Envision法与LSAB法在免疫组化染色中的对比观察
envision
（3）每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。
（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
（5）PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。
免疫组织化学工作流程
1 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次5分钟。
PBS配制 （2000ml）PH7.4
氯化钠： 17g
磷酸二氢钠：0.4g
磷酸氢二钠：6.3g
2 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。我科采用压力锅进行抗原修复，取一定量的修复液于压力锅中，加热至沸腾，
8） EnVisionTM孵育10-30分钟
9） TBS漂洗10分钟
10) 色源底物溶液孵育10分钟
11) 蒸馏水漂洗
12) 复染及封片
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注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州脉新生物技术开发有限公司。
包括：生物素化抗兔二抗、亲和素（Reagent A）、生物素－辣根过氧化物酶（Reagent B）、二氨基联苯胺（DAB）
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免疫组化小结13年
卵白素
ABC法
LSAB法
ABC法与S-P法的特点和区别点
特点 1.均为亲和细胞化学方法；
2.生物素化二抗与特异性一抗结合；
3.亲和素(Avidin)与生物素(Boitin)结合； 4.亲和素与链霉亲和素(Streptavidin)均有四个结合 位点,其中三个位点与酶(HRP和AKP)结合,一个位点与 生物素结合。
和不同点？
• 2.PAP法、ABC法、EnVision法的共同点和不同点？ • 3.免疫荧光组化法、免疫酶组化法和免疫金银组化 方法间的共同点和不同点？ • 4.PAP法、ABC法、EnVision法和IGSS法的共同点和
不同点？
• 5.S-P法与CSA法的共同点和不同点？
CSA法原理图
4.金-------免疫胶体金法 IGS法、IGSS法 5.铁-------免疫胶体铁法
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
酶桥法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
APAAP法
多聚螯和物酶法
原位免疫PCR
Sano 等（ 1992 ）率先利用基因工程 的方法表达了蛋白A与链霉亲和素的嵌合 体分子获得成功，建立了免疫PCR技术, 一种新的抗原检测系统，随后在免疫 PCR 的基础上，建立了在细胞或组织原 位 检 测 抗 原 的 原 位 免 疫 PCR （ in situ immuno-PCR）。
二、与其他技术相结合的免疫 组化方法
RCA法 PCR-免疫组化方法
4.免疫组化技术-理论篇
CSA）
标本的处理时的注意事项
石蜡切片标本的处理：
组织离体后尽快固定，切开固定效果好，固定 液以10％福尔马林缓冲液为佳，固定时间在4h24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露， 产生阴性结果。
标本的处理时的注意事项
标本的取材厚度以2mm为宜，梯度酒精脱水尽 量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳 ，透明过度会导致组织发硬发脆。浸蜡应选择低 熔点的石蜡，浸蜡应充分。
标本的处理时的注意事项
切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细胞 重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想。裱片要求达 到无皱折、无气泡，水温宜在（48～50℃），玻片 用APES或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。80 ℃烘 烤1～2h。
标本的处理时的注意事项
冰冻切片的处理：
冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好 的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象。通常以 5um的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥 置入4 ℃冰箱短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存。
减少边缘效应的方法
• PAP笔画圈时应在组织外围2mm左右，不宜太靠近组织。 • 滴加抗体时应从外周环绕，不直接滴加在组织中间，易浪 费抗体。 • 缓冲液中加入适量的乳化剂，可使抗体均匀弥散，节省抗 体，如Triton X-100等 。
常用荧光素：
异硫氰酸荧光素（Fluorescien isocynate FITC）：黄绿色荧光
德克萨斯（Texas red TR）：鲜红色
罗丹明（Rhodame TRITC）红色 花青5（Cyanine CY5):蓝色荧光
免疫组化标记物
放射性标记：
使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显 影术对组织中的抗原进行分析。
免疫组化
免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。
科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。
