浙江大学生物化学实验甲 酵母RNA的提取(苯酚法)
实验8 酵母RNA的提取----苯酚法-20090301
一、实验目的和要求 1、 了解核酸的组成及RNA提取技术。 2、 掌握用苯酚法制备RNA的原理和方法 二、实验基本原理 苯酚法适用于tRNA的提取。从细菌或酵母细胞中提取tRNA，可在不经细胞 破碎，直接用被水饱和的中性苯酚抽提，苯酚可以改变细胞壁的通透性，使 tRNA (分子量在25000左右)从细胞中释入出来，而大分子核酸仍留在细胞内。 通过离心，将含有酚水和细胞碎片的乳浊液分成两相， 上层水相为水溶性RNA、 多糖及小分子极性物质，下层酚相为被水饱和的酚、变性蛋白质和DNA（大多与 变性蛋白质缠连）菌体残渣等。在酚相和水相界面有一层凝集的变性蛋白质。 用乙醇沉淀水相中的大分子物质，tRNA即呈白色絮状沉淀析出，同时除去可溶 性的酯类等杂质。再离心，弃上清液，得到tRNA沉淀样品。苯酚法是提取具有 生物活性的，不降解RNA的简便而有效的方法。 酵母RNA的提取→乙醇沉淀 →得到粗品RNA
1 2 3
图1. 苯酚提取液离心后分层的情况 1. 水层（RNA、多糖 多糖） 多糖 2. 中层（变性蛋白层 变性蛋白层） 变性蛋白层 3. 酚层（DNA及蛋白质 及蛋白质） 及蛋白质
2、有机溶剂（乙醇）纯化RNA： 有机溶剂（乙醇）纯化RNA： RNA 含有RNA溶液中加入2倍体积的95%乙醇，混匀，于冰浴中放置20 min， RNA结絮沉淀出来。5000rpm 离心5min。小心弃去上清液，用小玻棒将沉淀 小心转移到称量纸上，自然风干或烘干。RNA粗制品供定量实验用。
五、实验操作方法和步骤 1、酵母细胞破碎、提取RNA ： 酵母细胞破碎、提取RNA 称取干酵母粉1.0g , 入150 ml具塞锥形瓶中，加蒸馏水5ml , 再小心加 入90%苯酚5ml（苯酚有毒！并具腐蚀性），盖好锥形瓶的塞子，在摇床上振 摇反应 40 min后，把具塞锥形瓶中的内容物转入2支7ml离心管中,将2支离心 管平衡后，8000rpm离心10min。用吸管小心吸取上清液（含RNA)转移到另一 支干净离心管中。见图1。 图
生化实验 酵母RNA的提取及组分鉴定
酶的特异性及影响酶活性的因素
滴瓶、滴管与细口瓶 生 物 化 学 实 验
1、提出滴头，排出空气。 2、伸入液面下，吸取液体。 3、按量排出液体。 4、将剩余液体排出，放松手指，将滴 头自然放入滴瓶内
Exit
生命科学学院
蛋白质的提取、分离纯化及定量
离心机
生 物 化 学 实 验
⑴将字心机置于平坦结实的地面或实验台上。 ⑵检查离心机调速旋钮是否处在0置 ⑶装入待离心液体后，把离心机转头对称位 置上的离心管（包括外套管）放在天平上平 衡，装入液体量以距管口1--2cm为宜
反应，产生显色复合物。
⑶ 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
Exit
生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、RNA的粗提取：
二、水解RNA
三、RNA组分鉴定
生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、RNA的提取 1.7g酵母悬浮于0.2％ 氢氧化钠溶液70ml中。
生命科学学院
Exit
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验原理
⑵ 核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核
生 物 化 学 实 验
糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化
下生成鲜绿色复合物。脱氧核糖与二苯胺试剂反应成蓝色
化合物，而核糖无此反应。 地衣酚鉴定戊糖时特异性较差， 凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有 干扰作用，在试剂中加入适量CuCl2· 2H2O可减少DNA的干扰， 甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚
酵母rna的提取实验原理
酵母rna的提取实验原理宝子们，今天咱们来唠唠酵母RNA提取这个超有趣的实验原理呀。
咱先来说说酵母是个啥。
酵母呢，就像是微生物界的小魔法师。
它小小的，但是可神奇啦。
酵母细胞里有好多宝藏呢，RNA就是其中之一。
RNA这个东西呀，就像是细胞里的小信使。
它在细胞的各种活动里都扮演着超级重要的角色。
那怎么把RNA从酵母里弄出来呢？这就涉及到一些很巧妙的办法啦。
咱知道酵母细胞有细胞壁，这细胞壁就像一个小城堡的城墙一样，把细胞里的东西保护起来。
要提取RNA，首先就得打破这层“城墙”。
通常呢，会用到一些化学试剂，就像是一群小工兵一样，去把这细胞壁给攻破。
比如说用碱，碱这个东西可厉害了，它就像一个大力士，能够让细胞壁变得脆弱，然后就可以把细胞里面的东西释放出来啦。
当把细胞壁打破之后呀，细胞里的各种成分就都混在一起了。
这时候就像是打开了一个装满宝贝的宝箱，里面啥都有。
但是咱只想要RNA呀。
这里面就有一个很重要的原理，那就是RNA和其他物质在不同条件下的溶解度不一样。
RNA在酸性的环境下，会变得比较容易沉淀下来。
就像它在酸性的环境里突然变得很害羞，想要躲起来，然后就聚集在一起，形成沉淀啦。
而其他的一些物质呢，在这种酸性环境下还能够乖乖地待在溶液里，不会跟着RNA一起沉淀。
这就像是在一群小伙伴里，只有RNA这个小机灵鬼听到了特殊的召唤，然后就从溶液里跑出来啦。
还有一个很关键的点呢，就是在提取的过程中，要尽量避免RNA被分解。
RNA酶这个小坏蛋到处都是，它就像一个专门搞破坏的小怪兽，要是不小心让它得逞了，那咱辛辛苦苦提取的RNA就会被它咬得七零八落的。
所以在整个提取过程中，要使用一些能够抑制RNA酶活性的东西。
就像是给RNA穿上一层保护铠甲，让RNA酶这个小怪兽没办法靠近。
而且呀，在提取过程中，各种试剂的浓度、温度啥的都很重要呢。
就像是做菜的时候，盐放多放少、火大火小都会影响菜的味道一样。
如果试剂浓度不对，可能就没办法很好地把RNA提取出来，或者会把其他杂质也一起带出来。
