井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化

２００８年８月第４５卷第４期四川大学学报（自然科学版）ＪｏｕｎｌａｌｏｆＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）Ａｕｇ．２００８Ｖｄ．４５Ｎｏ．４文章编号：０４９０．６７５６（２００８）０４．０９６３．０４井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化廖晓殉，陶科，侯太平（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）摘要：本研究以一株能产生井冈霉素的吸水链霉菌井冈变种（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｒｏｓｃｕｐｉｃｕｓｖａｔ．Ｊｉｎｇｇａｎｇｇｅｎｓｉｓｙｅｎ）ｊ１为研究对象，通过紫外线（Ｕｖ）及硫酸二乙酯（ＤＥＳ）两次诱变，经平皿初筛，摇瓶复筛，获得茵株儿．Ｕ．Ｄ，效价达２５８７４×１０～ｇ／ｍＬ，比出发菌株提高２９％．菌株经过５次传代，代间效价差异不明显，遗传性能较稳定．通过单因素实验和正交实验分析研究了摇瓶产井冈霉素的最适发酵培养基，该茵的最适发酵培养基为（％）：淀粉１２％、酵母粉４％、ＫＨ２Ｐ０４０．０５％、ＮａＣｌ０．１５％．最适发酵条件为：发酵起始ｐＨ值７．２，接种量８％，发酵温度３７℃，发酵时间９６ｈ．茵株最终效价达３０６１０×１０一ｇ／ｍＬ，比出发茵株提高５３％．关键词：井冈霉素；茵种选育；物理化学诱变；发酵条件中图分类号：Ｑ９３文献标识码：ＡＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆａｊｉｎｇｇａｎｇｍｙｃｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓＬＭ０Ｘｉａｏ－Ｘｕｎ，ＴＡＯＫｅ，ＨＯＵＴａｉ—Ｐｉｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏ－ＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｃＤＥｎｖｉｒｏｎｍｅａａｔ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００６４，ｃｒａｍ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｓｔｒａｉｎｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｒｏｓｃｕｐｉＣＵ￥Ｖａｒ．Ｊｉｎｇｇａｎｇｇｅｎｓｉｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙ吖ｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄＤＥＳ鸽ｍｕｔａｇｅＤ．ｓ．Ｏｎｅｊｉｎｇｇａｎｇｒｎｙｃｉｎｈｉｇｈ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｒｏｓｃｕｐｉ一５５ｖａｔ．Ｊｉｎｇｇａｎｇｇｅｎｓｉｓ，Ｊ１一Ｕ－ＤＷｆｌＳｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｙｉｅｌｄｓｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓ２５８７４×１０一ｇ／ｍＬ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２９％ｔｈａｎｔｈｅｓｔａｒｔｓｔｒａｉｎ．Ｉｔ’Ｓｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｉｇｈｌｙｐｒｏｄｕｃｉｎｇｊｉｎｇｇａｎｇｍｙｃｉｎｒｅｍａｉｎｅｄｓｔａｂｌｅａｆｔｅｒｆｉｖｅｔｉｍｅｓ．劢ｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｅｄｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｆａｅｃｕｌａ１２％、ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ４％、ＫＨ２Ｐ０４０．