影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。
因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。
一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。
冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。
二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。
常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。
固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。
三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。
较常用效果较好的是硅化玻片。
硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
＊ APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷SIGMA产品。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法
嘿，朋友们！今天咱就来唠唠免疫组化实验方法这档子事儿。
免疫组化实验啊，就像是一场奇妙的探索之旅。
想象一下，你就是个超级侦探，要去解开细胞里的秘密。
首先呢，得准备好样本，这就好比是给侦探准备好案发现场。
样本要处理得妥妥当当，不能有半点马虎。
然后就是关键的抗体啦！这抗体就像是侦探的放大镜，能帮你找出那些隐藏的线索。
得选对合适的抗体哦，不然可就找错方向啦。
接下来就是一系列的操作步骤啦。
孵育呀，冲洗呀，就跟侦探在现场仔细搜寻证据一样。
每一步都得小心翼翼，不能出岔子。
你说这免疫组化实验像不像一场精细的艺术创作？得有耐心，还得有技巧。
在实验过程中，可别小看了那些试剂和条件哦。
温度啦，时间啦，都得把握得恰到好处。
就好像做饭一样，火候不对，那菜的味道可就差远了。
还有啊，操作的时候可得集中注意力，别走神。
万一不小心弄错了一步，那可就前功尽弃啦，那不就白忙活一场了嘛！
做完实验，就等着看结果啦。
这时候就像是侦探终于揭开了谜底，那种期待和兴奋的心情，真是难以言表。
总之呢，免疫组化实验方法可不简单，但只要你认真对待，细心操作，就一定能在这场细胞的神秘世界里找到你想要的答案。
别害怕困难，勇敢地去尝试吧！相信自己，你一定能行！就这么着，大家赶紧去试试吧！。
最新免疫组化基本技术一
优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。 2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿 液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法
结束语
谢谢大家聆听！！！
21
三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，
尤其是开展分子生物学工作。动物组织取 材要求心脏还在跳动时取材。
2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定
4.尸检组织的取材 病人死亡后，一般要在数小时后才能
做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开 展IHC检测的关键。
二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标
本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷 冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固 定后，再进行后固定。
动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注 2.空气栓塞法 3.断头法 4.击头法 5.股动脉放血法
5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手
术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定 后取材。
6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。 将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻 压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
免疫组化基本技术一
RCA法 IS-PCR
UIP S CSA法 Envision
A法BC
免疫组化结果判断及常见问题的分析
非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异 性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题 的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织 或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和 相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制 。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治 疗提供更可靠的依据。
