亚细胞定位之烟草转化方法
烟草亚细胞定位
1. 100 ml农杆菌菌液接种于10 ml LB，加利福平，抗性标记，AS（100 mM）10 ul；
2. 28 ℃，200 rpm培养过夜，至OD600 = 1.0-1.2；
3. 4000 rpm，4℃，离心10 min集菌，用重悬液重悬菌体，OD600 = 1.0；
4. 室温暗培养2-3 h，注射烟草叶片；
5. 正常培养2-3 d，激光共聚焦观察荧光。
6. DAPI marker使用：50 ul DAPI浸润叶片，黑暗培养30-120 s，ddH2O冲洗3次，DAPI 通道观察。
7. 储存液配方：
500 mM MES：5.33 g溶于50 ml ddH2O
500 mM Mgcl2 6H2O: 5.0825 g溶于50 ml ddH2O 1 M AS: 0.196 g溶于1 ml DMSO
8. 工作液（50 ml体系）调PH=5.7：
1 ml 500 mM MES （终浓度10 mM）
+ 1ml 00 mM Mgcl2 6H2O （终浓度10 mM）
+ 7.5 ul 1 M AS，ddH2O（终浓度150 uM）
补齐50 ml
转基因烟草方法
2．材料与方法
2.1实验材料
植物材料：K326烟草种子
药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；
MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0
预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml
分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.
生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g
MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基
2.3实验方法
2.3.1浸染菌液制备
将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;
估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;
3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;
4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;
5、重复步骤4;
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;
使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;
用高压灭菌的超纯水稀释;
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理
利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插
入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。100 mM 乙酰丁香酮：
称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。25 mg/mL Rif (母液)：称取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20 mL，不需要过滤除菌，直接分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mM MgCl2：称取1.0165 g的氯化镁六水（BBI: A610328），用去离子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。100 mL浸染液：2 mL的500 mM MES + 0.15 mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl2，用去离子水溶解定容至100 mL即可。1 L的LB 培养基：5 g酵母提取物 + 10 g胰蛋白胨 + 10 g NaCl，相应的抗生素工作浓度为50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)
MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）
1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇
床20h至第四天早上；
2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床
培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；
4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，
室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；
5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析
所用试剂：
1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）
1M Na2PO4 11.54ml
1M NaH2PO4 8.46ml
Add ddH2O TO 200ml
2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)
0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml
10% SDS 2ml
0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml
Tritonx-100 200ul
β-巯基乙醇 200ul
add ddH2O TO 200ml
121℃灭菌室温保存
3、gus蛋白分析buffer
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi
烟草转化体系
将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）
将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位
亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构
烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术
亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。电子显微镜
技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展
植物亚细胞定位方法
植物亚细胞定位方法
植物细胞是一种包含许多亚细胞结构的复杂生命体，这些亚细胞结构与细胞功能密切相关。植物亚细胞定位方法是指通过特定实验技术来确定植物细胞中各种亚细胞结构所在的位置。本文将介绍常用的植物亚细胞定位方法。
1.细胞质基质标记法
细胞质基质标记法是利用荧光染料或标记蛋白特异性与细胞质基质结合，从而可视化显示细胞质基质及其分布情况。这种方法常用的标记染料有荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（Luciferases）等。研究人员可以通过遗传工程技术将这些标记蛋白导入植物细胞，从而观察其在不同亚细胞结构中的分布情况。例如，可以将GFP融合到内质网膜蛋白上，通过显微镜观察GFP的荧光信号来确定内质网的位置。
2.细胞器特异性抗体标记法
细胞器特异性抗体标记法是一种常用的植物亚细胞定位方法。研究人员可以使用特异性抗体针对目标细胞器进行免疫染色，然后通过荧光显微镜观察抗体与细胞器的结合情况。这种方法需要将植物细胞固定、脱水和包埋，然后用切片机切取细胞切片，并进行抗体染色。常用的抗体标记方法有间接免疫荧光染色法和免疫金标记法。
3.免疫电镜技术
免疫电镜技术是一种常用的高分辨率植物亚细胞定位方法，它结合了免疫染色和电镜技术。研究人员可以利用特异性抗体标记细胞器蛋白，然后进行电镜检测。识别标记蛋白的方法主要有两种，一种是直接标记，即利用带有金颗粒的抗体直接与目标蛋白结合，另一种是间接标记，即利用
第一抗体与目标蛋白结合后，再用带有金颗粒的第二抗体识别第一抗体。免疫电镜技术可以提供亚细胞级别的定位信息，但操作复杂，对仪器设备要求高。
烟草转化方法及各类培养基配方
表1 烟草转化中使用培养基
Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco
培养基
Culture medium 成分
ingredients
pH值
pH
继代培养基
Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）
Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）
Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）
Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）
Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素； Note: cef: cefotaxime；kan: Kanamycin
MS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25ml
MS 微量：5ml MS 微量：2.5ml
MS 铁盐：5ml MS 铁盐：5ml
MS 有机：5ml MS 有机：5ml
糖：30g 糖：30g
琼脂：7.5g 琼脂：7.5g
6-BA母液浓度：0.5mg/ml
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤 (2)
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
整理人：早熟组赵凤利
一、准备试剂：
1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；
2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃
2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃
3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。
二、实验步骤：
1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；
3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；
4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；
注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
一、实验目的
蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。
二、实验原理
烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌
T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到
p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。
三、实验试剂和仪器
1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)
2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)
3. MES / KOH(pH=5.6)
4. 氯化镁
5. 乙酰丁香酮
6. 相应抗性的LB培养基
四、实验步骤
1、准备激活缓冲液
配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。
烟草转化
2.11.1 播种
烟草种子用70% 乙醇灭菌30 s，去掉乙醇，无菌水清洗一遍，再用2.5% 次氯酸钠表面消毒7 min，无菌水清洗3-4遍，然后播种于MS基本培养基中。16 h 光( 50 μmol m-2 s-1)/8 h暗环境下25ºC生长，取4-5叶期左右大小的无菌苗叶片转化。
2.11.2农杆菌的活化和制备
（1）用接种环蘸取-80ºC冰箱内保存的含有精氨酸脱羧酶基因的农杆菌涂抹在含50mg/ml Km 的LB平板上划线，放到28ºC的光照生化培养箱中暗培养1-2d；（2）当长出菌落后，用接种环挑取单菌落在含有相同浓度抗生素浓度的LB培养基上划线，放入生化培养箱中28ºC暗培养；
（3）2-3d后，将培养基中长出的菌落用镊子刮入不含抗生素的液体MS培养基中，28ºC 200r/min 振荡培养1-2 h；
（4）用分光光度计测定菌液的OD600值，并用液体MS稀释，直到OD600=0.4~0.6之间进行侵染。
2.11.3 烟草共培养
取苗龄为60d左右烟草的无菌、健壮的、去主脉并用镊子切成5×5cm的叶盘，将其浸入到已经培养好的农杆菌菌液中进行侵染9-12min左右。然后倒掉菌液，将叶片放到灭菌过的滤纸上吸干菌液，将吸干的叶盘背面朝下，放在放有滤纸的共培养基中进行暗培养3d。
2.11.4选择筛选培养
共培养结束后，先用含有400mg/ml头孢霉素的灭菌水清洗叶盘2-3次，用灭菌的滤纸吸干叶盘表面的水分，将叶盘放在筛选培养基中进行筛选培养，一般每周继代一次。
2.11.5生根培养
在筛选培养基中筛选2-3周以后，叶盘的周围会分化出抗性芽，当抗性芽长到2-3cm大时，用镊子切下放在生根培养基中进行生根培养。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法
烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。研究人员
通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究
或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。首先，
需要构建一个携带外源基因的转化载体。这个载体通常包含一个启动子、
外源基因和终止子。启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其
他功能分子的序列。构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将
其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。其中，农
杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。经过一段时间的培养，将
转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的
定位。常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。荧光蛋白标记
技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧
光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。抗体标记技术则是将外
源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外
源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验
试验方法
一、实验材料及药品
pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等
二、载体构建及农杆菌转化
烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备
1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株
2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）
3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）
4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：
0.5M MES 200ul 0.976g
1M MgCl2100ul 2.03g
100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）
灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）
四、操作步骤
1、农杆菌转化
2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）
3、确定不同农杆菌所加菌液的量：
计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600
OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
大豆GmMADS4_基因克隆、亚细胞定位及功能分析
薛迎斌, 宋佳, 李枭艺, 等. 大豆GmMADS4基因克隆、亚细胞定位及功能分析[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 420-429.
XUE Yingbin, SONG Jia, LI Xiaoyi, et al. Cloning, subcellular localization and functional analysis of GmMADS4 in soybean[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 420-429.