０５％、ＮａＣｌ０．１５％．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｓｂｅｌｏｗ・ｐＨ７．２ｂｅｆｏｒｅｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ．ｉｎｏｅｕ—ｌａｔｅｄｖｏｌｕｍｅ８％，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３７℃，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ９６ｈ．Ａｎｄｔｈｅｆｉｎａｌｙｉｅｌｄｓｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓ３０６１０×１０一ｇ／ｒｎＬ．ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ５３％ｔｈａｎｔｈｅｓｔａｒｔｓｔｒａｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｊｉｎｇｇａｎｇｍｙｃｉｎ，ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎ，ｐｈｙｓｉｏｅｈｅｍｉｅａｌｍｕｔａｇｅｎｓ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ１引言茎鼍琶萎盏震嵩毳筹篙喜塞蒜农用抗生素是微生物产生的重要次级代谢产几十年来相继开发出“５４０６”菌株、井冈霉素、农抗物之～，可用于农业上有害生物的防治．按其作用１２０、武夷霉素、浏阳霉素、阿维菌素等一大批农用收稿日期：２００７－０４．０２；修回日期：２００７．０５．２１作者简介：廖晓殉（１９８１一），男，四川自贡，２００４级硕士研究生，主要研究领域为微生物农药．通讯作者：侯太平．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｕｔｐ＠ｔｏｍ．∞ｍ四川大学学报（自然科学版）第４５卷抗生素［１，２１．井冈霉素是一株在井冈山地区发现的微生物菌株所产生的农用抗生素．对防治水稻纹枯病具有特效，也可用于水稻稻瘟病，小麦纹枯病的防治［３】３．此外，井冈霉素还被推广到其他作物的病菌害防治上．虽然井冈霉素发现至今已有３０余年，但因其高效，低毒，对环境友好，以及尚未发现抗药性［４Ｉ，深受广大农户的欢迎．如何提高井冈霉素工业生产水平是一直受重视的问题，选育高产菌株更是一种有效的手段，传统的诱变育种方法是获得高产突变株，提高和保持生产水平的基本措施之一，多年来一直应用于微生物工业中．此外，发酵培养基及培养条件的优化也是提高工业生产水平的有效手段之一．本文主要报道通过紫外线（ＵＶ）和硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变对井冈霉素产生菌Ｊ１进行选育，以及发酵培养基与发酵条件的优化等研究结果．２材料和方法２．１材料２．１．１茵种吸水链霉菌井冈变种（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｒｏｓｃｕｐｉｃｕｓ，ｃａｒ．Ｊｉｎｇｇａｎｇｇｅｎｓｉｓｙｅｎ）、水稻纹枯病菌（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａｓａｓａｋｉｉ）均由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室提供．２．１．２培养基试管斜面、孢子活化培养基：高氏Ｉ号培养基［５】５．基础发酵培养基（％）：米粉９．０，黄豆饼粉３．０，ＫＩ－１２Ｐ０４０．１，Ｎａａ０．１５，ｐＨ６．７．２．１．３井冈霉素标样井冈霉素标样由上海农药所提供．２．２方法２．２．１诱变方法首先制备单孢子悬液，将孢子浓度调整为１０８个／ｍＬ．紫外线诱变［６】：取出发菌株Ｊ１的单孢子悬液，加人放有无菌搅拌棒的的培养皿中，置于磁力搅拌器上，调整培养皿至紫外灯距离为３０ａ１１．打开皿盖，开启磁力搅拌器恒速搅拌，紫外灯（波长２５４ｎｍ）下分别照射０ｓ、３０ｓ、６０ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓ、１８０ｓ，将照射后的孢子悬液做梯度稀释后涂板避光培养．