流式细胞术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞术名词解释
流式细胞术名词解释
流式细胞术（flow cytometry）是一种高速、高效的单细胞分析
技术，广泛应用于生命科学中。
该技术利用激光束和多重探针对单个
细胞进行多参数分析，可以快速获取细胞表面、内部分子以及细胞特
性的详细信息。
在流式细胞术中，细胞被分散在流动液体中，通过细胞分流器进
入流式细胞仪的测量单元。
激光器对细胞进行激发，然后由散射仪和
荧光仪收集并分析激发光信号。
散射光可以提供关于细胞大小和形状
的信息，而荧光探针可以用于检测细胞表面抗原、内部蛋白、DNA含量、RNA含量等多种细胞特征。
流式细胞术的优势在于可以快速高效地处理大量的样本，适用于
单细胞和多种细胞的分析。
同时，该技术还可以对细胞进行有效的分
选和分离，具有极高的精确性和灵敏度。
因此，流式细胞术在生物学、医学、生物工程等领域中得到了广泛的应用。
例如，在癌症诊断中，
通过流式细胞术可以区分不同类型的癌细胞，进一步指导治疗方案的
设计和实施。
总之，流式细胞术已经成为现代生命科学中不可或缺的工具之一。
其在高通量、高精度分析和细胞分选中的优势，可以为研究细胞和疾
病提供重要的科学基础。
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
基本信息中文名称:流式细胞术外文名称:Flow Cytometry, FCM优点:速度快、精度高、准确性好等作用快速测定细胞或细胞器生物学性质特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量最高速度:每秒钟3万个细胞4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
细胞鉴定 流式和ngs
细胞鉴定流式和ngs
细胞鉴定是对细胞的种类、性质和功能进行确定的过程。
流式细胞术和二代测序（NGS）是两种常用的细胞鉴定技术，它们各有优缺点。
流式细胞术是一种基于细胞表面标志物的快速、高通量的细胞分析技术。
它通过将细胞悬液逐个通过激光束，检测细胞表面标志物的荧光信号，从而实现对细胞的分类和鉴定。
流式细胞术具有快速、灵敏、多参数、高通量等优点，可用于检测细胞表面标志物、细胞周期、细胞凋亡等。
然而，流式细胞术只能检测已知的标志物，对于未知的标志物则无法进行鉴定。
二代测序（NGS）则是一种高通量的基因测序技术，它可以对细胞中的所有基因进行测序，从而实现对细胞的全面鉴定。
NGS 可以检测细胞中的基因突变、基因表达、表观遗传学等信息，从而深入了解细胞的生物学特征和功能。
然而，NGS 技术相对复杂，需要专业的实验技能和生物信息学分析能力，同时成本也较高。
综上所述，流式细胞术和二代测序（NGS）各有优缺点，在细胞鉴定中应根据具体需求选择合适的技术。
如果需要快速、高通量地检测已知的标志物，流式细胞术是一个不错的选择；如果需要全面了解细胞的基因信息，NGS 则更为适合。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
fcs格式流式细胞
fcs格式流式细胞
FCS文件标准创建于1984年，用于标准化流式细胞术列表模式数据文件。
所有流式细胞术数据文件都有“.fcs”文件扩展名，以被任何的流式细胞术分析程序读取。
目前，FCS文件标准是FCS 。
流式细胞术是一种可对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析的技术。
流式细胞仪利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，这些信号由光电二极管或光电倍增管等检测器读取。
这些信号被转换成电子信号，标准化格式 (.fcs) 数据文件输出。
特定的细胞亚群可以基于它们的荧光或光散射特性进行分析并进行分离纯化。
在流式细胞术中可使用多种荧光试剂。
这些包括荧光偶联抗体、DNA结合染料、活力染料、离子指示剂染料和荧光蛋白。
以上信息仅供参考，如果您还想了解更多信息，建议查阅相关书籍或咨询专业人士。
流式细胞术概念
流式细胞术概念
流式细胞术是一种先进的生物技术，能够快速、准确地分析大量细胞，提供细胞的多功能性信息。
它是一种在液流中进行的细胞分析技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面的蛋白质、细胞内部的活性物质等进行检测，从而实现对细胞性质的精确分析。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮在液体中，然后通过特异性的抗体标记目标细胞，再通过激光束照射被标记的细胞，测量产生的荧光信号或其他物理化学信号，从而对细胞进行定量和分选。
在流式细胞术中，细胞以单个形式流过激光束，这样每个细胞都会被激光束照射并产生荧光信号，这些信号被光电倍增管收集并转换为电信号，最后通过计算机进行数据处理和分析。
流式细胞术具有以下优点：
1. 高速度：流式细胞术可以同时处理大量细胞，每秒钟可以分析上千个细胞。
2. 高灵敏度：它可以检测微量的蛋白质、DNA等物质，灵敏度非常高。
3. 多功能性：流式细胞术可以同时检测多个细胞特性，可以进行多参数定量分析和分选。
4. 广泛适用性：它可以应用于各种类型的细胞，包括淋
巴细胞、肿瘤细胞、干细胞等。
流式细胞术在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用。
在医学方面，它可以用于检测和分选肿瘤细胞、淋巴细胞等，为临床诊断和治疗提供帮助。
在生物学方面，它可以用于研究细胞的发育和分化过程，探索生命奥秘。
在环境科学方面，它可以用于检测空气和水中的微生物污染，评估环境质量。