酵母RNA的提取实验报告
酵母RNA的提取紫外吸收法测RNA浓度实验报告一、实验目的1、掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
2、掌握紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。
3、熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。
对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。
研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。
本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA）。
RNA离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止RNA酶的作用。
本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。
核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。
前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。
使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，避免在20~70℃的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。
这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。
但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。
RNA在260nm处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定RNA含量。
由于蛋白质在280nm波长处也有光吸收，对RNA测定有一定的干扰作用，但蛋白质的最大吸收峰在280nm处，如同时测定280nm的光吸收，通过计算可消除其对RNA测定的影响。
因此如其中含有蛋白质时必须同时测定280nm和260nm 的吸光度，可通过计算测定溶液中RNA的含量。
实验四酵母RNA的提取
实验四酵母RNA的提取一、原理酵母含有丰富的核酸，其中DNA较少，而RNA较多(约占干重的3-10%)，加之菌体收集容易，所以多用酵母作为提取RNA的材料。
本实验用浓盐法提取RNA，基本过程和原理是：用10%氯化钠使核糖核蛋白中的RNA解聚并溶于盐溶液中，离心除去菌体残渣及变性蛋白质后，调节溶液的pH值至RNA的等电点，RNA即可沉淀析出。
本法提取的RNA已变性并有部分降解，工业上常将其进一步水解，以制备核苷酸、核苷和碱基等。
如要避免RNA降解，可用苯酚法提取。
通过鉴定RNA的组成成分可对RNA定性。
磷酸：磷酸可与钼酸铵作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下被还原为蓝色的钼蓝。
嘌呤碱：它们能与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化物沉淀。
核糖：核糖与酸共热生成糠醛，后者与苔黑酚反应生成绿色化合物。
二、试剂与仪器(一)试剂：1．干酵母2．10%氯化钠溶液3．6摩尔/升盐酸溶液4．乙醚5．10%硫酸溶液6．钼酸铵试剂：2克钼酸铵溶于100毫升10%硫酸7．10%维生素C溶液8．0.1摩尔/升硝酸银溶液9．1摩尔/升氨水。
10．Fe3+-HCL试剂：0.99克硫酸高铁铵〔NH4Fe(S04)2·12H20〕溶1000毫升浓盐酸中。
11.5%苔黑酚乙醇溶液。
(二)仪器：1．沸水浴2．离心机三、操作：1.酵母RNA的提取①干酵母约0.3克置于离心管内，加入10%氯化钠5毫升，搅匀后置沸水浴加热10分钟。
②取出离心管，流水猝冷后，3000rpm离心10分钟，上层即为RNA提取液，下层为菌体残渣及变性蛋白质沉淀。
③将上层清液小心倾入另一离心管中，逐滴加6摩尔/升盐酸，边加边搅拌，随着pH下降，RNA逐渐沉淀析出，当调节pH至2.O-2.5(接近RNA等电点)时，沉淀最多，此时，静置几分钟，然后在3000rpm离心10分钟。
收集RNA沉淀。
用少量乙醚洗涤以除去脂类和色素等杂质。
2.RNA的水解在上述RNA沉淀中，加入10%硫酸5毫升，搅匀，沸水浴加热5分钟，使RNA水解。
苯酚法提取酵母RNA实验原理和操作步骤
苯酚法提取酵母RNA实验原理和操作步骤（一）原理细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。
将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。
核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。
本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA极少。
用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。
最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。
本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。
（二）主要仪器和试剂1．仪器（1）台式高速离心机（10 000r/min）（2）水浴（3）Eppendorf 管（1.5mL）（4）紫外可见分光光度计（5）冰箱或冷柜（0～4℃）（6）振荡器（7）分析天平（精确至0.1mg）（8）真空干燥器2．试剂（均为分析纯）（1）SDS- 缓冲液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。
（2）饱和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液饱和。
