斑马鱼(Zebrafish)半胱氨酸蛋白酶3(Casp-3)ELISA试剂盒说明书
【高中生物】斑马鱼如何长出新的神经元
【高中生物】斑马鱼如何长出新的神经元
研究人员已经发现了使得斑马鱼的大脑能够在其受到创伤性损害之后再生的机制。
与哺乳动物不同，这些在淡水中生长的小鲦鱼因为脑部损伤所致的炎症会伴有新神经元的产生。
如今，Nikos Kyritsis及其同事展示，在损伤反应中，斑马鱼脑部的炎症会激活特定的信号传导分子及神经胶质细胞，后者可促进替代神经元的生长。
研究人员在不造成损伤的情况下，用药物引发了斑马鱼脑中的炎症，实验结果显示，被称作放射状胶质细胞的特定细胞仍然可受到诱导而产生新的细胞。
然而，他们说，炎症信号受到抑制的斑马鱼则无法产生新的神经元或鳍细胞。
Kyritsis和其他的研究人员发现，一种叫做半胱氨酰白三烯受体1??或Cystlr1的蛋白质的表达对斑马鱼的再生过程是至关重要的。
当他们在斑马鱼脑内注射一种叫做LTC4的该蛋白的配体时，研究人员观察到，在没有任何炎症时新的神经元也会产生。
因此，他们鉴于这些结果提出，在放射状胶质细胞内，炎症一定是通过与LTC4信号传导级联反应进行耦合才能使斑马鱼的受损神经元重新生长。
他们表示，他们的发现可能最终会在治疗创伤性脑损伤及神经退行性疾病中找到治疗性的应用。
感谢您的阅读，祝您生活愉快。
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎蛋白WB方案
斑马鱼胚胎蛋白定量实验方案㈠使用液的配置：1.蛋白提取液（Lysis buffer）：0.6ml 1M Tris HCl PH 6.81.0ml 50% Glycerol（甘油）2.0ml 10% SDS6.4ml H2O10 ml Lysis buffer -20℃分装保存备用备注：Lysis buffer使用前需加入1：100的100mM PMSF。
2.上样缓冲液（1XSample buffer）：50mM Tris-HCl pH 6.82% SDS10% Glycerol（甘油）0.02% Bromophenol blue（溴酚蓝）0.7% 2-mercaptoethanol（2-巯基乙醇）3.电泳缓冲液（Running buffer）： 3.0g Tris-base14.4g Glycine（氨基乙酸）10ml 10%SDS加双蒸水至1000ml4.转移缓冲液（Transfer buffer）： 3.0g Tris-base14.4g Glycine（氨基乙酸）200ml Methanol（甲醇）加双蒸水至1000ml5.封闭液(Blocking solution)：称5g脱脂奶粉溶于100ml TBST中。
6.洗涤液（TBST buffer）：20mM Tris-HCl pH7.40.15M NaCl1-5 ml 0.5% TWEEN-20加双蒸水至1000ml㈡斑马鱼胚胎蛋白的提取：1. 取100枚胚胎放入1.5ml EP管中，用灭菌水清洗2次，加入200μl Lysis buffer（预加1% PMSF），匀浆器匀浆，再加入300μl Lysis buffer，votex 1min；将处理后的样品放入沸水中煮8 min，12000g离心5 min，取上清，蛋白样品即位于上清中；提好后的蛋白需立即置于冰上，可以长时期存放于-80℃。
（胚胎可以先冻存于-80℃，以后再提取蛋白，若胚胎数量少，而目的蛋白也少，则可以减少Lysis buffer的加入量。
Caspase半胱氨酸蛋白酶家族蛋白介绍
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Caspase-6(CT)半胱氨酸蛋白酶蛋白-6（C端）
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Caspase-13半胱氨酸蛋白酶蛋白-13
S-0053R
◆兔抗人、大鼠、小鼠Caspase-13多克隆抗体
◆200ul/1000.00 1ml/2900.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
◆WB=1:500-1000 IF=1:100-200 Elisa =1:5000-10000
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
CD10单抗
S-0551M
◆小鼠抗人CD10单克隆抗体
◆100ul/1200.00 200ml/2000.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆Caspase-10含有497aa,分子量为55KDa,与其它成员有30%—50%的同源性，Caspase-10分子结构的显著特点是其N端也有两个FADD氨基端样结构域。Caspase-10分布广泛，基因定位于2p12，即因转染昆虫细胞系Sf9中可以引起细胞凋亡，其活性可以被DEVD-CHO所抑制。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
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Caspase-3活性测定试剂盒
北京索莱宝科技有限公司
反应缓冲液μl
无样品 空白对照
95
待测样品μl
－
底物 μl
5
总体积μl
100
高酶活性 样品 85 10 5 100
低酶活性 样品 60 35 5 100
产品说明： 1、Caspase酶活力单位定义：参考 One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底 物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线 和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。 2、除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能 得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
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北京索莱宝科技有限公司