总之，流式细胞术是一种非常强大的生物技术，可以对大量细胞进行快速、准确的分析，为科学研究提供重要的数据支持。
流式细胞术
1.流式细胞术分析的基本原理
前向散射与侧向散射是 细胞的固有属性，暂称 为物理属性。
荧光信号是人们通过不 同手段将荧光物质结合 在细胞上，是人为属性， 暂称为化学属性。
R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：粒细胞 R4：红细胞裂解碎片和少量血小板
将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FSC或SSC为横坐 标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其 FSC或SSC相应的位置，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光 信号强或有。
阴性细胞对照（用已知不表达某种抗原的细胞进行平行
实验，通常用于确定抗体的特异性）
阳性对照
即用已知表达某种抗原的细胞（阳性 细胞）细胞进行平行实验，通常用于检 测抗体是否有问题或确定实验方法的稳 定性、准确性。
空白对照
即不进行标记的细胞。有些细胞内物质 会同样被激发而产生自发荧光。空白对照 的主要作用用于确定待测标本的基础荧光 域值或检测染色方法是否成功。
膜结合钙离子，细胞表面电荷等，这对确定细胞的性质及 其功能重要。
细胞质：各种细胞成分，包括蛋白质、RNA、各种细胞器中
的特殊成分、各种抗原、基因编码蛋白、细胞因子等。
细胞核：DNA、RNA、蛋白质等
分选功能
可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离 出来，再进行分析或培养。优点：分选纯度高（可达 99%），分选回收率高，可分选活细胞。
脉冲宽度（FLn-W）反映荧光的分布，常用来区分双连体细胞。
4.光谱重叠与荧光补偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的 信号加以扣除的技术称“荧光补偿”
5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间
对于流式样本，由于细胞的自发荧光、荧光抗体会与待测标本中的细胞 发生少量非特异性结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号，这部 分信号称为基础荧光域值。
流式细胞术
流式细胞术
流式细胞术是现代生物学中一项重要的技术。
它是一种针对单个细胞进行分析的高通量技术，可以分析细胞表面和胞内分子的表达、功能状态和亚细胞定位等信息，广泛应用于免疫学、细胞学、肿瘤学等领域，尤其在流行病学、诊断学和临床治疗中发挥着重要作用。
流式细胞术的基本原理是：将单个细胞通过高压速度流动进入光束中，利用各种光学、光电、电子学以及计算机技术，对其进行精密的测量和分类。
细胞进入光束时，会被加上一个荧光标记，从而使光线反射出细胞的特征，这些特征被探测器捕捉到之后，被转换成电信号，通过计算机处理分析，最终得到细胞的信息。
流式细胞术的优点在于它具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高自动化和较低的样品消耗等优点。
同时，流式细胞术也存在一些局限性，如需要专业的应用和分析软件、标记试剂的选择和设计、实验条件的控制等问题。
流式细胞术常常被用于单个细胞表型和功能的分析。
针对免疫学，它可以用于细胞免疫表型的分析，了解细胞表面受体、淋巴亚群体等重要的表型信息。
同时，流式细胞术也可以用于肿瘤学的研究，检测瘤细胞表面受体和异质性表达。
在临床诊断中，流式细胞术可以用于血液学和肿瘤学等领域中单个细胞的感染或肿瘤状态的分析，为诊断和治疗提供重要的信息。
总的来说，流式细胞术是一种应用广泛、非常重要的技术。
无
论是在研究领域中分析细胞的性质，还是在临床领域中进行个性化治疗，流式细胞术都扮演着至关重要的角色。
我们相信，在不久的将来，随着流式细胞术技术的更进一步完善和发展，该技术的应用范围将会更加广泛，为生命科学领域的发展注入更多的动力。
细胞生物学技术：7流式细胞术---原理、操作及应用
（三）散射光的作用
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是从70年代逐渐兴起的一种利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
它是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技分析检测技术，具有检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本等优点，已被广泛应用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中都发挥着重要的作用。
一、流式细胞术的基本原理待测样品（如细胞、染色体、微生物或人工合成微球等）经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过鞘液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，依次通过流动室检测区域。
以不同波长的激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的生物颗粒在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。
