亚细胞定位之烟草转化方法
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)030【摘要】[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析.[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况.[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP 融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达.[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据.【总页数】4页(P11957-11960)【作者】李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【作者单位】牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析 [J], 张浩宇;樊俊苗;王婷;杜方2.烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析 [J], 刘继恺;高永峰;吴婵娟;张林;陈彩霞3.马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 卢瑶; 胡金雪; 金鑫; 陈越; 陈勤; 卢海彬4.薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达 [J], 龚林涛;苏秀娟;尹松松;孙明辉;闫博文;阿迪莱·阿布都热依木;陈全家5.枳两个GRAS基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 李阿英;刘洪;李晓颖;郭磊;宋长年因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。
它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。
烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。
本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。
其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。
质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。
细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。
线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。
叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。
高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。
核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。
微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。
目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。
其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。
它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。
电子显微镜技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。
蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展烟草作为一种常见的植物，其亚细胞定位研究也有着广泛的应用和深入的研究。
近年来，烟草亚细胞定位研究主要集中在以下几个方面：1.烟草亚细胞蛋白质定位烟草中有大量的蛋白质参与细胞的生长和发育过程。
通过荧光蛋白标记技术和基因工程技术，可以对这些蛋白质进行定位和操作。
研究表明，烟草细胞质内的微管蛋白可以定位在微管上，参与细胞的形态维持和运动。
亚细胞定位的实验报告
一、实验背景亚细胞定位是指某种生物大分子物质或脂类在细胞内存在的具体位置。
了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理具有重要意义。
本实验旨在利用荧光蛋白原位鉴定法，观察目标蛋白在细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）烟草种子；（2）农杆菌（GV3101、EHA105、LB4404等）；（3）构建好的载体质粒；（4）亚细胞定位培养基；（5）10ml YEB液体培养基；（6）10mM MgCl2悬浮液；（7）1ml注射器；（8）激光共聚焦显微镜。
2. 实验仪器：（1）电子显微镜；（2）PCR仪；（3）电泳仪；（4）凝胶成像系统；（5）激光共聚焦显微镜。
三、实验方法1. 烟草培养：播种烟草种子，12h光照培养，培养一个月后用于实验。
2. 农杆菌培养：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌，30℃培养2天。
3. 悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h。
4. 收集菌体：4000rpm/min，离心4min，去上清。
