荧光光谱分析法

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c. 镜像规则 故通常 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似， 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常 荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 振 递减值与 递减值与振 有 动能级差 动能级差有 关，各小峰 的高度与 跃 的高度与跃 有关。 迁几率 迁几率有关。
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振动 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 ； 能级分布类似 能级分布类似； 基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 相反跃迁也如此 。 级的几率较大的话， 级的几率较大的话，相反跃迁也如此 相反跃迁也如此。
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
荧光分子都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱（荧光光 谱）。 （1）荧光的激发光谱 表示 不同激发波长 激发光谱： 激发光谱：表示 表示不同激发波长 发射某一波长荧光 的 下所引起物质 下所引起物质发射某一波长荧光 发射某一波长荧光的 相对效率。 固定 发射 波长 绘制激发光谱： 绘制激发光谱：固定 固定发射 发射波长 ), 然后以不同波长的 ( 选最大发射波长 选最大发射波长), ),然后以不同波长的 荧光强度F对 入射光激发荧光物质，以 入射光激发荧光物质，以荧光强度 激发波长λ作图 ，即为激发光谱。 作图，即为激发光谱。
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分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变
ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…）
电子被激发且伴随着自旋方向的改变 ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为 激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3…）
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第五章
分析法 荧光 荧光分析法
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
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某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 （二级光）。 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光 光致发光（二级光）。 荧光 fluorescence 光致发光 磷光 phosphorescence 荧光谱线的位置 及其 强度 进 荧光分析法是根据物质的 荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置 荧光谱线的位置及其 及其强度 强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛豫
：10-7～10-9s，第一激发 单重态 的最低振动能级 →基态 荧光 荧光： 第一激发单重态 单重态的最低振动能级 的最低振动能级→ ：10-4～10 s； 第一激发 三重态 的最低振动能级 →基态 磷光 磷光： 10s 第一激发三重态 三重态的最低振动能级 的最低振动能级→
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于−NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH<2和pH＞ 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。
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4.内滤光作用和自吸现象 ：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 内滤光作用 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象 ：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
小结：激发单重态与激发三重态的不同 �激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激 发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 而激发三重态 �激发单重态分子平均寿命短（ 10-8~10-6s）， ），而激发三重态 s） 的长（10-4~10 ~10s �基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
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非辐射能量传递过程 辐射和 辐射和非辐射能量传递过程
：同一 电子能级中，以 热能量交换形式由高振动能 振动弛豫 振动弛豫： 同一电子能级中，以 电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 。发生振动弛豫的时间 10-12s 层至低相邻振动能层间的跃迁 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间 。发生振动弛豫的时间10 内转换： 相同多重态的电子能级间的 等能级的无辐射跃迁 。 内转换：相同多重态的电子能级间的 相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁 等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。 荧光发射： 电子由 第一激发单重态的最低振动能层 →基态 荧光发射：电子由 电子由第一激发单重态的最低振动能层 第一激发单重态的最低振动能层→ ( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 λ3的荧光，10-7~10-9s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
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分子荧光分析的特点：
高： 一般紫外一可见分光光度法的检出限 1. 灵敏度 灵敏度高： 高：一般紫外一可见分光光度法的检出限 约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到1010甚至10-12
g/ml。
好 2. 选择性 选择性好 宽 3. 线性范围 线性范围宽 窄 4. 应用范围 应用范围窄
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二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（ϕ）：
发射的光量子数 ϕ= 吸收的光量子数
100% 。 如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为 如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100% 100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
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小结：分子能级与跃迁 ： 吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 基态 (S0) → 激发态 激发态： 一次到位； →基态：多种途径和方式(见能级图 )；速度最快、激 激发态 激发态→ 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ； 电子能级的多重性 M=2S+1 (洪特规则 )，三重态能级比相应 平行自旋比成对自旋稳定 平行自旋比成对自旋稳定( 洪特规则) 单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； 7
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2.有机化合物的分子结构与荧光的关系
（1）跃迁类型： π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低 分子振动，减少与溶剂的相 互作用，故具有很强的荧光 。如荧光素和酚酞有相似结 构，荧光素有很强的荧光， 酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环上 有供电子基，使荧光增强。
第一节
荧光分析法的基本原理 一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生 ★分子能级比原子能级复杂 每个电子能级上都存在振动、转动能 层 ★在分子体系中， 分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能 每个电子能级上都存在振动、转动能层 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层 ★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和基态单重态, 1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 则该分子所处的电子能态称为基态单重态 用符号S0表示
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2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加 快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降 低10℃，ϕ f增加3％，在−80℃时， ϕ f为1。
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3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
λ3 > λ 2 > λ 1 ；
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激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 外转换： 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 非辐射跃迁 。常发生在S1或 T1→ S0 转移能量的 转移能量的非辐射跃迁 非辐射跃迁。常发生在 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 系间跨越： 系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 非辐射跃迁 。 生变化的 生变化的非辐射跃迁 非辐射跃迁。 禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1→T1 就可发生系间 跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s 电子 由第一激发三重态的最低振动能级 →基态(T1 磷光发射： 磷光发射：电子 电子由第一激发三重态的最低振动能级 由第一激发三重态的最低振动能级→ 慢： 10-4~100 s、磷光的 能量比荧光小 →S0跃迁)；发光速度很 发光速度很慢 ~100s 磷光的能量比荧光小 电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） →振动弛豫 →内转移 →系间跨越 →振动弛豫 → T1 S0→激发 激发→ 振动弛豫→ 内转移→ 系间跨越→ 振动弛豫→ 光照停止后，可持续一段时间
S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
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内转换
S2 S1
能 量 吸 收
振动弛豫 内转换 系间跨越
T1
发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0传递途径 激发态 激发态→
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 (发光 )和无辐射跃迁等方式失去能量； 跃迁 跃迁( 发光) 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