前向小角度的光散射信号（forward scatter, FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter, SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况；激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。
这些光信号被转化成电信号，传送到计算机，经A/D 转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。
细胞的分选则是指根据所测定的各个参数将指定的细胞亚群从细胞主群体中分离出来的一种方式。
具体的操作是在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动能使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下发生偏转，落入各自的收集容器中，而不予充电的液滴则落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞术(贝克曼)
通过将流式细胞术与基因组学、蛋白质组学等技术相结合， 未来有望实现个体化医疗的精准诊断和治疗。这将为患者提 供更加定制化的治疗方案，提高治疗效果和生存率。
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血液学研究
造血干细胞研究
利用流式细胞术研究造血干细胞的自我更新、分化等 过程，有助于血液疾病的诊断和治疗。
白血病分型与诊断
通过流式细胞术对白血病细胞进行分型和鉴别，有助 于白血病的诊断和治疗。
红细胞与血小板检测
利用流式细胞术检测红细胞和血小板的数量和质量， 有助于贫血和出血性疾病的诊断和治疗。
04
流式细胞术的优缺点
优点
快速
灵敏度高
流式细胞术可以在短时间内处理大量样本 ，提高了检测效率。
流式细胞术能够检测到低浓度的细胞，灵 敏度较高。
多参数分析
自动化程度高
流式细胞术可以对细胞进行多参数分析， 包括细胞表面抗原、细胞内蛋白质和DNA 等。
流式细胞术通常采用自动化仪器进行操作 ，减少了人为误差和操作时间。
发展历程
20世纪50年代
流式细胞术的原理被提出，并开始应用于细 胞计数和大小测量。
20世纪80年代
计算机技术的引入，实现了自动化数据分析。
20世纪70年代
荧光染料和荧光显微镜的引入，使得多参数 检测成为可能。
21世纪
高通量测序技术的发展，推动了流式细胞术 在基因组学和蛋白质组学领域的应用。
应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表 面标志物、细胞因子 等，研究免疫细胞的 分化、发育和功能。
血液学研究
用于检测血液细胞， 诊断血液疾病，如白 血病、淋巴瘤等。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的 表面标志物、基因突 变等，为肿瘤的诊断 和治疗提供依据。
流式细胞术
• 凋亡： • 由于凋亡细胞核酸内切酶活化， DNA 降 解 ， 细 胞 DNA 减 少 ， 因 而 可 在 G0/G1 峰前出现一个亚二倍体峰，也就 是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药 物研究和某些因素对细胞的损伤机理的 研究。
2 细胞表型分析：
• 细胞表型的分析得益于单克隆抗体的 产生及发展，现在CD系统已有247种之多。 细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用 流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析 出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性 细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一 般用直标法，也可用间标法。荧光探针多 为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、 APC等。
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
• 肿瘤诊断： • DNA 异倍体的出现是癌变的一个重 要标志，细胞的增殖能力的大小也可反 映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和 DNA 倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监 测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性 肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。
应用 血小板无力症诊断： CD41/CD61缺失或异常 巨大血小板综合征诊断： CD42a/CD42b缺失 免疫性血小板减少性紫癜诊断： PAIgG 血栓前状态与血栓性疾病诊断： 血小板活化异常
4 红细胞疾病诊断
网织红细胞计数与应用 • 网织红细胞是未完全成熟的红细胞，胞浆中 仍残留有不同含量的 RNA 。 RNA 含量越高，网织 红细胞越幼稚，反之，则接近于成熟红细胞。网 织红细胞是反映骨髓红系造血的指针。用荧光染 料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活体网织红 细胞中 RNA 染色，用 488nm 激光激发后发射绿色 荧光， FCM 分析其荧光强度的大小可测量网织红 细胞的数量和RNA含量。主要用于贫血筛查。 • 睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断 • 红细胞表面CD59缺失