大豆GmMADS4基因克隆、亚细胞定位及功能分析
薛迎斌1,2† ，宋 佳2,3†，李枭艺1，李小豪2,3，陈经烨2,3，伍萍珍3，朱胜男4，刘 颖2,3
(1 广东海洋大学 化学与环境学院, 广东 湛江 524088； 2 国家耐盐碱水稻技术创新中心 华南中心, 广东 湛江 524088；
3 广东海洋大学 滨海农业学院, 广东 湛江 524088；
4 岭南师范学院 生命科学与技术学院, 广东 湛江 524048)摘要: 【目的】挖掘大豆Glycine max MADS 转录因子家族成员GmMADS4基因信息，分析其结构及功能。【方法】通过生物信息学分析，对GmMADS4基因进行基因结构、编码蛋白信息、保守结构域、系统进化树以及互作蛋白预测等分析。利用烟草叶片瞬时转化法分析亚细胞定位，通过RT-qPCR 进行组织部位及响应缺素的表达模式分析，利用下胚轴复合植株转化法分析超量表达GmMADS4对转基因毛根生长的影响。【结果】GmMADS4基因开放阅读框长732 bp ，编码蛋白相对分子质量为28 000；保守结构域含有MADS-box 和K-box ，属于II 型MADS 家族成员，与拟南芥的AtAP3相似性较高；GmMADS4在大豆多个部位均有表达，且在花和种子中的表达量较高；缺氮和缺磷处理均显著增加GmMADS4在叶和根部的表达量；GmMADS4主要定位在细胞核，超量表达GmMADS4显著增加转基因毛根的可溶性磷含量。【结论】GmMADS4属于大豆II 型MADS 家族成员，具有核定位功能，可能在大豆种子和花的发育过程中发挥作用，并参与大豆根部缺磷响应及磷稳态调节。
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化
作者：李晓君王绍梅谢艳兰和敏
来源：《江苏农业科学》2014年第09期
摘要：植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作，将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105，获得工程菌，制备不同浓度的农杆菌浸染液，用注射法对烟草叶片进行转化，荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP 的表达情况。结果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之间均具有较高的转化效率，注射后第4天至第6天为较佳观察时间。
关键词：植物瞬时表达系统；渗透法；转化；农杆菌渗透注射；烟草；绿色荧光蛋白（GFP）
中图分类号： S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0045-03
收稿日期：2013-11-25
基金项目：临沧师范高等专科学校高层次人才引进科研启动项目（编号：LXJ2012）；临沧师范高等专科学校校级课题（编号：LCSZL2013001 ）
。
作者简介：李晓君（1985—），女，云南临沧人，博士，讲师，主要从事植物生物技术与种质创新研究。E-mail：***************。植物瞬时表达系统常用于基因产物的亚细胞定位、蛋白间互作、转录因子与启动子之间的互作、启动子分析等方面的研究[1-2]。植物瞬时表达系统中外源基因的导入方法有植物病毒介导法、PEG法、电击法、基因枪法和农杆菌渗透法[2]。农杆菌渗透法是一种比较简便的方法，通过将植物表达载体导入农杆菌，用真空法或注射法将农杆菌导入植物细胞，使得农杆菌Ti质粒上的T-DNA区整合到植物基因组中，T-DNA 区的目标基因培养几天后即可得到表达[3]。较其他方法而言，农杆菌渗透法具有转化效率高、基因表达在完整活体内进行、可携带较大片段的目的基因等优点[2]。原生质体是观察基因瞬时表达情况的优选材料，传统的原生质体转化方法首先要制备高浓度、高质量的质粒，经过从植物活体材料中分离纯化原生质体，在PEG的介导下将质粒DNA导入原生质体，进行原生质体培养后再检测目标基因的表达情况[4]。用该方法转化后的原生质体敏感、易破裂，使得阳性细胞检出率低，不利于观察。以农杆菌渗透法转化材料提取原生质体，可缩短从原生质体提取到观察的时间，原生质体完整，镜检阳性率高。本研究在Sparke等的研究基础[5]上简化了农杆菌注射液的制备和注射过程，通过荧光显微镜观察注射区域下表皮和原生质体中绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，检测不同注射浓度下和注射后不同时间的转化效率，总结出一种高效简易的农杆菌渗透注射转化烟草的方法。
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本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时
8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 5.7 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。