5. 重悬：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右。
6. 注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
7. 培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，即可观察。
8. 观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
四、实验结果与分析1. 叶绿体荧光信号：叶绿体荧光信号激发波长为640nm，发射波长为675nm。
2. GFP信号：绿色荧光蛋白GFP，激发光波长为488nm，发射光波长为510nm。
根据实验结果，可以观察到目标蛋白在烟草叶片细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
五、实验结论通过本实验，我们成功利用荧光蛋白原位鉴定法，观察了目标蛋白在细胞内的具体位置，实现了对其亚细胞定位的研究。
亚细胞定位步骤
亚细胞定位步骤
亚细胞定位的步骤主要包括以下几步：
1. 细胞准备：获取所需的细胞样本，可以是动物或植物细胞，也可以是微生物细胞。
2. 荧光标记：将目标蛋白质与荧光染料（如绿色荧光蛋白，GFP）进行标记，以便在显微镜下观察。
3. 细胞转染：将标记的目标蛋白质导入细胞中，可以使用不同的方法，如显微注射、电穿孔或脂质体转染等。
4. 显微观察：在荧光显微镜下观察细胞，寻找目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
通常需要使用不同倍率的物镜来观察不同大小的细胞和亚细胞结构。
5. 图像采集和分析：使用图像采集系统记录观察到的图像，并使用相关软件进行分析，以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
6. 验证实验：为了确保结果的可靠性，需要进行一系列验证实验，如免疫共沉淀或Western blot等，以确认目标蛋白质与亚细胞结构的相互作用。
通过以上步骤，可以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置，进一步了解其在细胞中的功能和作用。
亚细胞定位实验报告(3篇)
第1篇实验目的：本研究旨在通过亚细胞定位技术，确定目标蛋白质在细胞内的具体分布位置，为进一步研究该蛋白质的生物学功能提供实验依据。
实验材料：1. 目标蛋白质表达质粒2. 表达载体（如pEGFP-N1）3. 农杆菌（如GV3101）4. 烟草植株5. 激光共聚焦显微镜6. 其他实验试剂和仪器实验方法：1. 构建表达载体：将目标蛋白质基因与表达载体（如pEGFP-N1）连接，构建融合表达质粒。
2. 农杆菌转化：将构建好的融合表达质粒电转化农杆菌，获得转化子。
3. 农杆菌培养：将转化子接种于YEB液体培养基中，在170rpm/min的条件下培养1小时。
4. 农杆菌悬浮：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，悬浮农杆菌。
5. 收集菌体： 4000rpm/min，离心4分钟，去除上清。
6. 重悬菌体：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.6左右。
7. 注射烟草：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
8. 培养烟草：将注射完成的烟草植株弱光培养2天。
9. 观察与拍照：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
实验结果：通过激光共聚焦显微镜观察，发现融合表达质粒中的绿色荧光蛋白（GFP）信号在烟草叶片中呈现明显的细胞内分布。
根据GFP信号的位置，可以初步判断目标蛋白质在细胞内的分布情况。
结果分析：1. 细胞核定位：若GFP信号主要分布在细胞核区域，则表明目标蛋白质定位于细胞核。
2. 细胞质定位：若GFP信号主要分布在细胞质区域，则表明目标蛋白质定位于细胞质。
3. 细胞膜定位：若GFP信号主要分布在细胞膜区域，则表明目标蛋白质定位于细胞膜。
根据实验结果，可以初步判断目标蛋白质在烟草细胞中的定位情况，为进一步研究其生物学功能提供实验依据。
讨论：1. 亚细胞定位实验是研究蛋白质生物学功能的重要手段之一。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位烟草是一种广泛栽培的经济作物，也是一种重要的研究材料。
在过去的几十年中，人们对烟草的生物学特性进行了广泛的研究，其中包括烟草细胞的亚细胞定位。
烟草细胞的亚细胞定位是指确定细胞内特定分子的位置和功能的过程。
通过这种方式，我们可以更好地理解烟草细胞的生物学特性，进而为研究其他生物提供有益的参考。
烟草细胞的结构在研究烟草细胞的亚细胞定位之前，我们需要先了解烟草细胞的基本结构。
烟草细胞是一种真核细胞，其结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等。
其中，细胞膜是细胞的外层保护层，细胞质是细胞内部的液体环境，细胞核是细胞内的遗传物质和控制中心，线粒体是细胞内的能量中心，内质网是细胞内的蛋白质合成和质膜合成中心，高尔基体是细胞内的物质分泌中心，溶酶体则是细胞内的垃圾处理中心。
这些结构之间相互作用，共同维持烟草细胞的正常生理功能。
烟草细胞的亚细胞定位技术烟草细胞的亚细胞定位技术是通过染色、免疫共沉淀、免疫荧光等方法来确定细胞内特定分子的位置和功能。
其中，染色技术是最早被使用的技术之一，通过染色剂将细胞内不同的结构染色，从而确定它们的位置和功能。
例如，用荧光染料DAPI染色可以清晰地观察到烟草细胞核的位置和形态。