×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。 1、（1）细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴 10分钟，再次震荡。
(2) 组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。 2、4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。 3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml， 相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
乌鳢半胱氨酸蛋白酶3基因克隆及表达分析
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2023，54（11）：3405-3415ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.11.027乌鳢半胱氨酸蛋白酶3基因克隆及表达分析赵浩航1，2，丘金珠3，周秀莹3，唐怀庆3，赵天珍3，梁富3，宋海霞3，喻大鹏1，2，宋长江3*（1广东海洋大学深圳研究院，广东深圳510000；2广东海洋大学，广东湛江524088；3中山市农产品质量安全检验所，广东中山528400）摘要：【目的】克隆和表达分析乌鳢（Channa argus）的半胱氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase）3基因（caspase-3），为探究该基因在乌鳢机体中的免疫应答作用及在其他鱼类免疫上的作用提供理论依据。
【方法】根据NCBI公布的乌鳢基因组信息，对乌鳢的caspase-3基因序列进行克隆，对推导的caspase-3氨基酸序列进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR检测caspase-3基因在健康乌鳢各组织中的表达分布及在不同刺激物［鰤鱼（Seriola quinqueradiata）诺卡氏菌（Nocardia seriolae）、脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI：C）］刺激下的时序表达情况。
【结果】caspase-3基因序列全长855 bp，编码284个氨基酸残基，蛋白分子量为31.069 kD，理论等电点（pI）为6.17。
caspase-3蛋白含有1个CASc结构域。
多序列比对结果显示，乌鳢的caspase-3氨基酸序列与秘鲁笛鲷（Lutjanus peru）的caspase-3氨基酸序列相似度最高，达81.7%；系统发育进化树分析结果表明，乌鳢的caspase-3氨基酸序列与秘鲁笛鲷的caspase-3氨基酸序列聚为一支。
介绍ELISA试剂盒中常见的三种HRP底物
介绍ELISA试剂盒中常见的三种HRP底物ELISA试剂盒中HRP底物范围较广，主要包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
一、二氨基联苯胺／金属盐DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。
它产生剧烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。
多数状况下，推举在DAB中加入不同的金属离子。
当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。
此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。
DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。
1. 需要的溶液和特别设备DAB，0.05 mol／LTris缓冲液(pH7.6),0.3％ (W/V) 氯化镍/水贮存液,30％过氧化氢,DPX,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).2. 操作步骤(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris缓冲液(pH7.6)溶解6 mg DAB；(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢。
过氧化氢一般以30％的溶液供应，贮存在4 ℃，此条件可以持续1个月；(4) 假如消失沉淀，用滤纸过滤；(5) 加此溶液至标本，并孵育1~20 min水洗终止反应；(6) 优化：假如需要可复染；(7) 用DPX封片。
二、氯萘酚氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。
敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。
它适用于当DAB反应形成较高背景或要求转变产物的颜色。
1. 需要的溶液和特别设备0.03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，过氧化氢，Gelvatol或者Mowiol，光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2. 操作步骤(1) 氯萘酚贮存液的预备：用10 mL无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，贮存于-20℃；(2) 加100μL 氯萘酚贮存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢于水中。
Caspase3 活性检测试剂盒
3. Wang Q, Luo W, Zhang W, Dai Z, Chen Y, Chen J. Iron supplementation protects against lead-induced apoptosis through MAPK pathway in weanling rat cortex. Neurotoxicology. 2007 Jul;28(4):850-9.