THANK YOU
感谢聆听
数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术 ，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算 机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析 ，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查 和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
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免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原 的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过 对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿 瘤进行准确的诊断。
病理学技术师《专业实践能力》考前点题卷一
病理学技术师《专业实践能力》考前点题卷一[单选题]1.适于原位杂交的最佳固定液为A.锇（江南博哥）酸B.戊二醛C.4%多聚甲醛缓冲液D.10%福尔马林缓冲液E.4%甲醛参考答案：C参考解析：原位杂交最佳固定液是多聚甲醛缓冲液。
[单选题]4.大体标本灌注常用的染料为A.碱性品红、伊文思蓝B.伊红、苏木素C.亚甲蓝、苦味酸D.甲基紫、曙红E.普鲁蓝、络黄参考答案：E参考解析：灌注大体标本常用的染料有普鲁蓝、络黄。
[单选题]5.下列各项不是细胞学检查的优点的是A.方法简便安全，痛苦小B.标本来源容易C.可反复取材D.能判断肿瘤的侵袭深度和范围E.可以对某些器官进行多位点的检查参考答案：D参考解析：细胞学检查一般不能判断肿瘤的侵袭深度和范围。
[单选题]6.要制出一张优质的切片标本，关键是A.切片B.透明C.脱水D.染色E.固定参考答案：E参考解析：良好组织切片的基础取决于适当而完全的固定。
[单选题]7.用Grocott六胺银法、黏液胭脂红法和爱尔辛蓝法染色都呈阳性反应的真菌是A.曲菌B.组织胞质菌C.新型隐球菌D.毛霉菌E.白色念珠菌参考答案：C参考解析：新型隐球菌用Grocott六胺银法、黏液胭脂红法和爱尔辛蓝法染色都呈阳性。
[单选题]8.染色体的最佳固定剂是A.甲醛B.乙醇C.乙酸D.锇酸E.戊二醛参考答案：C参考解析：乙酸是染色体的最佳固定剂。
[单选题]9.Giemsa螺旋体染色法的正确结果为A.螺旋体及细菌呈蓝到淡紫色,细胞质呈蓝色,白细胞呈橘黄色B.螺旋体及细菌呈蓝到淡紫色,细胞质呈橘黄色,白细胞无色C.螺旋体及细菌呈蓝色,细胞质呈绿色,白细胞呈红色D.螺旋体及细菌呈蓝到淡紫色,细胞质呈红色,白细胞无色E.螺旋体及细菌呈蓝色,细胞质紫色,白细胞呈红色参考答案：A参考解析：Giemsa螺旋体染色法的正确结果：螺旋体及细菌呈蓝到淡紫色,细胞浆蓝色,白细胞橘黄色。
[单选题]10.Mallory磷钨酸苏木精液既可染肌肉横纹，又可染A.胶原纤维B.平滑肌纤维C.弹力纤维D.纤维素E.啶粉样蛋白参考答案：D参考解析：Mallory磷钨酸苏木精液可染肌肉横纹、纤维素等。
envision法染色
EnVision法染色是一种免疫组化染色技术，常用于检测组织样品中蛋白质的表达和定位。
其原理是利用酶标记和可见色素来标记抗体-抗原结合事件。
具体操作步骤如下：
1.取得待检测组织样品，制作切片并固定。
2.进行脱脂和脱水处理，并用适当的抗原修复方法使目标抗原易于被抗体识别。
3.加入特定抗体，与目标抗原结合。
4.加入HRP标记的二级抗体或酶标记的二级抗体，这些抗体会结合到第一层抗体上。
5.加入底物，这种底物能够与HRP或酶产生的代谢物反应，从而生成可见色素。
6.观察样品，使用显微镜等工具观察和分析染色结果。
EnVision法染色技术具有高灵敏度、高特异性、方便操作等优点，可以用于诊断疾病和研究蛋白质功能、定位等方面。
Envision法与LSAB法在免疫组化染色中的对比观察
・实验技术・Envision 法与LSAB 法在免疫组化染色中的对比观察李 雯 梁颜笑 刘国荣(广州医学院附属市一医院病理科,广州510180) 摘要 目的:对目前免疫组织化学染色中应用最为广泛的Envision 二步法与L SAB 三步法进行比较。
方法:将本科常规肿瘤活检标本固定,脱水,石蜡包埋,切片,分别应用CK 、Envision 法和L SAB 法进行相应的30多种不同单克隆/多克隆抗体免疫组化染色。
结果:两种方法特异性强,阳性定位准确,无差异。
Envision 法敏感度及阳性强度均优于L SAB 法,操作更为简便,更省时,背景清晰,非特异性染色少,缺点是试剂盒在价格上略高于L SAB 法。
结论:Envision 二步法特别适合于快速临床病理诊断,而L SAB 法应用于科研或定量试验比Envision 法效果更理想。
关键词 Envision ;L SAB ;免疫组化方法;对比中图分类号 R392-33 文献标识码:A 文章编号:1008-1836(2002)04-0050-03作者简介:李雯,女(1968.11-),主管技师。
研究方向:免疫组织化学。
随着免疫组织化学技术在病理诊断和科研工作中的普及,其检测方法也在不断改进和提高,向着更敏感、更特异方向发展。
本文对免疫组织化学染色中最常用的Envision 二步法和L SAB 三步法进行比较,找出两种方法各自的优缺点,为免疫组化染色提供更好的选择方法。
1 材料和方法1.1 标本取自本科常规肿瘤活检标本,包括多种上皮源性肿瘤、间叶源性肿瘤、神经源性肿瘤和淋巴瘤等。
组织经10%甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,60℃烘烤30min 。
