玉米Na+H+反向转运器编码基因ZmNHX的克隆及其表达特性分析

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图!
!"#$% 123 及其推测的氨基酸序列
万方数据
— J) —
高技术通讯
’883 年 第 -3 卷 第 - 期 体内可能是以单拷贝形式存在的。结果见图 1。
推测出的氨基酸序列 （ !" !"#） 和已知的植物 （见图 ’） ， 它和水稻 !$ & " 反向转运器比较后发现 % % 的 !$ & " 反 向 转 运 器 蛋 白 具 有 高 度 的 相 似 性
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!"#$% 基因在正常以及盐胁迫条件下的表 达分析
提取玉米 3855SD & W， -38 55SD & W 盐处理和未处 G’ 非翻译区片段 理的根和叶总 V!+， 以 E 标记的 G’ 为探针， 进行 !SO,TNOB 杂交， 结果见图 <。结果表明， 在根中的表达量高于在 !"=:> 基因受盐胁迫调控， 叶中的 表 达 量。用 18855SD & W 甘 露 醇，-8855SD & W +?+，1855SD & W WC4D，-3855SD & W !$4D 分别处理玉 米幼苗的根 1T， 非翻译区片段为探 以G’ E 标记的 G’ 针， 进 行 !SO,TNOB 杂 交， 结 果 见 图 0。 结 果 表 明， 基 因 受 甘 露 醇， !"=:> WC4D， -3855SD & W !$4D， +?+ 诱导。
［&=F］ 柿和油菜 。 GCH(E( 等首次从单子叶植物水稻中
总 ,’- 的提取按 Q6R:321J56 公司的 >2:S18 试剂说明 书进行。 MN’- 第一链的合成参照 .9T’/>/.+ 公 司 ,-./ U:3 说明书进行。 & ’ + 玉米 !"#$% 基因的克隆 按 .9T’/>/.+ 公司 ,-./ U:3 说明书进行。&’ 分别扩增 &’#$% 全长 0,’- 的 ,-./ 和 A’ ,-./， 和 A’ 端序列。 ,-./ 扩增中使用的特异引物如 &’ 下：
要
的表达受 ’(.8、 甘露醇和 -;- 诱导。玉米 &’ ’+< 在盐胁迫适应过程中可能起着非 9:.8、 常重要的作用。 关键词 ’( ) * + ) 反向转运器，盐胁迫，玉米 有逐年增加的趋势。因此， 培育耐盐玉米具有重要 的社会和经济效益。 为此， 我们根据玉米的 /I> 序列 （ J: K !A&"B!L%） ， 设计了一系列引物， 利用 ,-./ 技术分别获得其 &’ 端和 A’ 端序列， 最终获得了玉米 ’( ) * + ) 反向转运 器基因的全长 MN’- 序列， 并且对玉米的 ’( ) * + ) 反向转运器基因全序列及其表达特异性进行了分 析。我们获得玉米液泡膜上的 ’( ) * + ) 反向转运器 基因将有助于培育玉米耐盐品系， 同时对于研究植 物的耐盐机理具有重要的理论价值。
高技术通讯
%""& 年 第 !& 卷 第 ! 期
玉米 !" # $ % # 反向转运器编码基因 !"#$% 的克隆及其表达特性分析!
陈
! 敏!!!
陈其军!
柴茂峰!
沈国明!
陈
珈!
王学臣"!
（! 中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室
! 山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室 （!