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术广泛用于分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积。
主要用于测定荧光标记的抗体检测蛋白产生的荧光强度，或结合了特定细胞分子的配体，如碘化丙啶与DNA的结合。
其染色过程包括从细胞培养物或组织样品制备单细胞悬液，然后将获得的细胞培养在包含未标记或荧光标记抗体的试管或多孔板中，再用流式细胞仪分析。
流式细胞仪主要有两型：临床型（又称：小型机、台式机）和综合型（又称：大型机、分析型）。
主要技术指标1.流式细胞仪的分析速度一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3.前向角散射（FSC）光检测灵敏度前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。
4.流式细胞仪的分辨率通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5.流式细胞仪的分选速度一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
流式细胞仪：射流图1 流式细胞仪概览注：鞘液使细胞悬液聚拢，依次通过激光束，一次仅一个细胞。
检测器会检测前向和侧向散射光，以及染色细胞发射的荧光。
当细胞悬液通过流式细胞仪时，从小喷嘴中流出的细胞悬液在鞘液的流体力学作用下向中心聚拢。
形成的细流可使细胞依次通过激光束，一次仅一个细胞（图1）。
当细胞通过激光束时，检测器会检测细胞或颗粒的散射光。
前面的检测器检测前向散射光（FS），放置在侧面的多个检测器检测侧向散射光（SS），荧光检测器则检测被染色的细胞或颗粒发射的荧光。
流式细胞仪：前向和侧向散射光的测定细胞或颗粒通过光束并使光散射，这些散射光将以FS或SS的形式检测。
FS与细胞的大小相关，SS则与细胞颗粒度成比例。
细胞靶向 流式
细胞靶向流式
流式细胞术是一种高效的单细胞分析/分选技术，可以用于分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积。
流式细胞术的基本原理是使用荧光探针标记待检测的生物样本，通过流式细胞仪检测生物样品上的被标记的荧光信号来获取相应的生物学信息。
流式细胞术在细胞生物学、分子生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、遗传学、药学、植物学、海洋生物学、临床医学等众多领域有广泛应用。
关于流式细胞术在细胞靶向方面的应用，流式细胞术可以用于检测和分离特定的细胞群。
例如，在免疫疗法中，流式细胞术可以用于分离和鉴定特定的免疫细胞亚群，这些亚群可以作为靶标用于开发新的免疫疗法。
此外，流式细胞术还可以用于监测免疫细胞的活性和功能，以评估免疫疗法的疗效和安全性。
总之，流式细胞术是一种强大的分析工具，可以用于研究细胞的特性和功能，以及开发新的治疗方法。
在细胞靶向方面，流式细胞术的应用正在不断扩展和深化，为生物学和医学的研究提供更多的可能性。
流式细胞术(FlowCytometry,FCM)描述
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
Linear Fluorescence in FL2
10000
1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
10
cell and bead neg
1
10 2
103
104
10
5
Molecules PE per Bead
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
流式细胞术 （Flow Cytometry,FCM)
作者：笛风
ห้องสมุดไป่ตู้ 基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参 数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC
一.流式细胞术概述
一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
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（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的 PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双 阴性细胞。 （4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。
（5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上， 先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐 一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异 性荧光对每个荧光的补偿。
4.光谱重叠与荧光补偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的 信号加以扣除的技术称“荧光补偿”
5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间