免疫共沉淀技术是一种通过抗体识别特定蛋白质并将其与其他相关蛋白质共同沉淀下来的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质之间的相互作用关系，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫共沉淀技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
免疫荧光技术是一种通过抗体与荧光染料结合的方式来定位特定蛋白质的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质在细胞内的位置和运动方式，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫荧光技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
烟草细胞的亚细胞定位研究进展在过去的几十年中，人们对烟草细胞的亚细胞定位进行了广泛的研究。
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化作者：李晓君王绍梅谢艳兰和敏来源：《江苏农业科学》2014年第09期摘要：植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作，将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105，获得工程菌，制备不同浓度的农杆菌浸染液，用注射法对烟草叶片进行转化，荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP 的表达情况。
结果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之间均具有较高的转化效率，注射后第4天至第6天为较佳观察时间。
关键词：植物瞬时表达系统；渗透法；转化；农杆菌渗透注射；烟草；绿色荧光蛋白（GFP）中图分类号： S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0045-03收稿日期：2013-11-25基金项目：临沧师范高等专科学校高层次人才引进科研启动项目（编号：LXJ2012）；临沧师范高等专科学校校级课题（编号：LCSZL2013001 ）。
作者简介：李晓君（1985—），女，云南临沧人，博士，讲师，主要从事植物生物技术与种质创新研究。
E-mail：***************。
植物瞬时表达系统常用于基因产物的亚细胞定位、蛋白间互作、转录因子与启动子之间的互作、启动子分析等方面的研究[1-2]。
植物瞬时表达系统中外源基因的导入方法有植物病毒介导法、PEG法、电击法、基因枪法和农杆菌渗透法[2]。
农杆菌渗透法是一种比较简便的方法，通过将植物表达载体导入农杆菌，用真空法或注射法将农杆菌导入植物细胞，使得农杆菌Ti质粒上的T-DNA区整合到植物基因组中，T-DNA 区的目标基因培养几天后即可得到表达[3]。
较其他方法而言，农杆菌渗透法具有转化效率高、基因表达在完整活体内进行、可携带较大片段的目的基因等优点[2]。
原生质体是观察基因瞬时表达情况的优选材料，传统的原生质体转化方法首先要制备高浓度、高质量的质粒，经过从植物活体材料中分离纯化原生质体，在PEG的介导下将质粒DNA导入原生质体，进行原生质体培养后再检测目标基因的表达情况[4]。
烟草基因相互作用实验步骤
瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。
1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。
注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。
需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。
2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。
挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。
3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。
乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。
注射缓冲液需要现配现用。
4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。
注射缓冲液重悬。
5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。
利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。
注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。
六种病毒外壳蛋白亚细胞定位及对烟草抗性影响的比较分析
六种病毒外壳蛋白亚细胞定位及对烟草抗性影响的比较分析植物病毒病是仅次于真菌病害的第二大病害,严重危害重要的经济作物和粮食作物,并且危害程度逐年加重。
随着基因工程的迅速发展,抗病育种成为防治病毒病的有效手段之一。
其中应用最为广泛的是利用病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因转化植物,使其获得抗性,这与病毒外壳蛋白基因组结构、功能及在细胞中的定位有一定的联系。
不同病毒的CP在病毒的侵染过程中所起的作用不同,其在植物细胞中的亚细胞定位和引起植物产生的抗性也应该不同。
