第六章 大肠杆菌基因工程
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大肠杆菌基因工程
法
大肠杆菌作为受体的特征
• 优点 遗传背景清楚，生长迅速，培养简单， 重组子稳定，载体受体系统完整
• 缺点 结构复杂、长生多种种类的内毒素
谢谢观看
05
目的基因的表达 与筛选
04
受体细胞的增值
目的基因获取
通过dna合成仪用 化学方法合成
表达载体的构建
• • • • •
外源基因在大肠杆菌中高效表达原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
将目的基因导入受体细胞
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 建（人胰岛素原表达法）
基因工程菌的构建战略：
ta c Me t b-
转 化
Ap
r
Gal Me
B t Cpeptide Apeptide peptide
分离纯
M N M
ori
化
C
人胰岛素原的
cDNA
重组人胰岛素
原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 人胰岛素原表达 建
核糖体结合位点
• 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
• 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即 Shine-Dalgarno （SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，
大肠杆菌基因工程菌构建
• 包涵体型异源蛋白的表达
• • • • • 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
大肠杆菌工程菌构建
这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利 用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、 稳定、快速表达。
大肠杆菌基因工程
ori
转化 分离纯化 M N CNBr 处理 M C
化学合成AB链编码序列 化学合成 链编码序列 体外折叠 重组人胰岛素 特异性裂解
生产技术的评价： 生产技术的评价：
由于A链和 链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键 由于 链和B链上共存在六个半胱氨酸残基 链和 链上共存在六个半胱氨酸残基， 的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工 的正确配对率较低，通常只有 ， 艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 美元以上。 艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达 美元以上 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立 为了进一步降低生产成本，美国 公司随后又建立 了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。 了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 批准为安全的基因工程受体生物 被美国
上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶 上述思路的技术路线是： 为 的有机相中使胰蛋白酶 催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰 催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下， 苏氨酸叔丁酯的存在下 岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再 末端的丙氨酸交换下来， 人胰岛素叔丁酯再 岛素 链 末端的丙氨酸交换下来 所形成的人胰岛素叔丁酯 用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。 三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。 该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作 ，但工艺路线耗时， 该过程的总转化率为 复杂，产品的价格不菲。 复杂，产品的价格不菲。
转化 分离纯化 M N CNBr 处理 M C
化学合成AB链编码序列 化学合成 链编码序列 体外折叠 重组人胰岛素 特异性裂解
生产技术的评价： 生产技术的评价：
由于A链和 链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键 由于 链和B链上共存在六个半胱氨酸残基 链和 链上共存在六个半胱氨酸残基， 的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工 的正确配对率较低，通常只有 ， 艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 美元以上。 艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达 美元以上 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立 为了进一步降低生产成本，美国 公司随后又建立 了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。 了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 批准为安全的基因工程受体生物 被美国
上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶 上述思路的技术路线是： 为 的有机相中使胰蛋白酶 催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰 催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下， 苏氨酸叔丁酯的存在下 岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再 末端的丙氨酸交换下来， 人胰岛素叔丁酯再 岛素 链 末端的丙氨酸交换下来 所形成的人胰岛素叔丁酯 用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。 三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。 该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作 ，但工艺路线耗时， 该过程的总转化率为 复杂，产品的价格不菲。 复杂，产品的价格不菲。
第六章第二节基因工程及其应用
AATTCCGTAG GGCATCTTAA
甲片段
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA GGGATT
磷酸二酯键
乙片段
特点：连接不同DNA分子的相同末端（由 同种限制性内切酶切割）。
氢键： 切割——解旋酶；连接——DNA聚合酶 磷酸二酯键： 切割——限制性核酸内切酶；连接——DNA连接酶
氢键 （梯子的踏板）
磷酸二酯键 （梯子的扶手）
（一）基因操作的工具 • 基因的运载工具——运载体： 运载体的作用？
作用一：将目的基因(抗虫基因)送到受体细胞(棉花 细胞)中。
作用二：在受体细胞(棉花细胞)内，能大量复制。
• 基因的运载工具——运载体：
常用的运载体主要有两类：
1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
1、下列各项中，说明目的基因完成了表达的是
A、棉珠中含有杀虫蛋白基因 B、大肠杆菌中具有胰岛素基因 C、酵母菌中产生了干扰素 D、抗病毒基因导入土豆细胞中
C