10µl
Ac-DEVD-pNA (2mM)
10µl
10µl
总体积
100µl
100µl
注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入
10µl Ac-DEVD-pNA (2mM)。
C. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即
可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
D. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准
曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
E. 参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amபைடு நூலகம்unt of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the
斑马鱼(Zebra fish)脂联素(ADPN)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断斑马鱼（Zebra fish）脂联素（ADPN）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被脂联素（ADPN）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的脂联素（ADPN）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、100、200、400、800、1600ng/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
zebrafish免疫组化elivision
zebrafish冰冻切片免疫组化Protocol目的：检测mice anti human insulin在斑马鱼胰腺组织的反应性试剂：0.01M PBS（pH：7.2－7.4）0.01M柠檬酸盐（pH 6.0）：1000ml ddH2O中加柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O）3g, 柠檬酸C6H8O7. H2O 0.4g一抗：mice anti human insulin, ready to use (迈新公司)3％过氧化氢溶液：30％H2O2：ddH2O（1：9）（自配）试剂盒：elivision-plus试剂盒(maixin)显色剂：新鲜配制DAB（1ml ddH2O中A、B、C液各一滴，用时混匀）苏木素：0.5％盐酸酒精：100ml 70％酒精中加入浓盐酸0.5ml中和碱：无水硫酸镁4g（或MgSO4 .6H2O 8g）、碳酸氢钠0.7g溶解于200ml双蒸水中。
封片剂：中性树胶二甲苯（I 、II）及梯度酒精（纯水稀释无水乙醇：100％，95％，90％，80％，70％）（1）60℃烤片20min（2）PBS洗3次（3）3％过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶（4）PBS洗3次（5）A:阴性对照片PBS; B:实验片加鼠抗人胰岛素一抗，室温2小时（6）PBS缓冲液漂洗3分钟×5次（7）滴加elivision-plus试剂盒聚合物增强剂（试剂A），室温20分钟(8) PBS缓冲液漂洗3分钟×3次（9）滴加elivision-plus试剂盒酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温30分钟(10) PBS缓冲液漂洗3分钟×3次（11）滴加新鲜配制的DAB溶液显色，显微镜下严密观察并注意控制反应时间（3-5min）（12）自来水冲洗终止反应,ddH2O冲洗2minX3（13）必要时苏木素复染胞核2分钟（14）切片经流动的自来水冲洗5次，直至切片颜色呈深蓝色（15）切片经蒸馏水冲洗2次（16）0.5％盐酸酒精溶液分色3－5秒(至切片变为淡红色或结缔组织无色为止，切片经流动的自来水冲洗) （17）切片浸入中和碱液30－60秒，自来水洗10－15分钟，并经蒸馏水冲洗2次（18）脱水：切片浸入70％、80％、90％、95％酒精以及无水酒精溶液I、II中脱水各5分钟（19）透明：切片浸入二甲苯/100％酒精（1:1）溶液、二甲苯I和二甲苯II各10分钟（20）中性树胶封片。
碧云天Casapase 3活性检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************碧云天网站微信公众号网址：Caspase 3活性检测试剂盒产品编号产品名称包装C1115 Caspase 3活性检测试剂盒20次产品简介：Caspase 3活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3酶活性或纯化的caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase)，ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。
同时caspase 3对细胞起泡(cell blebbing)也起到关键作用。
斑马鱼直接PCR的方法及说明
斑马鱼直接PCR的方法及说明斑马鱼直接PCR试剂盒是基于一种新的，第三代（3G）的DNA聚合酶，通过改进工程常见的植物衍生的PCR抑制剂如多酚和多糖耐受的分子进化。
包是从原油样品植物DNA 快速扩增的优化，含DNA的粗提取方法进行了抑制剂，纯化的DNA。
斑马鱼直接PCR试剂盒主要特点包括：1快速PCR技术直接从植物组织中如叶盘，种子和天然植物提取物。
2简化工作流程为转基因筛选。
3改进的PCR成功率和可重复性。
4从样品类型的漫长而艰难的目标有效放大。
