PCR技术上岗培训

PCR技术

PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的 发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就 因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相 关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体 （现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因 诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药 品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临 床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入 疾病诊断的常规技术。
标准的PCR过程分为三步
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的 活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增 加一倍。
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物 一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直 接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR技术上岗培训
疾病的诊断
临 分子诊断
影象学 诊断
细胞/组 织诊断
免疫诊断
床
诊
生化诊断
断
几乎所有的疾病都是基因病

科学研究已证明，基因可以揭示疾病的 本质，人类几乎所有疾病都直接或间接 与基因有关，在某种意义上都是基因病，
PCR技术

1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一 种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定 DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反 应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR 可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说, 仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR 可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量 特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性， 可用于微量核酸样品的检测。
荧光PCR检测技术简介 荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光 标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出 荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信 号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出 目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测 相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到 定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污 染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技 术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代 表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了 方便之门，现已得到广泛应用。
PCR的假阴性和假阳性产生原 因


假阴性：操作不当，试剂质量差（包括 引物和探针设计不当）或过期、仪器设 备不准确 假阳性：几乎均由污染所致
实时荧光PCR结果判读
荧光PCR试剂盒检测结果
荧光域值（threshold）的设定
PCR反应管的前15个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，即： threshold=10×sd cycle6-15.荧光域值设 定在PCR扩增的指数期。
Ct值
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念— Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含 义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时 所经历的循环数。个模板的Ct值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越小，起 始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此， 只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上 算出该样品的起始拷贝数。
荧光标记

荧光发光是通过激发光激发荧光基团到 达高能量状态,而后产生发射光。常用的 有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白 DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报 告基团
探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5 标记探针 淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯 基）苯甲酸（DABCYL）
影响分子信标的主要因素


分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响 分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团 与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。 另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较 低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温 度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸 展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而 发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温 度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度
PCR诊断试剂质量控制要点
1、酶活性测定 2、引物序列的确定 3、PCR加样区、扩增区、检测区应严格分 开 4、选择特异、敏感及简单快速的PCR产物 检测方法
5、DNA聚合酶的活性及稳定性能达到一定 的要求，并有固定的来源 6、PCR产物检测方法要尽可能的可靠、快 速方便 7、PCR试剂盒的检定人员应进行专门的培 训
CR反应特点

特异性强 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待 测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的 检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个 细菌。

简便、快速
荧光定量PCR室内质控程序


每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人 姓名是否符合。 编完化验单号后，在对血标本进行编号时要仔细核对化验单的 病人姓名与标本管上的姓名，不得有误。 每次试验中，须同时测定1份阴性对照与一份质控品。 首次制作质控图时（新批号开始时），采用“即刻法”质控方 法，具体步骤如下：
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基 偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
将连续的质控测定值从小到大排列，即X1，X2，……XN 计算均值(X)和标准差(S) 按下述公式计算SI上限和SI下限

SI上限=(X最大值-X均值)/2 SI下限=(X均值-X最小值)/2
PCR定量为何要设内参照？
影响PCR定量的主要原因有1、反应效率的差异： 可能为反应体系和PCR扩增仪的工作状态所致。由于 PCR产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相 差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设 内对照，使参照基因在同一反应管内进行PCR扩增， 起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样 会影响两种模板。2、终产物浓度的影响：终产物浓度 达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入 平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定 PCR反应周期后间隔测定PCR终产物的浓度。
PCR诊断试剂生产管理要点
1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、 分装的隔离实验室 2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开 3、专用原材料 PCR引物的设计要合理、合适，引物的合 成要有固定的地方和设备，纯度能到达 一定标准
荧光定量PCR试剂的质量检查 操作程序



每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等， 试剂运输过程中有无冷冻保存，如有异常，及时与厂家联系。 内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以 及是否有使用说明书等。 试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清1 份，并稀释至10拷贝数，用新试剂检测，计算出灵敏度。 试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的 血清1份，用新试剂稀释平行检测10次，计算出SD，CV%。 CV%应在<30%。 试剂的特异性：取临床标本10份（包括：低拷贝、高拷贝、阴 性、高黄疸的标本各2份），用新试剂检测，用于考察试剂的 特异性。