（3）氯仿-异戊醇液：24�s1（V/V）。
（4）含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。
（5）无水乙醇（6）乙醚（7）溶菌酶（B.R.）（1mg/mL）（三）操作步骤1．取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。
2.置冰浴中分层，在0～4℃低温环境下，10 000r/min 离心10min。
酵母RNA的提取与鉴定
酵母RNA的提取与鉴定
实验目的
掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作
过程。
了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体
实验原理
稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，
然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用 乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取 的RNA有不同程度的降解。
浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改
变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。
有生物活性。
实验原理
酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为
干菌体的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为 0.03%~0.516%, 为此提取RNA多以酵母为原料。
工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作
的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均 为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料， 其工艺比较简单。
扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定。
试剂的配制
地衣酚(苔黑酚) —三氯化铁试剂
将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加 入100mgFeCl3·6H2O(或等量CuO)。此液需临 用时配制。
实验步骤
1、酵母RNA的提取
称5g干酵母粉于150 ml三角烧瓶中，加50ml 0.2％的 NaOH，沸水浴中搅拌提取30 min。冷 却后滴加乙酸使其略偏酸性(pH5~6)。
离心(4000 r／min，15 min)，去除沉淀。 向上清液中加入30 ml 95％乙醇，稍搅拌后静置。 待完全沉淀后离心(4000 r／min，15 min) ，去 上清液。沉淀加10 ml 95％乙醇，搅拌后再次离 心。沉淀再依次用10 ml的无水乙醇、乙醚(×2) 洗涤, 得RNA粗品。
酵母RNA的提取实验报告
酵母RNA的提取紫外吸收法测RNA浓度实验报告一、实验目的1、掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
2、掌握紫外线（UV吸收法测定核酸浓度的原理。
3、熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。
对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。
研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。
本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA o RNA离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止RNA 酶的作用。
本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。
核酸（RNA都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。
前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。
使用浓盐法提取RNA勺时候应该注意掌握温度，直接至90~100C浸提，避免在20~70C的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。
这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的—般方法。
但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。
RNA在260nm处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定RNA t量。
由于蛋白质在280nm波长处也有光吸收，对RNA测定有一定的干扰作用，但蛋白质的最大吸收峰在280nm 处，如同时测定280nm的光吸收，通过计算可消除其对RNA M定的影响。
因此如其中含有蛋白质时必须同时测定280nm和260nm的吸光度，可通过计算测定溶液中RNA的含量。
酵母rna的提取实验报告
酵母rna的提取实验报告实验目的：本实验旨在通过提取酵母细胞中的RNA，研究酵母细胞的基因表达情况。
实验步骤：1. 准备工作：将所需试剂及设备准备好。
包括酵母细胞培养液、收集酵母细胞的离心管、琼脂糖、Rnase-free水、DTE溶液、Tris-HCl缓冲液、氯仿、异丙醇、盐溶液等。
2. 收集酵母细胞：将酵母培养液离心，将细胞沉淀至离心管中。
使用离心机将细胞沉淀。
3. 细胞破碎：向离心管中加入30μL DTE溶液，充分混合。
将离心管置于冰上，加入等体积的琼脂糖。
轻轻翻转管子，使细胞与琼脂糖充分混合。