2、要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶 是 A
①限制酶
Ａ、①②
②连接酶
Ｂ、③④
③解旋酶
Ｃ、①④
④还原酶
Ｄ、②③
3、有关基因工程的叙述中，错误的是
Ａ、高效性 Ｃ、多样性 Ｂ、专一性 Ｄ、催化活性易受外界影响
5、基因工程的正确操作步骤是 C ①使目的基因与运载体结合 ②将目的基因导入受体细胞 ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因 Ａ、③②④① Ｃ、④①②③ Ｂ、②④①③ Ｄ、③④①②
6、不属于基因工程方法生产的药物是
C
A、干扰素
减少农药的用量，降低了生产 的成本，减少了农药对环境的污染。
甲片段
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA GGGATT
磷酸二酯键
乙片段
特点：连接不同DNA分子的相同末端（由 同种限制性内切酶切割）。
氢键： 切割——解旋酶；连接——DNA聚合酶 磷酸二酯键： 切割——限制性核酸内切酶；连接——DNA连接酶
氢键 （梯子的踏板）
磷酸二酯键 （梯子的扶手）
（一）基因操作的工具 • 基因的运载工具——运载体： 运载体的作用？
作用一：将目的基因(抗虫基因)送到受体细胞(棉花 细胞)中。
作用二：在受体细胞(棉花细胞)内，能大量复制。
• 基因的运载工具——运载体：
常用的运载体主要有两类：
1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
1、下列各项中，说明目的基因完成了表达的是
A、棉珠中含有杀虫蛋白基因 B、大肠杆菌中具有胰岛素基因 C、酵母菌中产生了干扰素 D、抗病毒基因导入土豆细胞中
C
2、要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶 是 A
①限制酶
Ａ、①②
②连接酶
Ｂ、③④
③解旋酶
Ｃ、①④
④还原酶
Ｄ、②③
3、有关基因工程的叙述中，错误的是
Ａ、高效性 Ｃ、多样性 Ｂ、专一性 Ｄ、催化活性易受外界影响
5、基因工程的正确操作步骤是 C ①使目的基因与运载体结合 ②将目的基因导入受体细胞 ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因 Ａ、③②④① Ｃ、④①②③ Ｂ、②④①③ Ｄ、③④①②
6、不属于基因工程方法生产的药物是
C
A、干扰素
减少农药的用量，降低了生产 的成本，减少了农药对环境的污染。
大肠杆菌的基因工程分析和介绍
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
大肠杆菌的分子生物学研究
大肠杆菌的分子生物学研究大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是一种广泛应用的模式生物。
在分子生物学研究中，大肠杆菌常常被用作基因工程、蛋白质表达、靶标鉴定等方面的实验材料。
本文将从大肠杆菌分子生物学的视角出发，讲解大肠杆菌相关研究的现状和未来发展方向。
一、大肠杆菌基因组分析对大肠杆菌基因组的分析是分子生物学研究的重要方向之一。
大肠杆菌的基因组长度约为5.5Mb，含有4140个基因。
这些基因可以分为两类：编码蛋白质的基因和编码RNA的基因。
编码蛋白质的基因中，有大约20%的基因是没有已知的功能的，这也是当前研究的重点之一。
大肠杆菌基因组的分析可以通过多种方法实现，包括测序、比较基因组学和功能基因组学研究等。
测序技术是目前最常用的方法，可以得到大肠杆菌基因组的序列信息。
比较基因组学研究则是通过比对大肠杆菌与其他物种的基因组序列，找出它们之间的相同点和不同点，从而了解它们的进化关系。
与之相对应的是功能基因组学研究，它主要关注在基因组层面揭示组织和细胞的功能，包括基因表达分析、蛋白质互作网络研究、代谢通路分析等等。
二、大肠杆菌基因工程研究大肠杆菌基因工程研究是分子生物学研究的另一大方向。
大肠杆菌可以通过基因工程方式来改变其基因结构，从而实现一系列人工合成目的。
例如，利用大肠杆菌来表达蛋白质，就是目前最常用的方法。
首先在大肠杆菌中克隆目标基因，然后将其引入大肠杆菌，最终通过大肠杆菌自身的蛋白质合成机制来合成目标蛋白质。
在基因工程研究方面，重要的工具是质粒。
质粒是一种小而独立的DNA分子，自己携带一些基因，以此与大肠杆菌分子结合，将需要改变的DNA分子或遗传信息被“载入”到大肠杆菌中。
质粒大小一般为1-200kb，基因工程中，通常先将目标基因插入质粒中，再将质粒通过易于使用的接种操作引入大肠杆菌菌体中。
这种基因工程技术可被应用于许多生物医学领域或工业制造方案。
三、大肠杆菌蛋白质结构研究大肠杆菌蛋白质结构研究也是目前分子生物学研究的热点之一。
2020秋季 基因工程 第6章 大肠杆菌基因工程 第2节
3. 提高重组蛋白可溶性的策略
原理 控制表达速率 融合表达
分泌表达 促进正确折叠
增加可溶表达手段 低温诱导、降低IPTG浓度 融合溶解性高的标签： GST：谷胱甘肽转移酶 MBP：麦芽糖结合蛋白 通过连接信号肽将重组蛋白在细胞周质表达，胞外分泌 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
4. 融合型表达
⑤表达结果的检测
十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 检测
表达情况
菌液
离心（5000转/分钟，10分钟）
裂解，离心
菌体
13000转/分钟，10分钟
悬菌，超声波或高压破碎 （13000转/分钟，10分钟）
全细胞蛋白
沉淀 上清液 不可溶蛋白组分 可溶蛋白组分
蛋白质 诱导 诱导 上 沉 分子量 前全 后全 清 淀 标准品 细胞 细胞 液
Amp His·Tag /Kan
种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。
Amp His·Tag 同pET系统
• 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间 构象和生物活性
• 药用目蛋白还会导致免疫反应
• 融合标签去除办法：通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割 位点或化学试剂特异性断裂位点，在体外从纯化的融合蛋白分子中 将其去除。
大肠杆菌分泌表达的信号肽： • 一般来自大肠杆菌的外膜蛋白信号肽：如存在于多数革兰氏阴性细菌的高
丰度外膜蛋白（outer membrane protein）：OmpA 、OmpF；λ噬菌 体受体LamB、热稳定肠毒素STⅡ。 • 大肠杆菌周质蛋白：如碱性磷酸酶PhoA、麦芽糖结合蛋白MBP等；金黄 色葡萄球菌蛋白A和胡萝卜软腐欧文氏果胶酶裂解酶(PelB) 的信号肽。
大肠杆菌基因工程2011
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
基底水平转录
进Plac介导的转录。葡萄糖
代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的 6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，
即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体
上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因
第六章 大肠杆菌基因工程[可修改版ppt]
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ori
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将 mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
大肠杆菌基因工程人胰岛素
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
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胰岛素AB链分别表达法的基本原理
人胰岛素原表达法
