生物技术制药_及_名词解释 2

第一章绪论

生物技术药物分类1.重组DNA技术制造的多肽、蛋白类药物2.基因药物，包括基因治疗药、基因疫苗、反义药物、核酶3.来自动、植物、微生物的天然药物4.合成与半合成的生物药物

按照医学用途分类：1.治疗药物，治疗疾病是生物药物的主要功能。2.诊断药物，具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。3.预防药物，对于许多传染性疾病来说，预防比治疗更重要。

生物技术药物的特性

1.分子结构复杂

2.具有种属特异性

3.治疗针对性强，疗效高

4.稳定性差

5.基因稳定性

6.免疫原性

7.体内t1/2短

8.受体效应

9.多效性和网络性效应10.检验的特殊性

2.高投入

3.长周期

4.高风险

5.高收益

1.基因工程制药：（1）基因工程药物品种的开发；（2）基因工程疫苗；（3）

（5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型；（6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物；（7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用；（8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。

现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面：①基因操作技术日新月异，不断完善。②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。⑤转基因植物和动物取得重大突破⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向，⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。⑨蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。⑩信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中，形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。

第二章基因工程制药

基因工程技术生产药物的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以提供足够数量的生理活性物质以供研究。（3）可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。（4）可以通过基因工程和蛋白质工程对内源生理活性物质进行改造。（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性

基因工程制药基本环节上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞

下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装

目的基因的常用制备方法

化学合成法：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成基因的限制有：⒈不能合成太长的基因⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，⒊费用高。

RT—PCR法（反转录PCR法）：mRNA经逆转录合成cDNA第一条链，不需合成第二条链，在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异合成目的cDNA链，用于重组,克隆.

逆转录法：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。⒈ mRNA的纯化⒉ cDNA第一链的合成⒊ cDNA第二链的合成⒋ cDNA的克隆⒌将重组体导入宿主细胞：⒍ cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法

重组DNA导入宿主细胞

导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法

重组子的筛选与鉴定

遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal

培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法

✦核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法

✦限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆

✦D NA序列测定法

✦目的基因表达产物测定法

大肠杆菌中的基因表达

载体：是基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。

基因工程载体分为：克隆载体,转录载体,表达载体;DNA(克隆载体）→DNA(转录载体）→RNA→蛋白质→（表达载体）

原核细胞的基因组特点：①染色质为环状双股DNA分子②具有操纵子结构③结构基因多为单拷贝④特定区域分布特异DNA顺序，因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段

基因克隆载体1）定义：基因克隆载体是一类能够承载外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。2）目前经常使用的载体，有质粒和病毒两类。各种不同的载体，尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异，但是作为载体，它们应该具备一些共同的特性。

基因工程克隆载体的特点：①具有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗药基因④拷贝数高⑤生物安全性好

质粒的分类⒈按复制型式①严紧型②松弛型⒉按基因转移性①传递性质粒②非传递性质粒⒊按遗传性状产物分类:①抗生素抗性②限制酶、修饰酶系统

⒈真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑪载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。⑫应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。⑬应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑭应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑮应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑯所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。

⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⑪外源基因的拷贝数：外源基因是克隆到载体上的，因此载体在宿主菌种的拷贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。⑫外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑬表达产物的稳定性：①组建融合基因，产生融合蛋白；②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中；③采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；④采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。⑭细胞代谢负荷：⑮工程菌的培养条件。

外源基因在大肠杆菌中的表达方式

✦胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白

✦分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达

大肠杆菌酵母哺乳动物

产物多肽、蛋白质或融合蛋

白质

多肽、蛋白质或糖基

化蛋白质

完整糖基化蛋白

产生部位菌体内菌体内或分泌出细胞分泌出细胞

培养方式容易，部分可获得高产容易，可高产较难成本高，可高产提纯一般菌体内稍复杂简单产物活性对原核较好，真核稍差真核的接近天然几乎可为天然产物

潜在危险性不大不大需注意有致癌因素

酵母表达体系的影响因素：外源基因的结构，表达形式及信号肽的选择：启动子，转化子的拷贝数，诱导条件，外源蛋白的降解。

菌体的生长与能量的关系（乙酸调节）提高pH。降低温度，分批培养中选择不同的碳源，连续培养