继续在冰上离心。
4. 分层：将离心管放入冰上15分钟，离心10000g，4°C，15分钟，将上清转移至新离心管中。
5. 分液：加入等体积的Tris-HCl缓冲液，混合均匀。
加入等体积的氯仿，轻轻翻转混合。
在冰上离心15分钟，以分离上层水相和下层有机相。
6. 收集RNA：将上层水相转移至新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混合。
在-20°C放置30分钟，使RNA充分沉淀。
离心12000g，4°C，15分钟，将上清抽离。
7. 洗涤：加入70%乙醇洗涤一次，离心12000g，4°C，5分钟，弃上清。
重复此步骤一次。
8. 干燥：将离心管开盖，室温下干燥15分钟。
加入Rnase-free水，重悬RNA。
实验结果：完成实验后，得到1μg/μL浓度的酵母RNA。
使用NanoDrop 光度计检测RNA纯度，A260/A280比值为2.0，显示RNA被成功提取。
使用琼脂糖凝胶电泳分析酵母RNA，显示主要为2个明显的条带，符合预期。
实验结论：本实验成功地提取了酵母细胞中的RNA，并证实RNA的纯度和完整性。
这为进一步研究酵母细胞的基因表达提供了基础。
酵母RNA提取
酵母RNA的提取一、目的：学习稀碱法提RNA的原理与技术。
二、原理：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验室最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3―4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。
提取的RNA 有不同程度的降解。
酵母含RNA达2.67―10.0%，而DNA含量仅为0.03―0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
三、器材与试剂：1．器材：[1]干酵母粉（市售）。
[2]鲜酵母（市售）。
[3]pH试纸（pH1―10）。
[4]台天平（100g）。
[5]烧杯100ml（×1）。
[6]量筒50ml（×1）、10ml（×1）。
[7]抽滤瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。
[8]吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1）。
[9]离心机5000r・min-1。
2．试剂：[1]0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
[2]乙酸（A・R）。
[3]95%乙醇。
[4]无水乙醚（C・P）。
[5]氨水（C・P）。
[6]10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定
定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血 酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷 试剂失效。因此可以改用钼酸铵试剂定 磷。核酸分子中的有机磷经强酸消化后 形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与 钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。
【思考题】
01 如何得到高产量RNA粗制品？ 02 验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱氧核糖，为什么？ 03 用你所学过的化学知识,分析3种催化剂：
【操作步骤】
RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢氧化钠 溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至100毫 升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心 (3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙 醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸 沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用 95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙 醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。
标准曲线的制作
按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置沸 水浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号 管作对照,于670nm波长处测定各管光吸收 值。取测定的平均值,以RNA浓度为横坐标, 光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线。
样品的测定
取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加 2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行 测定.
RNA含量的计算
根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出 相当该光吸收的RNA含量，计算出制品 中RNA的百分含量。
第一步
第二步
【注意事项】
01 样 品 中 蛋 白 质 含 量 较 高 时 , 应 先 用 5 % 三 氯 乙 酸 溶 液 沉 淀 蛋白质后再测定。