斑马鱼直接PCR试剂盒描述斑马鱼直接PCR试剂盒是由于组织内的植物组织的类型和潜在的PCR抑制剂中的多样性是一个具有挑战性的应用。
斑马鱼直接PCR试剂盒是DNA从天然植物样品成功扩增的优化，含DNA粗提取方法进行了抑制，以及纯化的DNA。
斑马鱼直接PCR试剂盒包含一个新的DNA聚合酶，工程通过分子进化过程中，为提高普通植物来源的PCR抑制剂如多酚和多糖的耐受性。
在强大的放大在很宽的范围内的植物种类的样品，扩增子长度的酶结果的独特的特点，与粗提取方法。
该套件包含4个独立的部分组成：1）该厂PCR缓冲液（2X）是准备使用含有除DNA聚合酶，引物和模板的成分的鸡尾酒。
这2个缓冲区包含3毫米氯化镁；2）kapa3g植物DNA聚合酶是一个融合工程TaqDNA聚合酶的基础（A型）和改进的古细菌（B型）DNA聚合酶。
这种混合酶结合专有的抗体灭活酶*变性步骤之前；3）该厂PCR 增强剂是作为改善困难的样品和检测氯化镁滴定未能改善结果PCR性能的一个可选的添加剂；4）额外的MgCl2（25毫米）是检测需要的MgCl2优化提供。
斑马鱼直接PCR试剂盒应用斑马鱼直接PCR试剂盒是专为从各种植物样品包括长度的DNA片段的扩增≤5KB：含有携带抑制剂植物DNA粗提物直接从叶盘，种子样品，和其他植物组织样品样品中含有植物来源的化合物浓度显著斑马鱼直接PCR试剂盒包含一个新的DNA聚合酶工程通过过程的分子进化提高耐常见植物源性抑制剂。
一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法(一)
一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法(一)一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法引言过氧化氢（H2O2）是一种重要的氧化还原物质，在生物体内起着多种生理过程的调节作用。
针对斑马鱼组织过氧化氢的检测方法的研究对于深入了解生物体内氧化还原系统的功能具有重要意义。
本文将介绍一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法，详细说明各种方法的原理和应用。
方法一：荧光染料法1.荧光染料法是一种常用的检测过氧化氢的方法之一。
2.在斑马鱼组织中孵育一种荧光染料，如DCFH-DA，它可以转化成荧光物质DCF，其荧光强度与组织中过氧化氢的浓度呈正相关。
3.使用荧光显微镜观察染色后的斑马鱼组织，通过测量荧光强度的变化来间接检测过氧化氢的水平。
4.这种方法简单、快速且具有较高的灵敏度，适用于静态或动态观察组织中过氧化氢的变化。
方法二：化学反应法1.化学反应法是另一种常用的检测过氧化氢的方法。
2.在斑马鱼组织中添加一种化学试剂，如铁离子（Fe2+）和草酸盐（C2O4^2-），它们可以与过氧化氢发生化学反应。
3.这种反应会产生染色剂，如紫色过氧化亚铁（Fe(C2O4)2-）沉淀，其沉淀量与组织中过氧化氢的浓度呈正相关。
4.通过测量染色剂的光学密度或颜色的变化来间接检测过氧化氢的水平。
5.这种方法操作简单，可以实现高通量筛选，适用于大规模的实验或筛选。
方法三：电化学法1.电化学法是一种高灵敏度的检测过氧化氢的方法。
2.利用电化学传感器，如玻碳电极或金属电极，将其与斑马鱼组织接触。
3.通过施加电位，观察电极上产生的电流变化来检测过氧化氢的水平。
4.这种方法具有高灵敏度和实时监测的特点，适用于对过氧化氢动态变化的研究。
方法四：基因工程法1.基因工程法是一种新型的检测过氧化氢的方法。
2.利用基因工程技术，构建特定的报告基因，如启动子与荧光蛋白基因的融合体。
3.将这种报告基因转染到斑马鱼组织中，即可实现过氧化氢水平的实时可视化。
4.这种方法可以对过氧化氢的动态变化进行实时监测，并区分组织内不同细胞类型的过氧化氢水平。
细胞半胱氨酸蛋白酶-3活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
细胞半胱氨酸蛋白酶-3活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞半胱氨酸蛋白酶-3活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过四肽化合物底物Ac-DEVD-pNA，受到半胱氨酸蛋白酶-3的水解，释放黄色对硝基苯胺，产生吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体、昆虫等）半胱氨酸蛋白酶-3（CASPASE-3）的活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景半胱氨酸蛋白酶（Cysteine-requiring Aspartate protease；CASPASE），或称半胱天冬蛋白酶，是调节细胞凋亡的一类蛋白酶家属。
半胱氨酸蛋白酶-3 （CASPASE-3；EC3.4.22.56）是半胱氨酸蛋白酶家属中CED-3（Cell Death Gene Number 3；秀丽隐杆线虫细胞死亡基因数3）分支的一种，又称CPP32（Cysteine Proteinase Protein 32 kd；半胱氨酸蛋白酶蛋白32）、apopain（凋亡素）、Yama（印度传说中的死亡之神）等。
半胱氨酸蛋白酶-3前体为32kd，被切离为17kd和11kd而激活细胞凋亡。
其底物是多聚ADP-核糖多聚酶（poly（ADP-ribose）polymerase；PARP）、半胱氨酸蛋白酶激活DNA酶抑制剂（ICAD）等。
半胱氨酸蛋白酶-3的活性检测用来评价细胞或组织的凋亡状况。
基于人工合成的四肽化合物底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nithoaniline；乙酰天冬氨酰谷氨酰颉氨酰天冬氨酰对硝基苯胺）受到半胱氨酸蛋白酶-3的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性。