因此,本文比较分析了本实验室目前所有的共计六种病毒的CP亚细胞定位及瞬时表达对植物的影响,以期为更详细的理解不同病毒CP在病毒致病中的作用及不同病毒CP在诱导植物产生抗性中的作用提供更多的依据。
六种病毒分别是烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)。
本文根据Genebank中五种病毒外壳蛋白全长设计含酶切位点的引物,以RNA 为模板,PCR扩增外壳蛋白全长,插入载体中间pSAT1-EGFP-C1或pSAT6-EGFP-N1上,利用PCR筛选及酶切鉴定得到中间重组载体质粒,再用PI-PSP I或ASC I单酶切,插入到最终植物表达载体pPZP-RCS1,同样利用PCR筛选及酶切鉴定得到含CP的重组克隆,用冻融法将重组克隆(其中TMV CP的植物表达载体已在本实验室前期完成)导入根癌农杆菌EHA105,菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入根癌农杆菌EHA105中。
用根癌农杆菌介导的瞬时表达观察它们在本氏烟、云烟中的亚细胞定位,进行初步的比较分析。
烟草叶肉原生质体分离与转化
烟草叶肉原生质体分离与转化植物原生质体的分离工作起始于上世纪60年代，英国植物病理学家Cooking首次用纤维素酶分离得到植物原生质体，在经过了前人的不断探索和技术创新之后，植物原生质体的分离,培养及转化技术已日渐成熟。
本实验以烟草为材料，进行原生质体分离转化方面的研究。
一、烟草叶肉原生质体的分离1、材料：温室中的烟草与进行无菌培养的烟草均可。
取材时需按以下标准进行：应取生长状态好的较大叶片，表现为颜色墨绿、充分伸展、叶片较为饱满。
若以无菌苗作为材料应注意去掉变黄及生长状态不好的叶片。
（因为无菌苗的叶片常常很小，需要数片叶片才能分离出足够量的原生质体）2、材料预处理。
（此步也可省略，但有关文献中指出预处理可使制得的原生质体活力增强，易于转化）一般将从温室中采来得叶片（通常较大叶片一片足够）在自来水中冲洗10min左右，（动作要轻微，防止弄伤叶片），然后用保鲜膜包好，置于4℃ 6-12小时。
（一般过夜）3、消毒。
将预处理过的叶片用剪刀小心剪成10mm2大小，置于盛有0.1%升汞的大培养皿中，浸泡8-10min。
再用无菌水冲洗4-5遍。
（放入叶片前，可在0.1%的升汞中加入几滴Tween20，用枪吹打混匀）4、酶解。
将消毒过的叶片用镊子夹取平放于灭菌的滤纸上，若使用无菌苗叶片，需用拇指与中指按住两端，右手拿单面保险刀片从叶片中间部位横切，将叶片切成0.5-1mm左右的细丝，然后立即用镊子将切好的叶片转入预先培好的酶液。
若使用温室苗的叶片，则需将消毒过的叶片平放于灭菌滤纸上，背面朝上，用左手固定住叶片，右手用尖头镊子小心撕去下表皮，后迅速转进酶液，背面朝下。
(注：切成细丝或撕去下表皮的叶片应马上转移入酶液)5、酶解处理。
不同搭配的酶液的最适温度与酶解时间各异。
实验发现烟草叶肉原生质体分离的最适酶液搭配为：cellulaseR-10. Macerozyme R-10.最适温度与酶解时间：26℃避光3-4h。
烟草NtARF11基因克隆及功能初步分析
烟草NtARF11基因克隆及功能初步分析目录一、内容简述 (3)1. 研究背景与意义 (3)2. 研究目的与任务 (4)3. 研究方法与技术路线 (5)二、材料与方法 (6)1. 实验材料 (7)烟草品种选择 (8)核苷酸提取与纯化 (9)逆转录与PCR扩增 (10)基因克隆与载体构建 (10)转化与鉴定 (12)蛋白质表达与纯化 (13)2. 实验设备与试剂 (14)仪器设备 (15)试剂耗材 (16)3. 实验设计与步骤 (18)核苷酸序列分析 (19)ARF11基因克隆 (20)转化与筛选 (21)蛋白质功能分析 (22)三、结果与分析 (23)1. NtARF11基因的克隆与序列分析 (24)基因序列比对 (24)编码区与非编码区分析 (25)特异性分析 (26)2. 转化植株的表型观察 (27)形态学观察 (28)生理生化指标测定 (29)3. 蛋白质功能初步分析 (31)抗蛋白酶解性检测 (32)寡聚糖酶活性测定 (32)调控植物生长发育的能力分析 (33)四、讨论与展望 (35)1. 结果讨论 (36)NtARF11基因在烟草中的功能推测 (37)与其他ARF蛋白功能的比较 (38)烟草中ARF11基因的表达模式分析 (39)2. 研究展望 (40)深入研究NtARF11基因的功能机制 (41)利用基因工程技术改良烟草 (42)探索NtARF11基因在其他植物中的功能与应用 (43)一、内容简述本研究旨在克隆烟草NtARF11基因，并对其功能进行初步分析。
烟草NtARF11基因编码一个蛋白质，其在植物生长发育过程中具有重要的调控作用。
通过对NtARF11基因的克隆和功能研究，可以深入了解烟草生长发育的分子机制，为烟草育种和抗病性改良提供理论依据。
我们通过测序技术从烟草中筛选出NtARF11基因的cDNA序列，并将其与已知的蛋白质序列进行比对，确认该基因为NtARF11。
我们通过生物信息学方法对NtARF11基因进行了进一步的功能分析，发现其在烟草生长发育过程中具有重要的调控作用。
亚细胞定位
请老师及同学批评指正！
实验步骤
1.3 转化原生质体/侵染
备注：注射前一天将烟草浇水， 使气孔张开以利于注射。
实验步骤
1.4 激光共聚焦显微镜观察
实验步骤
原生质体与烟草叶片侵染区别
叶绿体
0 定位图示例 3
定位图示例
不同细胞器中的定位图
胞质
液泡膜
内质网
核
线粒体
过氧物酶体
高尔基体
细胞膜
Wu et al.2016 A set of GFP-based organelle marker lines combines with DsRed-based gateway vectors for subcellular localization study in rice (Oryza sativa L.)