02 本 法 特 异 性 较 差 , 凡 属 戊 糖 均 有 反 应. 微 量 D NA 无 影 响 , 较 多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂中加入适量 CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰。此外,利用RNA和 DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示 最大色度加以区分。反应2min后,DNA在600nm呈现 最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈 现最大光吸收。
生化实验 酵母RNA的提取及组分鉴定
验
迅速冷却，提取液离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀
碱法是用稀碱溶液使细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋
白质和菌体后
,的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
Exit 生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验原理
生
酵母含RNA,2.62---10％,DNA含量仅为0.03-0.516%，所 以提取RNA多以酵母为原料。
甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚 反应，产生显色复合物。 ⑶ 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
Exit 生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验步骤
生 物
一、RNA的粗提取：
化
二、水解RNA
学
三、RNA组分鉴定
实
验
生命科学学院
实验步骤
酵母RNA的提取及组分鉴定
生 一、RNA的提取 物 1.7g酵母悬浮于0.2％ 化 氢氧化钠溶液70ml中。 学 2.将悬浮液转移至 实 150ml锥形瓶中，在沸 验 水浴上加热30分钟，冷
开吸耳球，立即用右手的食指按住管口，大拇指和中指拿住管刻度线
上方，再使管离开液面，管末端仍靠在盛溶液器皿的内壁上。略松食
指，使液面平稳下降，直到溶液的弯月面与刻度标线相切。
Exit
生命科学学院
酶的特异性及影响酶活性的因素
移
液
生 物 化 学 实 验
生 入水解液1ml ，加入三氯
物
化铁的浓盐酸溶液2ml和
化
苔黑酚的乙醇溶液3滴，
学
实
在沸水浴中加热，观察试
验
管内颜色变化。解释原因。
生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
生物化学实验报告-酵母RNA的提取与鉴定
实验五酵母RNA的提取与鉴定一、实验目的1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。
2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。
二、实验原理1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。
2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。
3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解三、实验仪器1.离心机2.水浴锅3.电炉4.烧杯5.量筒四、实验试剂1.干酵母粉2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
3.乙酸4.95%乙醇5.无水乙醚6.10%硫酸7.氨水9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。
1.苔黑酚-三氯化铁溶液：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.6H2O。
临用时配制。
五、实验步骤1.RNA的提取：（1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。
然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。
（2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。
（3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。
（4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。
乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。
2.鉴定：（1）取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。
（2）取水解液0.5ml，加入苔黑酚-三氯化铁溶液1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变化。
（3）水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。
六、实验结果加热至沸1分钟后，溶液变成绿色；产生絮状嘌呤银化合物沉淀七、实验分析实验注意事项1.过滤时,洗涤不能带水,否则沉淀粘在滤纸上取不下来。
浙江大学生物化学实验甲 定磷法测定RNA含量
3、实验步骤
• 实验中的注意事项及解说详见实验讲义P-140。
4、实验结果及处理
1 、无机磷标准曲线的制作 • 将所得的实验数据以磷含量为横坐标，光密度为纵坐 标，画出标准曲线。
定磷法测定RNA含量
2 、样品测定 a、RNA的定性鉴定 • 认真观察颜色变化并解释实验现象。 b、RNA的定量测定
• 记录样品的光密度值，根据下式计算RNA的含量：
标准曲线上查得 的含磷量（ug） RNA（ug/mg鲜重）= × 稀释倍数 ×
1000 95
样品鲜重（mg ）
0
浓硫酸
RNA H2 O