半胱氨酸蛋白酶-3反应系统为：CASPASE-3Ac-DEVD-pNA→Ac-DEVD + pNA（黄色）产品内容清理液（Reagent A）120毫升裂解液（Reagent B）10毫升缓冲液（Reagent C）2毫升阴性液（Reagent D）1毫升底物液（Reagent E）220微升产品说明书1份保存方式保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离微型台式离心机：用于样品沉淀培养箱：用于反应物孵育96孔板或比色皿：用于样品比色测定的容器酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。
保健食品抗氧化功能的斑马鱼检测
保健食品抗氧化功能的斑马鱼检测1 范围本标准规定了一种保健食品抗氧化功能的快速检测方法。
本标准适用于保健食品产品、配方和原料抗氧化功能的快速检测和筛查。
有以下特征的受试物不适用于本标准的方法：——受试物不能溶解、乳化或制备成均匀分散的悬浮液；——受试物溶液颜色较深或不溶性颗粒，对测试的干扰无法消除；——受试物会产生自体荧光，对测试的干扰无法消除。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 21808 化学品鱼类延长毒性14天试验GB 14924.2 实验动物配合饲料卫生标准SN/T 0476 进出口卤虫卵检验方法NY 5073 无公害食品水产品中有毒有害物质限量NY 5072 无公害食品渔用配合饲料安全限量GB 5749 生活饮用水卫生标准3 术语及定义3.1 无可观察效应浓度 no observed effect concentration （NOEC）与对照相比，对试验生物未产生显著效应的最高受试物浓度。
[来源：GB/T 21808，2.5]。
3.2 亲鱼指用来繁殖测试所需鱼卵的成年斑马鱼。
3.3 活性氧簇 reactive oxygen species （ROS）是含氧的化学物质，包括：O2·-、H2O2及HO2·、·OH等，是体内氧化反应的物质基础，也是体内过氧化效应产生的根源，与人体衰老、慢性炎症、癌症等疾病的发生、发展、预防和治疗密切相关。
4 方法原理体内的ROS水平高低是由体内活性氧产生与消除的平衡状态所决定。
体内ROS水平上升时，会消耗体内抗氧化物质，如果体内抗氧化物质的合成速度慢且抗氧化酶对ROS的清除速度不够快时，就会导致脂质和蛋白的过氧化水平升高，引起衰老等跟过氧化相关的生理现象。
如果受试物能够加快体内抗氧化物质的合成速度、提升抗氧化酶的活力，就能迅速消除体内产生的ROS，从而降低ROS诱发的脂质和蛋白过氧化水平，使体内活性氧产生与消除保持在一个有益于身体健康的的平衡状态。
一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法
一种斑马鱼组织过氧化氢检测方法斑马鱼作为一种常见的实验动物，广泛应用于生物医学研究中。
而过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是一种常见的氧化剂，也是细胞内产生的一种代谢产物。
因此，研究斑马鱼体内的过氧化氢含量对于了解其生物学过程具有重要意义。
本文将介绍一种基于斑马鱼的组织过氧化氢检测方法。
我们需要准备实验材料和设备。
实验所需材料包括：斑马鱼样本、30%过氧化氢溶液、PBS缓冲液、DAB显色液、过氧化氢酶和显微镜玻片。
实验所需设备包括：离心机、显微镜和显微针。
接下来，我们将详细介绍该方法的步骤。
第一步，收集斑马鱼样本。
选择需要研究的斑马鱼个体，将其放入含有PBS缓冲液的离心管中，用离心机离心10分钟，将斑马鱼体内的过氧化氢溶液剥离出来。
第二步，制备过氧化氢酶溶液。
将适量的过氧化氢酶溶解在PBS缓冲液中，制备成适当浓度的过氧化氢酶溶液。
第三步，处理斑马鱼样本。
将离心管中的斑马鱼样本液均匀地滴在显微镜玻片上，用显微针轻轻地涂抹样本液，使其均匀分布在玻片上。
第四步，加入过氧化氢酶溶液。
在斑马鱼样本液上滴加适量的过氧化氢酶溶液，使其均匀覆盖在样本液上。
第五步，加入DAB显色液。
将适量的DAB显色液滴在样本液上，使其充分接触。
第六步，观察显色反应。
将显微镜对焦在斑马鱼样本液上，观察显色反应的情况。
过氧化氢与DAB显色液发生反应后会产生棕色的沉淀物，该沉淀物的浓度与样本中的过氧化氢含量成正比。
通过观察斑马鱼样本液上的显色情况，我们可以初步了解斑马鱼体内过氧化氢的含量。
在实际应用中，可以通过比较不同样本的显色程度，或者使用专业的图像分析软件对显色结果进行定量分析，从而得到更准确的过氧化氢含量。
需要注意的是，在进行实验过程中，应遵守实验室的安全操作规范，避免对人身和环境造成危害。
此外，为了减少实验误差，每个步骤都应该严格控制条件，并进行多次重复实验来验证结果的可靠性。
总结一下，本文介绍了一种基于斑马鱼的组织过氧化氢检测方法。
斑马鱼卵子中母源性补体成分的检测及溶菌活性研究
取适量斑马鱼卵子胞浆，加入 SDS 上样缓冲液， 煮沸 5 min，冷却后进行 12% SDS-PAGE 电泳。经转 膜、5% 脱脂奶粉封闭后，分别与兔抗人 C3 多克隆抗 体和山羊抗人 Bf 多克隆抗体杂交，再分别加入辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔 -Ig（北京中杉金桥生物工 程有限公司）和兔抗山羊 -Ig（武汉博士德生物工程 有限公司），按照增强型 HRP-DAB 底物显色试剂盒 （Tiangen 生物技术有限公司）的说明进行显色。对 照组以人炎症血清（青岛大学医学院附属医院提供） 代替斑马鱼卵子胞浆。 1.8 数据处理
1 材料与方法
1.1 化学试剂 细 菌 级 琼 脂 粉、酵 母 提 取 物、蛋 白 胨 均 购 自
OXOID（Japan），乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇双（2氨基乙基）四乙酸（EGTA）、牛血清白蛋白（BSA）和 考马斯亮蓝 G-250 购自 Sigma（USA），其他化学试剂 均为国产分析纯试剂。 1.2 大肠杆菌的培养及处理