2 将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳 糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍 为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中 高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取 溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后 将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素 原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3 对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得 体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物 活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必 须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的 A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种 克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以 及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。 经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白， 再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融 合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
人教版生物必修二第六章第二节-基因工程及其应用
(2)其他品种：
抗烟草花叶病 毒转基因甜椒
转基因水稻
含大量维生素的 转基因玉米
抗癌抗衰老的紫色 西红柿
上为转基因鲑鱼，下为普通 转入外源生长激素基因的“超级
的鲑鱼
小鼠”
2. 基因工程与药物研制
(1)胰岛素的生产
方法
特点
胰岛素
传统 猪和牛的胰腺 产量低价 4-5g/100kg胰
方法 中获得胰岛素 格昂贵
第六章 从杂交育种到基因工程 第2节 基因工程及其应用
一、问题探讨
为什么大肠杆菌会产生人的胰 岛素呢？这是怎么做到的？
转入人胰岛素基因的大肠杆菌 人体细胞
大肠杆菌
二、基因工程的原理 1. 概念：又叫__基__因__拼__接__技___术__或DNA重组技术。 通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取 出来，加以_修__饰__改__造___，然后放到另一种生物的细胞里，定___向___ 地改造生物的性状。 解读：①操作对象：_基__因_____。 ②操作水平：_D_N__A__分__子__水__平__。 ③操作环境：_主__要__在__生__物___体__外_。 ④结果：_定__向___的__改__造__生__物___的__性__状__，___获__得__人__们__意___愿__的__产__品___。_____。
作用
模板 相同点
DNA连接酶
DNA聚合酶
将2个DNA片段形成一 将一个个的脱氧核苷酸
个完整的DNA分子
聚合成一条长链
不需要
需要
都能形成__磷__酸__二___酯__键_____；本质都是__蛋__白___质__。
例题．下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用 部位，则相应的酶依次是( )
基因工程 第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达
Ecoli DNA
2.无启动子的CAT质粒载体 CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发 乙酰辅酶A
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定
薄层层析 放射自显影
3.使用tetr作报告基因分离功能启动子
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的 寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现 有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于 批量生产。
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系的不足 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有 具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。
筛选Apr、Tcs的转化子
3.核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转 录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起 始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分 子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数 百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
基地水平转录
阻遏蛋白
乳糖启动子Plac的可控性 野生型的Plac与 其控制区Olac偶联 在一起，在没有诱 导物存在时，整个 操纵子处于基底水 平表达；诱导物可 以使启动子Plac介 导的转录大幅提高 P
乳糖 异丙基β－ D硫代半乳糖苷 IPTG
O
诱导
高效转录
大肠杆菌基因工程
少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低
第18页，共88页，编辑于2022年，星期日
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始
密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的
终止密码子
Apr
pKO1
galK
ori
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
第6页，共88页，编辑于2022年，星期日
启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA
Ptrp Plac
Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA
第17页，共88页，编辑于2022年，星期日
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，
翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提 条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中
激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另 一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源 基因高效表达的制约作用
第23页，共88页，编辑于2022年，星期日
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个 拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代 谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体 细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
第18页，共88页，编辑于2022年，星期日
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始