对于流式样本，由于细胞的自发荧光、荧光抗体会与待测标本中的细胞 发生少量非特异性结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号，这部 分信号称为基础荧光域值。 在流式标本检测过程中，通常需要通过调节电压将阴性细胞的基础荧光 域值臵于95%或99%的臵信区间内，作为阴性对照可信区间设定。
信号收集与光电转换系统
主要由光电转换器件、放大器和信号处理电路组成
光电转换器件主要功能是将光信号转换成电流信号。
由光电二极管和光电倍增管（PMT）来执行。
放大器分两类：线性放大和对数放大。
信号处理系统的主要功能是将电信号转变成脉冲信
号、数字信号最终传送给计算机系统进行处理。
计算机与分析系统
SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关
散射光的测定
利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。
2.Coulter效应与电子体积
Coulter效应原理：微 小粒子并不导电，但通过 充满电解液的小孔时可产
生电阻变化，细胞体积越
大，电阻的改变越大。可 将电阻变化记录为电位变
二、流式细胞术的重要术语
1.前向散射与侧向散射 2. Coulter效应与电子体积 3.荧光信号及其面积与宽度 4.光谱重叠与荧光补偿 5.细胞基础荧光域值与阴性对照臵信区间
1.前向散射与侧向散射
前向散射光 (forward scatter)： FSC信号的强弱与细胞的大小相关 侧向散射光（side scatter)：
2.一套完整的流式细胞术检测样本设置
阴性对照
作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪 器归零，即确定待测标本的基础荧光域值 免疫球蛋白同型对照（同型抗体为没有特异性、与荧光
抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白。反映待测标本对抗体非特 异性结合的 水平）
阴性细胞对照（用已知和计数上。采用这种方 法计算该颗粒的体积就是
电子体积。
3.荧光信号及其面积与宽度
荧光信号被光电倍增管收集，形成信号脉冲，每个信号脉冲都有其高度、 面积与宽度。每种颜色的荧光占用一个特定的检测器，每种颜色的检 测器称为一个荧光通道。 脉冲高度表示荧光信号的强度，表示为FLn-Height，n为仪器的荧光收集 器序数。 脉冲面积（FLn-A）是采用积分计算的荧光通量。（荧光脉冲面积比高度 更能准确反映DNA含量，用于DNA倍体分析） 脉冲宽度（FLn-W）反映荧光的分布，常用来区分双连体细胞。
三、设门
流式细胞术数据分析的目的是通过与适当的阴性对照进 行比较，来确定所分析样本中表达标记物的细胞百分率。完 成这一过程的第一步就是需要确定我们所要研究的目的细胞 群，其术语为设门（gating）。 设门是指在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性 状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。 根据散射光设门 根据某一细胞性状设门 组合设门
的特殊成分、各种抗原、基因编码蛋白、细胞因子等。
细胞核：DNA、RNA、蛋白质等
分选功能
可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离
出来，再进行分析或培养。优点：分选纯度高（可达 99%），分选回收率高，可分选活细胞。
1. 流式细胞仪基本结构
流动室与液流系统
光源与光学系统
激发光源 光学系统
细胞数的百分比。 分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群
3.流式细胞仪荧光补偿设臵
以FITC、PE双色分析为例： （1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）： 先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE 双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的 放大倍数，即归零。
利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有 白细胞的流式细胞分析的二维散点图
（二) 培养细胞的样品制备
单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。
二分镜
PMT
1
2
带通滤光片
激光
激发光源
激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方 向、同步的稳定光照 激光波长: 台式机为固定波长488nm, 633nm ，大型机波 长谱线宽包括325，457.9，488, 514.5，520.8，530.9， 568.3， 633，647 nm
首先通过调节电压将阴 性对照细胞的基础荧光域值 调至阴性致信区内，然后对 阴性臵信区进行界定，大于 阴性臵信区的荧光信号为特 异性荧光信号。 对于流式样本来说，设 臵阴性对照是必须的，且阴 性臵信区一旦设定，将作为 后续样本的阴、阳性判断的 基础，不能随意变动。
2.流式细胞术分选的基本原理
1. 分选速度：几千个细胞/秒 2. 分选纯度: 99.5%左右 3. 分选收获率: 90-95%
2.二维散点图
能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横、纵 坐标分别代表两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐 标值的细胞。