目前已在虹鳟的胚胎中检测到了母源性补体成分 C3、C4、C5 和 Bf［15］，而且在鲤和斑点狼鱼（Anarhichas minor Olafsen）的胚胎中也检测到了母源性补体 C3 的 转 录［14，16］。 此 外，Løvoll 等［18］还 发 现 大 西 洋 鲑 （Salmo salar）的胚胎匀浆液具有微弱的补体活性。
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本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断斑马鱼（Zebrafish）半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48pmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：最低检测浓度小于1.0pmol/L。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月免责声明1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. Zebrafish Caspase3(Casp-3)ELISA Kit instruction Intended useThis Casp-3ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at450nm using a spectrophotometer.In order to measure the concentration of Casp-3in the sample, this Casp-3ELISA Kit includes a set of calibration standards.The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus Casp-3concentration.The concentration of Casp-3in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Sample collection and storagesSerum-Use a serum separator tube and allow samples to clot for30minutes before centrifugation for10minutes at approximately3000×g.Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles Plasma-Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant.Centrifuge samples for30minutes at3000×g at2-8℃within30minutes of collection.Store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Cell culture supernates and other biological fluids-Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or -80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Note:The samples shoule be centrifugated dequately and no hemolysis or granule was allowed.Materials required but not supplied1.Standard microplate reader(450nm)2.Precision pipettes and Disposable pipette tips.3.37℃incubatorPrecautions1.Do not substitute reagents from one kit to another.Standard,conjugate and microplates are matched for optimal e only the reagents supplied by manufacturer.2.Do not remove microplate from the storage bag until needed.Unused strips should be stored at2-8°C in their pouch with the desiccant provided.3.Mix all reagents before using.Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature(20-25°C)Materials suppliedName96determinations48determinations Microelisa stripplate12*8strips12*4stripsStandard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubesSample Diluent 6.0ml 3.0mlHRP-Conjugate reagent10.0ml 5.0ml20X Wash solution25ml15mlChromogen Solution A 6.0ml 3.0mlChromogen Solution B 6.0ml 3.0mlStop Solution 6.0ml 3.0mlClosure plate membrane22User manual11Sealed