ＤＥＳ诱变［７】：在紫外诱变的正变菌株中选取效价较高的菌株进一步进行ＤＥＳ诱变．取新鲜制备的出发菌株的孢子悬液５ｍＬ，加入ＤＥＳ０．０４ｍＬ，再加入０．１ｍｏｌ／ＬｐｉＴ／．０的磷酸缓冲液１５ＩＴｌＬ，于３７℃，２００ｒ／ｒａｉｎ摇床上分别处理０．２ｈ，０．５ｈ，１．５ｈ和６ｈ后，加入２％Ｎａ２Ｓ０３终止诱变，将处理后的孢子悬液梯度稀释后涂板避光培养．２．２．２效价的测定初筛时效价的测定：检定菌为水稻纹枯病菌…．复筛时效价的测定：按照井冈霉素水剂国家标准（ＧＢ们５５３．９３），上高效液相色谱（｝Ⅱ，ＬＣ）测定其效价［８］８．２．２．３井冈霉素效价的计算（唧ＬＣ法Ｌ９Ｊ按照井冈霉素水剂国家标准（ＧＢ们５５３—９３），井冈霉素Ａ采用液相色谱法测定，试样经５００倍稀释，使用ＯＤＳ－Ｃ１８色谱柱，紫外检测器，对井冈霉素进行分离，以外标法峰面积定量．计算得到井冈霉素的效价．２．２．４遗传稳定性实验将诱变产生的高产菌株在斜面上连续传代５次，检测其代间效价．３结果与分析３．１菌株选育结果３．１．１紫外线诱变以Ｊ１为出发菌株，进行紫外线诱变，从表１可以看出，随着诱变时间的增加，菌株的致死率不断提高．当诱变时间为３０Ｓ时，菌株的致死率为８１％，正变率为２１％．因此选择在３０Ｓ下对菌株进行诱变处理．紫外诱变后，平板初筛出７３株正变菌株进行摇瓶发酵复筛实验．通过效价检测，复筛得到３株效价较好的菌株，进行ＤＥＳ诱变．表１诱变时间对致死率及正变率的影响Ｔａｂ．１ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎＦａｔａｔｌｉｔｙｒａｔｅａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅ诱变时间（ｓ）０３０６０９０１２０１５０１８０致死率（％）０８１８３８７踞８９９３正变率（％）０２１１５１０５４０３．１．２ＤＥＳ诱变由表２可以看出，ＤＥＳ对菌株具有强烈的致死作用，ＤＥＳ处理０．２ｈ，致死率即表２Ｏ．２％Ｄ璐处理时间对致死率的影响Ｔａｂ．２ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎＦａｔａｔｌｉｔｙｒａｔｅｏｆ０．２％ＤＥＳ达９２．３％，但是随着时间的变化，致死率的增加却第４期廖晓殉等：井冈霉素产生茵的诱变选育及发酵条件优化９６５不大．选择在３０ｓ下对菌株进行诱变处理．通过ＤＥＳ再次诱变，选育得到高产菌株Ｊ１．Ｕ．Ｄ，效价为２５８７４Ｘ１０一ｇ／ｍＬ．３．１．３稳定性实验将高产菌株ｊ１．Ｕ－Ｄ在斜面培养基上连续传代五次，测定其效价，发现其效价为２５１８７Ｘ１０一ｇ／ｍＥ，具有良好的遗传稳定性．３．２发酵条件优化・３．２．１不同碳、氮源对Ｊ１一Ｕ－Ｄ产井冈霉素能力的影响采用６种碳源取代基础发酵培养基中的碳源米粉，结果见表３．由表３可以看出，使用淀粉作为碳源时效价最高，达２８０９０Ｘ１０～ｇ／ｍＬ．表３单因素碳源选择使用结果Ｔａｂ．３ＥｆｆｅｃｔｏｆｓｉｎｇｌｅｃａｒｂｏｎｓＤ｜山脱０ｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＪｉｎｇｇａｎｇｍｙｃｉｎ进一步采用６种氮源取代基础发酵培养基中的氮源黄豆饼粉，由表４可以看出，使用有机氮源更有利于菌体生产及产素，其中，使用酵母粉作为氮源时效价最高，达２７０７６Ｘ１０一ｇ／ｍＬ．表４单因素氮源选择使用结果Ｔａｂ．４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｉｎｇｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎ８ｏ｜峨ｅＯｉｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＪｉｎｇｇａｎｇｒｎｙｃｉｎ３．２．２培养基起始ｐＨ值对Ｊ１一Ｕ－Ｄ产井冈霉素能力的影响为了比较不同的起始ｐＨ值对井冈霉素产素能力的影响，采用不同ｐＨ值的缓冲溶液配制发酵培养基，结果如图１所示，在ｐＨ为７．２时，菌株的产素能力最强，ｐＨ值偏高或偏低都不利于产素。