核苷酸浓硫酸H2O源自定磷法测定RNA含量2、定磷法的原理 磷酸 + 钼酸 H+ 磷钼酸 钼蓝 （抗坏血酸） 蓝色，660nm处有特征光 吸收 ， OD值与无机磷含 量成正比，可据此通过比 色法测定磷含量。 a、比色法的测定原理 还原剂
• 由于钼蓝的OD660值与溶液中的磷含量成正比，因此，
如以磷含量为横坐标，OD660值为纵坐标，二者之间 的关系应为直线。如下图：
定磷法测定RNA含量
未知样品磷含量的测定： • 由未知样品的OD660值， 通过标准曲线，用作图 法即可知道未知样品的
OD660
磷含量，如右图所示：
b、定磷法的特点：
未知
磷含量（ug）
• 定磷法测定时如用抗坏血酸作还原剂，比色的最适范 围为1-10微克无机磷。 • 钼蓝反应极为灵敏，微量杂质的磷、硅酸盐、铁离子、
rnah2oh2o核苷酸核糖定糖法测定磷酸定磷法测定定磷法测定rna含量2定磷法的原理磷酸钼酸磷钼酸钼蓝蓝色660nm处有特征光吸收od值与无机磷含量成正比可据此通过比量成正比可据此通过比色法测定磷含量
酵母rna的提取实验报告
酵母rna的提取实验报告酵母RNA的提取实验报告。
实验目的，通过实验研究酵母RNA的提取方法，为后续的基因表达调控研究提供技术支持。
实验材料与方法：1. 实验材料，酵母细胞培养物、TRIzol试剂、异丙醇、氯仿、乙醇、DEPC水等。
2. 样品制备，取酵母培养物，离心收集酵母细胞，冰上洗涤去除培养基。
3. 细胞破碎，向酵母细胞中加入TRIzol试剂，用离心管摇匀，静置离心管5分钟。
4. RNA提取，加入氯仿，摇匀，离心分离上清液，上清液转移至新离心管中，加入异丙醇沉淀RNA。
5. RNA沉淀，离心沉淀RNA，弃上清液，加入乙醇洗涤RNA，再次离心沉淀RNA。
6. RNA溶解，用DEPC水溶解RNA，测定纯度和浓度。
实验结果：1. 细胞破碎，经过加入TRIzol试剂处理后，酵母细胞成功破碎，形成混浊的混合液。
2. RNA提取，通过氯仿萃取法，成功分离出上清液中的RNA，得到透明的上清液。
3. RNA沉淀，加入异丙醇后，观察到RNA在离心管底部形成白色沉淀。
4. RNA溶解，最终得到溶解度较高的RNA样品，纯度和浓度符合实验要求。
实验分析：本次实验采用的酵母RNA提取方法较为简单，通过TRIzol试剂的使用，成功实现了酵母细胞的破碎和RNA的提取。
氯仿的加入有效分离出RNA，异丙醇的沉淀步骤也取得了良好的效果。
最终得到的RNA样品纯度高，浓度适宜，可以用于后续的实验研究。
实验结论：本实验成功建立了一种适用于酵母细胞的RNA提取方法，为后续的基因表达调控研究提供了可靠的技术支持。
该方法操作简便，提取效果良好，适用于大规模样品的提取工作。
参考文献：1. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987Apr;162(1):156-9.2. Schmitt ME, Brown TA, Trumpower BL. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 1990 Jan25;18(10):3091-2.。
酵母RNA的提取实验报告
酵母RNA的提取实验报告实验报告：酵母RNA的提取一、实验目的1.学习和掌握酵母RNA的提取基本原理和方法。
2.了解RNA在生物体内的生物功能及其重要性。
3.培养实验技巧和操作能力，提高实验素养。
二、实验原理RNA（核糖核酸）是生物体内的重要生物分子之一，它参与蛋白质合成、基因表达等重要生命活动。
酵母是一种常用的真核生物模型，其RNA提取方法与人体、植物等真核生物类似。
本实验采用氯仿-异戊醇法提取酵母RNA。
主要步骤包括细胞破碎、离心分离、有机溶剂抽提、乙醇沉淀等。
三、实验步骤1.准备试剂和器材（1）试剂：氯仿、异戊醇、无水乙醇、DEPC水、RNA酶。
（2）器材：研钵、离心管、移液器、玻璃棒、氮气吹干器、分光光度计等。
2.酵母细胞破碎（1）在冰上用研钵将酵母细胞研磨成粉末。
（2）加入适量DEPC水，搅拌均匀。
（3）用玻璃棒将细胞碎片挑出，弃去上清液。
（4）加入适量DEPC水，搅拌均匀，重复上述步骤，直到细胞完全破碎。
3.离心分离（1）将破碎的酵母细胞溶液转移到离心管中。
（2）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
4.有机溶剂抽提（1）用移液器将上清液小心地转移到另一个离心管中。
（2）加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇=24：1），用玻璃棒搅拌均匀。
（3）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
5.乙醇沉淀（1）将上清液转移到新的离心管中，并加入等体积的无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）在4℃下，以12000rpm的转速离心15分钟。
6.洗涤和干燥（1）用移液器小心地将上清液吸出，留下沉淀物。
（2）加入适量75%乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，去除残留的乙醇和水分。
（3）在氮气吹干器下将沉淀物吹干约5分钟。
7.RNA溶解与定量（1）加入适量DEPC水，将沉淀物溶解。
（2）用分光光度计测定RNA溶液的吸光度值（A260nm），计算RNA浓度。
四、实验结果与分析表1：酵母RNA提取结果本实验通过氯仿-异戊醇法成功地提取出了高浓度的酵母RNA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、原理
细胞 苯酚 振摇 RNA从细胞中释放出来 乙醇 冰浴 上清：可溶性杂质等 沉淀：RNA 离心
下层：DNA、细胞碎片等 中层：变性蛋白
取上清
上清：RNA、可溶性杂质 离心 RNA结絮沉淀出来
中层：变性蛋白 第一次离心结果
上清：RNA、可溶性糖等
下层：DNA、细胞碎片等
酵母RNA的提取（苯酚法）
2、材料及试剂
1、实验材料
• 酵母干粉 2、实验试剂 • 实验试剂的配制详见P132。
3、实验步骤
• 实验步骤
4、实验结果及处理
• 认真观察实验过程中出现的现象，特别是冰浴后
絮状沉淀的出现情况。