多的突破和发展。
亚细胞定位步骤
亚细胞定位步骤
亚细胞定位的步骤主要包括以下几步：
1. 细胞准备：获取所需的细胞样本，可以是动物或植物细胞，也可以是微生物细胞。
2. 荧光标记：将目标蛋白质与荧光染料（如绿色荧光蛋白，GFP）进行标记，以便在显微镜下观察。
3. 细胞转染：将标记的目标蛋白质导入细胞中，可以使用不同的方法，如显微注射、电穿孔或脂质体转染等。
4. 显微观察：在荧光显微镜下观察细胞，寻找目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。通常需要使用不同倍率的物镜来观察不同大小的细胞和亚细胞结构。
5. 图像采集和分析：使用图像采集系统记录观察到的图像，并使用相关软件进行分析，以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
6. 验证实验：为了确保结果的可靠性，需要进行一系列验证实验，如免疫共沉淀或Western blot等，以确认目标蛋白质与亚细胞结构的相互作用。
通过以上步骤，可以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置，进一步了解其在细胞中的功能和作用。
亚细胞定位原理和流程
亚细胞定位原理和流程
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[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法
Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium
一、原理（Principle）
烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.
亚细胞定位的方法
亚细胞定位的方法
亚细胞定位的方法指的是通过实验手段或计算模拟等方法，确定生物分子在细胞内的具体位置。常用的亚细胞定位方法包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术、基因工程技术等。其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位方法之一，通过将荧光标记的分子引入细胞内，观察其在不同亚细胞结构中的分布情况，从而确定其精确位置。另外，基因工程技术也逐渐成为一种重要的亚细胞定位方法，通过将目标蛋白的编码序列与荧光标记基因融合，使得蛋白的表达同时伴随着荧光标记，从而实现对蛋白在细胞内位置的追踪和定位。
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亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法
烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。研究人员
通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究
或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。首先，
需要构建一个携带外源基因的转化载体。这个载体通常包含一个启动子、
外源基因和终止子。启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其
他功能分子的序列。构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将
其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。其中，农
杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。经过一段时间的培养，将
转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的
定位。常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。荧光蛋白标记
技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧
光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。抗体标记技术则是将外
源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外
源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
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1. 100 ml农杆菌菌液接种于10 ml LB，加利福平，抗性标记，AS（100 mM）10 ul；
2. 28 ℃，200 rpm培养过夜，至OD600 = 1.0-1.2；
3. 4000 rpm，4℃，离心10 min集菌，用重悬液重悬菌体，OD600 = 1.0；
4. 室温暗培养2-3 h，注射烟草叶片；
5. 正常培养2-3 d，激光共聚焦观察荧光。
6. DAPI marker使用：50 ul DAPI浸润叶片，黑暗培养30-120 s，ddH2O冲洗3次，DAPI 通道观察。
7. 储存液配方：
500 mM MES：5.33 g溶于50 ml ddH2O
500 mM Mgcl2 6H2O: 5.0825 g溶于50 ml ddH2O 1 M AS: 0.196 g溶于1 ml DMSO
8. 工作液（50 ml体系）调PH=5.7：
1 ml 500 mM MES （终浓度10 mM）
+ 1ml 00 mM Mgcl2 6H2O （终浓度10 mM）
+ 7.5 ul 1 M AS，ddH2O（终浓度150 uM）
补齐50 ml