因此选择ｐＨ７．２作为培养基的起始ｐＨ值．５．６６．０６．４６．８７．２ｐＨ图１培养基ｐＨ值对化学效价的影响Ｆｉｇ．１ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｉｔｉａｌｐＨｉｎｍｅｄｉｕｍｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｐｏｔｅｎｃｙ３．２．３培养温度对儿一Ｕ－Ｄ产井冈霉素能力的影响将发酵培养基接种后分别置于３３℃、３５℃、３７℃、３９℃、４１℃下摇瓶培养，结果见表５．由表５可以看出，在温度为３７℃时，菌体的产井冈霉素能力最强．表５培养温度对化学效价的影响Ｔａｂ．５ＥｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｐｏｔｅｎｃｙ培养温度（℃）化学效价（Ｘ１０“ｇ／ｍＬ）３３３５３７３９４１２０６３５２３３５６２５８７４２４３６７２４０３２３．２．４种龄及接种量对Ｊ１一Ｕ．Ｄ产井冈霉素能力的影响分别取６０ｈ、７２ｈ、８４ｈ、９６ｈ不同种龄的液体种子进行试验，结果发现，菌株产井冈霉素的能力与种龄成正比．将９６ｈ液体种子以不同接种量接入发酵培养基进行试验，结果表明，８％的接种量最有利于井冈霉素的产生．３．２．５正交试验设计选用Ｌ９（３４）表对发酵培养基成分淀粉，酵母粉，ＫＨ２Ｐ０４，ＮａＣＩ四个因素设计正交试验．根据正交试验结果，得到其最适发酵培养基：１２％淀粉、４％酵母粉、０．０５％ＫＨｚＰ０４、０．１５％ＮａＣＩ，化学效价达到２９４６３Ｘ１０一ｇ／ｍＬ．根据极差分析，淀粉对产井冈霉素影响最大，酵母粉次之，ＫＨ２Ｐ０４，ＮａＣｌ对产素能力的影响较小．姗舢｜｜嗍｜｜ｏ２２ｌｌ一—Ｅ口６ｖｈｕｕ一；０ｄ基∞１四川大学学报（自然科学版）第４５卷３．３Ｊ１．Ｕ．Ｄ菌株发酵产井冈霉素曲线的确定采用Ｊ１．Ｕ－Ｄ菌株进行摇瓶发酵，按照产生井冈霉素的最佳发酵条件：以１２％的淀粉作为碳源，４％的酵母粉作为氮源，０．０５％的ＫＨ２Ｐ０４和０．１５％的ＮａＣｌ作为无机盐，培养温度３７℃，培养基起始ｐＨ７．２，用于接种的液体种子种龄９６ｈ，液体种子接种量８％．为了确定井冈霉素的发酵周期，在最佳条件下培养，测定其发酵产素曲线，如图２所示，发现产素高峰期在７２ｈ～９６ｈ，化学效价在９６ｈ时达３０６１０×１０一ｇ／ｍＬ．因此可在此时停止发酵．０２０４０６０８０１００１２０Ｔｉｍｅ（ｈ）图２三角瓶发酵产素曲线Ｆｉｇ．２ｌｌｎｇｇａｎｇｍｙｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎａｚｄａｉｃａｌｆｌａｓｋ４讨论随着分子生物学方法的不断进步，近年来出现了一些新的菌种选育方法，例如，重组ＤＮＡ技术［１０］，但利用传统的理化因子诱变育种的方法，因其具有简单，快速，有效等优点，至今仍被广泛使用．本文对ＵＶ，ＤＥｓ对井冈霉素产生菌菌株的诱变效果进行了研究．发现经过ＵＶ，ＤＥＳ两次诱变，菌株可以获得较为理想的诱变效果，产素能力得到较大的提高，得到的高产菌株效价为２５８７４×１０“ｇ／ｍＬ，比出发菌株（效价为２０００７×１０．６ｇ／ｍＬ）提高２９％．同时在检测其效价时采用了高效液相色谱，克服了以往采用稀释法测定不易掌握，误差大，测定所需时间长和比色法不能完全反映出井冈霉素的质量等不足［１１】．在选育得到Ｊ１．Ｕ－Ｄ的基础上，通过对Ｊ１．Ｕ－Ｄ菌株培养基配方和培养条件的优化选择以及正交实验，初步确定最适宜该菌生长的培养基配方及培养条件如下：淀粉１２％，酵母粉４％，ＫＨ２Ｐ０４０．０５％，ＮａＣｌ０．１５％，ｐＨ７．２，接种量８％，３７℃发酵９６ｈ．在此条件在对其进行发酵培养，测得其效价为３０６１０×１０～ｇ／ｍＬ，比出发菌株提高５３％，高于目前报道的效价（２６５８６×１０－６ｇ／ｍＬ）ｔ１２］，为其工业生产奠定了良好的理论基础．参考文献：［１］朱昌雄，宋渊．我国农用抗生素的现状与发展趋势探讨［Ｊ］．农药市场信息，２００７，４：１７．［２］朱昌雄，蒋细良．我国农用抗生素的研究现状及其进展［Ｊ］．现代化工，２００４，２４（１０）：１．［３］ＳｕａｍｉＴ，ＯｇａｗａＳ，ＣｈｉｄａＮ．ＴｈｅｒｅｖｉｓｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎＡ［Ｊ］．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９８０，３３（１）：９８．［４］沈寅初．井冈霉素研究开发２５年［Ｊ］．植物保护，１９９６。