密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的
终止密码子
Apr
pKO1
galK
ori
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
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启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA
Ptrp Plac
Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA
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核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，
翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提 条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中
激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另 一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源 基因高效表达的制约作用
第23页，共88页，编辑于2022年，星期日
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个 拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代 谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体 细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
大肠杆菌基因工程资料79页PPT
大肠杆菌基因工程资料
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
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核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区
溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和
Plac
O
高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5 Plac UV5 O
启动子
启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 阻遏蛋白 色氨酸 基底水平转录
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
6 大肠杆菌基因工程
C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达
分泌型异源蛋白的表达
融合型异源蛋白的表达
寡聚型异源蛋白的表达
整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它
们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不
质粒拷贝数
质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60 在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600 在此温度下，受体细胞染色体上的CI基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达
Apr MCS
PL
pCP3
ori
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，
即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将
启动子
启动子最佳距离的探测
E
A
目的基因
E
目的基因 E E 启动子
A 酶切开
Bal31酶解
启动子
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK 终止密码子
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
P
O
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效
率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱
基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而
CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻
AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
细胞内tRNA的含量
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程
大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高
效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略
可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
基底水平转录
进Plac介导的转录。葡萄糖
代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动
6 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
6 大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子
终止子
核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
Apr
pCP1
ori
筛选Apr、Tcs的转化子
组DNA中克隆筛选
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的
频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大
肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体
上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P
位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率响
外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适
宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在
大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
同步表达相关tRNA编码基因 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分 子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对
Tcr
于一些终止作用较弱的终止子，通常
可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑
生物工程专业核心课程
基因工程
华东理工大学 张惠展
基因工程
1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因因工程 8 哺乳动物基因工程
9 高等植物基因工程
6 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：