bags11Standard(S0→S5)concentration was followed by:0,3,6,12,24,48pmol/L Reagent preparation20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water1:20.Assay procedure1.Prepare all re a g e n t s before starting assay procedure.It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.2.Add standard:Set Standard wells,testing sample wells.Add standard50μl to standard well.3.Add Sample:Add testing sample10μl then add40μl of Sample Diluent to testing sample well;Blank well doesn’t add anyting.4.Add100μl of HRP-conjugate reagent to each well,c over with an adhesive strip and incubate for60minutes at37°C.5.Aspirate each well and wash,repeating the process four times for a total of five washes.Wash by filling each well with Wash Solution(400μl)using a squirt bottle, manifold dispenser or plete removal of liquid at each step is essential to good performance.After the last wash,remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting.Invert the plate and blot it against clean paper towels.6.Add chromogen solution A50μl and chromogen solution B50μl to each well. Gently mix and incubate for15minutes at37°C.Protect from light.7.Add50μl Stop Solution to each well.The color in the wells should change from blue to yellow.If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform,gently tap the plate to ensure thorough mixing.8Read the Optical Density(O.D.)at450nm using a microtiter plate reader within 15minutes.Calculation of results1.This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample.The standard curve is generated by plotting the average O.D.(450nm) obtained for each of the six standard concentrations on the vertical(Y)axisversus the corresponding concentration on the horizontal(X)axis.2.First,calculate the mean O.D.value for each standard and sample.All O.D.values,are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation.Construct the standard curve using graph paper or statistical software.3.To determine the amount in each sample,first locate the O.D.value on theY-axis and extend a horizontal line to the standard curve.At the point of intersection,draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding concentration.4.Any variation in operator,pipetting and washing technique,incubation time ortemperature,and kit age can cause variation in result.Each user should obtain their own standard curve.5.The sensitivity by this assay is1.0pmol/L6.Standard curve Storage：2-8℃.validity：six months.FOR RESEARCH USE ONLY;NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS!PLEASE READ THROUGH ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!。