看图技巧：1.先 看x，y轴，了解代 表参数的意义；2. 再看其四个象限， 并了解各象限意义； 3.比较几个散点图 时，关键看四象限 划分区间的位置以 及各象限散点的密 度；4.数据统计时， 检测目的物一般用 各象限区内的细胞 数占门内细胞百分 比或用平均荧光强 度表示。
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
流动室与液流系统
光学系统
由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件 组成，它们分别将不同波长的光信号送入到 不同的探测器。滤光片主要分为四类： 长通滤光片（LP）、短通滤光片（SP）、 带通滤光片（BP）和二分镜
Flow cell
PMT PMT 4
PMT
3
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
一、样品制备：单细胞悬液 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、质量控制
一、样品制备
流式细胞仪的样品要求：
单细胞悬液，避免任何细胞沉积
被检细胞或颗粒大小0.2－40um
样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升
（一）外周血淋巴细胞样品的制备
三、流式细胞术基本原理
1.流式细胞术分析的基本原理
2.流式细胞术分选的基本原理 3.流式细胞仪荧光补偿设臵
1.流式细胞术分析的基本原理
前向散射与侧向散射是 细胞的固有属性，暂称 为物理属性。 荧光信号是人们通过不 同手段将荧光物质结合 在细胞上，是人为属性， 暂称为化学属性。
R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：粒细胞 R4：红细胞裂解碎片和少量血小板
看图技巧： 1.先看横、纵坐标，了解检测目的； 2.看图形分布，直方图峰形越往右移，代表其荧光强度越强；
3.M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信 号大于基础荧光域值（M1），表示阳性（M2）；
4.数据统计时，检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或用平均 荧光强度表示； 5.几个直方图的比较，关键看Marker（M1、M2）的位臵以及细胞数。
流式细胞术 Flow cytometry，FCM
基本概念
1. 流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技 术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技 术设备。 2. 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对 处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒 进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分 选的技术。
将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FSC或SSC为横坐 标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其 FSC或SSC相应的位臵，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光 信号强或有。
调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判 断特异性荧光信号的有无？ 需要设臵阴性对照以确定细胞自身基础荧光域值，并通 过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。
（2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照) 此时电压 已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到 的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即FITC 单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。 注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必 须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。
计算机系统用于控制整个仪器的运行，数据采集 和数据分析。
各公司所产的流式细胞仪都有自己特有的分析系
统。
第二节 流式细胞术的数据分析
一、参数
前向散射光FSC:
反映颗粒的大小 侧向散射光SSC: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少
二、数据的显示与分析 三、设门
第一节 流式细胞仪基本结构与原理 第二节 流式细胞术的数据分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求
第四节 流式细胞术的应用
第一节 流式细胞仪基本结构与原理
一、流式细胞仪基本结构与功能
二、流式细胞术的重要术语
三、流式细胞术基本原理
四、流式细胞术的样本设臵