北京 !"""#$） 济南 %&"!""）
图 ! "# $ % & $ 反向转运器的同源性分析
图+
玉米 ,"- 的 ./012345 杂交分析结果
利用 H!+I+! 分析 !" !"#， 发现疏水氨基酸 含量很高， 约占 3’ = 3* 。这说明该转运蛋白符合膜 蛋白 的 特 征， 具 有 很 强 的 疏 水 性。通 过 应 用 软 件 （ JJJ= /K> = L,@ = LM & >NOPC/N> & ） 分 析 及 H!+A :I"II 结果表明 !"=:> 基因 I+! 软件进行疏水性分析， 可能含有 -’ 个跨膜区。结果如图所示 （图 G， 图 1） 。 每个跨膜区约含 -0 Q ’3 个氨基酸， 可能以大约 GR3 B5 长度的! A螺旋跨越膜脂双层。
克隆 得 到 了 水 稻 液 泡 膜 ’( * + 反 向 转 运 器 基 ［#］ ［!"］ 因 ， 该基因超表达的转基因水稻耐盐性增强 。
) )
玉米是我国重要的粮食、 饲料和原料作物。它 的种植面积仅次于水稻、 小麦， 总产量和单位面积产 量仅次于水稻。我国目前大约有 ! 亿亩盐碱地， 且
（ Y!###"!!B""） 资助项目。 # #BA 计划 博士， 讲师； 研究方向： 基因工程。 !#B$ 年生， ! 女， /=0(:8： VMD(6JW M(C X 5EC X M6， M4560:6W @EC X 5EC X M6 " 联系人， （收稿日期： %""$="&=!B）
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引 言
有报道指出植物有三种机制协同作用共同阻止
即抑制 ’( ) 的流入， 增%］ 外流和液泡内 ’( ) 区域化 。其中 ’( ) 的外流和 液泡内 ’( ) 区域化主要依赖于质膜和液泡膜上的
’( * + 反 向 运 输 器。植 物 的 ’( 外 流 可 能 是 由 通过质膜 ’( ) * + ) 反向转运 + ) =->?(@5 提供能量，
［A］ 。 !##B 烟草、 大麦、 西红柿等检测到其生化活性
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材料与方法
植物材料
玉米 （ ()* ’*+" ） 品种为综 A。玉米幼苗生长于 石英沙中， 于温室中 %&O ， 自然 光 照 条 件 下 培 养。 幼苗长至三叶一心时进行处理。 &’( )!* 的提取及反转录 将玉米幼苗移植到含 !&" 0018 * 9 ’(.8 的 ! * % PI 营养液中处理 %$ 小时后提取根总 ,’-。玉米根
年 ’(@@ 等 人 发 现 了 一 个 与 耐 盐 有 关 的 新 基 因 它编码 ’( ) * + ) 反向转运器基因， 定位于前 #$% !，
［$］ 液泡膜和液泡膜上负责 ’( ) 的区域化 。 ;8C0D(8E 等首次克隆得到了拟南芥液泡膜上的 ’( ) * + ) 反向
转运器基因， 并且获得了耐盐的转基因拟南芥、 西红
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（()* ） ， 和 +,!"#-、 ./!"#- 的 相 似 性 分 别 达 到 了 它和 .2.- 的相似性只有 -3* 。 01* 和 00* 。然而， !" !"# 的跨膜区与已知 !$ % & " % 反向转运器蛋白 跨膜部分高度保守。
图* !" "&( 疏水性分析
（ 78)’01 ）#$%&’()* "$+($* ； +,!"#-（ +93-8801 ）,%$45!"6 （ +;818’13） （ .’/01*’* 23$4’$($ ；:$!"#5%’2’&)" $+*2’6)"；+,.2.+9’3<’’1 = ） ,%$.’/01*’* 23$4’$($ ； 2>!"#- （ +?8’-(0( ） 7%89$ （.<(<-<）:0"0 *$1’+(* ；2/!"6（ #<-381）2= /@A *$2’6$ ；">!"6（ !EA8-8011） ;$&&3$%0"8&+* &+%+6’*’$+ ；.>!"#BC/@D@>；./!"#-E （ ++F3G1G’） ; < *$4*$ - = ?$5" U 酶切消化；’ = "CBLUUU 酶切消化；G = 6/SV U 酶切消化
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器 将 ’(
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泵 到 胞 外。 ’(
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通过液泡膜上的 + =->?(@5和 + =??:(@5 提供能量， ) ) ) 降低 ’( ) ’( * + 反向转运器将 ’( 泵到液胞内， 的毒害作用。 对液泡 ’( ) * + ) 反向转运器的研究始于酵母。 首次检测到液泡膜上的 ’( ) * + ) 反向转运器的生化 活性是在甜菜储藏组织中， 目前已在多种植物中如
进行 -7B(CDB4 杂交， 用以)* : 标记的 )’ 8.96 的扩增 片段为探针， 进行 -7B(CDB4 杂交分析。
*
0"!
结 果
!"#$% 基因的克隆和序列分析 从 #!;007= > ? -%’= 处理 *A 小时后的玉米根中提 取总 8-.， 反转录后根据 6+F 序列， 在靠近 )’ 端设计
摘
植物液泡膜 ’( ) * + ) 反向转运器在植物耐盐性方面发挥着重要的作用。根据序 列同源性比较分析结果， 利用 ,-./ 技术获得了一个与水稻 ’( ) * + ) 反向转运器基因 （命名为 &’#$% ） 的全长 !"#$%! 具有高度序列同源性的玉米 ’( ) * + ) 反向转运器基因 0,’- 序列。对正常及胁迫条件下的玉米幼苗进行 ’1234526 7813 分析发现，&’#$% 基因