亚细胞定位技术 （Subcellular Localization）
目录
CONTENTS
实验背景
实验步骤
定位图示例
0 实验背景 1
实验背景
亚细胞定位背景
确定某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置，从而为研究基因 的作用机制提供方向。
成熟蛋白质必须在特定的亚细 胞器里面才能发挥稳定的生物 学功能。细胞内部可以进一步 划分为不同的细胞区域或细胞 器，即亚细胞。
实验背景
亚细胞定位方法
抗原-抗体特异性结合
目的基因和Leabharlann 光蛋白基因构建在同一表达载体上实验背景
亚细胞定位原理（融合蛋白表达法）
0 实验步骤 2
实验步骤
1.1载体构建
1.2实验材料准备
Gene GFP
1.引物设计； 2.利用高保真酶KOD进行cDNA全长片段的克隆； 3.PCR产物回收； 4.双酶切反应，胶回收； 5.纯化的产物连接载体； 6.转化大肠杆菌及阳性克隆的筛选； 7.质粒的小量提取与鉴定； 8.农杆菌的转化。
烟草瞬时表达步骤电子版
烟草瞬时表达步骤电子版亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h （0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中?预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀4℃，13000prm离心15min.吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
《转基因烟草方法》
《转基因烟草方法》2.材料与方法2.1实验材料植物材料：k326烟草种子药品：ms大量元素，ms微量元素，ms铁盐，吲哚乙酸（iaa），6-苄氨基腺嘌呤（6-ba），烟肌醇（b1b6），蔗糖，琼脂，头孢霉素（cef），羧苄青霉素（carb），卡那霉素（kn）、庆大霉素、利福平等；ms培养基（1l）：大量元素（20x）50ml、微量元素（100x）10ml、fe2+（100x）10ml、蔗糖30g、琼脂8g，ph值约为6.0预培养基（1l）。
大量元素（20x）50ml、微量元素（100x）10ml、fe2+（100x）10ml、6-ba（1000x）2ml、b1b6（200x）5ml、甘氨酸（1000x）1ml、琼脂8g，ph值约为6.0。
高温灭菌后加iaa（0.2mg/l）1ml 分化培养基（1l）：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基（1l）：1/2ms、iaa2mg/l、蔗糖30g/l、琼脂5.8g/l，ph=5.8lb液体培养基（1l）：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、naci10gms0培养基：为不加琼脂的只含大量元素ms培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体lb培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.l-1卡那霉素、50mg.l-1链霉素及50mg.l-1利福平的液体lb培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1。
50的比例，稀释到含50mg.l-1卡那霉素的新鲜液体lb培养基中，继续培养至od600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，1xxrpm离心1分钟，弃。
加入100ml的ms0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2，置于悬菌液中（mso悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
烟草HD-ZIP转录因子HD20的克隆及纤维分化功能的研究
烟草HD-ZIP转录因子HD20的克隆及纤维分化功能的研究高洁;佟硕秋;钟杰;贡献;吴拥军【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)006【摘要】旨在揭示烟草HD20在植物纤维分化中的作用.基于前期烟草基因组数据库设计特异性引物,通过RT-PCR克隆获得基因cDNA序列,将其命名为HD20,NCBI登录号为KC339003.该基因全长762 bp,编码253个氨基酸,亚细胞定位于细胞核,其编码的HD-ZIP蛋白由2个不同的结构域组成,包括N末端含有60个氨基酸的HD结构域和其后28个氨基酸组成的ZIP基序.构建植物表达载体,通过农杆菌蘸花法遗传转化拟南芥,经筛选获得阳性转基因植株,其石蜡切片显示,茎部木质部较对照发达.HD20对烟草及拟南芥的纤维分化具有调控作用.【总页数】6页(P84-89)【作者】高洁;佟硕秋;钟杰;贡献;吴拥军【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵阳 550025【正文语种】中文【相关文献】1.烟草DREB转录因子新基因的克隆与功能分析 [J], 耿芳;郭伟华;郭玉双;孟现美;张放2.烟草转录因子基因NtGRAS-R1的克隆与功能分析 [J], 李富欣;许芳芳;李素敏;肖万福;孙艳敏;刘卫群;郭红祥3.烟草HD-ZIPⅣ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析 [J], 王姗姗;杨军;林福呈;孟祥宇;余涵;张剑锋;王中4.紫花苜蓿盐诱导HD-Zip类转录因子MsHB2的克隆及功能分析 [J], 李明娜;龙瑞才;杨青川;沈益新;康俊梅;张铁军5.玉米HD-Zip转录因子基因ZmHOX32的克隆及功能探究 [J], 张新; 曹丽茹; 张军; 魏良明; 张前进; 魏昕; 王振华; 鲁晓民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时
8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 5.7 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。