1.2 试剂所用的抗体有C K 、C K7、C K19、C K20、CEA 、EMA 、CA125、Vim 、HHF 235、SMA 、C 2K it 、Desmin 、S 2100、CD31、CD34、CD68、HMB 245、ER 、PR 、Cerb 2B 22、V EGF 、PCNA 、P53、GFAP 、NSE 、CgA 、Syn 、LCA 、UCHL1、CD3、CD20、CD79α、HPV 等30多种单克隆和多克隆抗体。
EnVision法和ABC法在免疫组化病理检测中的运用-病理学论文-基础医学论文-医学论文
EnVision法和ABC法在免疫组化病理检测中的运用-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——免疫组织化学技术(免疫组化)是一种在临床病理诊断和生物医学研究中应用非常广泛的技术。
自Coons 等成功应用免疫荧光方法以来，免疫组化经过不断改良，建立了多种简便、灵敏的方法。
现今临床病理中主要应用亲和素－生物素(ABC)法进行诊断，但ABC 法存在着背景深、灵敏度相对较弱等不足。
本研究对EnVision 法和ABC 法进行比较，分析2 种方法各自的优缺点，为临床病理检测提供更合适的方法。
1 资料与方法1．1 资料选取2012 年1 月－2014 年1 月确诊10例肾母细胞瘤的肾组织标本和7 例滤泡性恶性淋巴瘤的淋巴结组织标本。
所有标本均来自于中山大学第一附属医院病理科。
1．2 试剂WT1 抗体( 批号:14012677C) 来自于福州迈新生物技术开发有限公司(中国);CD10 抗体(批号:D06828)、Bcl －6 抗体(批号:1225504C)来自于罗氏公司(美国); ABC 试剂盒(批号:20001418)、EnVisionTMFLEX + Ｒb ( LINKEＲ) 试剂盒( 批号:20008198)和DAB 显色试剂盒(批号:20008206)来自于DAKO 公司(丹麦);其他试剂自配。
1．3 方法所有组织标本均为石蜡标本，每个石蜡标本连续切片，厚度3 m ～5 m，分别制成2 张玻片，将其分成2 组(ABC 组和EnVision 组)分别染色。
ABC 组经脱蜡、水化、修复等常规步骤后，用WT1 抗体(1∶100)、CD10 抗体(1∶200)和Bcl －6(1∶100)抗体孵育1 h 后，直接用HＲP －复合物孵育1 h，然后DAB 显色，苏木精染核，封片。
EnVision 组在一抗孵育之前的步骤与ABC 组相同，在WT1 抗体、CD10 抗体或Bcl －6 抗体孵育后，用EnVisionTMFLEX + Ｒb(LINKE Ｒ) 孵育20 min，再用HＲP －复合物孵育40 min，然后DAB 显色，苏木精染核，封片。
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
两种常用的免疫组化染色方法对NOS染色效果的比较
两种常用的免疫组化染色方法对NOS染色效果的比较居培;余红民【摘要】目的比较ABC法和SP法两种免疫组织化学染色方法的染色效果.方法通过免疫组化检测一氧化氮合酶的三个亚型的蛋白iNOS、eNOS和nNOS的表达,观察三种蛋白的染色结果.结果 SP法检测iNOS和eNOS的敏感性要明显强于ABC法;SP法蛋白染色结果明显优于ABC法.结论 SP法检测NOS优于ABC法.【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】2页(P7-8)【关键词】免疫组化染色方法 NOS【作者】居培;余红民【作者单位】徐州医学院公共卫生学院实验教学中心，江苏徐州221004【正文语种】中文【中图分类】R392-33在教学科研过程中，免疫组织化学染色方法是最常用的方法之一。
ABC法（avidin-biotin momeplex）是ABC免疫酶染色法的简称，又称卵白素-生物素-酶复合物染色法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。
在AB C法的基础上发展起来的SP法使用的是Steptavdin-perioxidase-biotin，即用链霉素生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白。
ABC法和SP法是常规的科研和教学实验中最常用的两种方法［1-2］。
本研究以检测一氧化氮合酶（NOS，iNOS、eNOS和nNOS）为手段来比较ABC法和SP法的染色效果。
1.1 材料卵巢癌切片取自徐州医学院附属医院病理科，脑组织和睾丸组织取自本实验室科研实验制作的实验动物组织切片。
1.2 试剂抗-iNOS、-eNOS和-nNOS抗体购于Santa°Cruz°生物技术有限公司，酶标羊抗小鼠/兔IgG二抗，EDTA（pH8.0），PBS磷酸盐缓冲液（ 0.01 mol /L，pH7.2～7.4），DAB显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司），生物素标记的二抗、兔Streptavidin-HRP试剂盒和其他常规试剂购于徐州博立达生物技术有限公司。
EnVision System在免疫组织化学方法中应用的体会
EnVision System在免疫组织化学方法中应用的体会刘丽梅;柳凤轩【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2001(23)4【摘要】目的介绍EnVisionSystem这种免疫组织化学染色技术的新方法。
方法分别用EnVisionSystem与S P两种染色方法在 40例活检组织中的各种抗体(CD44、Cytokeratin、ER、PR、GFAP、Vimentin)标记进行对比观察。
结果EnVisionSystem法的灵敏度、阳性强度都优于S P法 ,而且非特异性着色浅 ,背景低 ,时间短。
结论相对于S P法 ,EnVisionSystem法的确是一种灵敏度高、低背景、快速、操作方便的免疫组化染色新方法,值得在医院外科病理诊断中推广应用。
【总页数】2页(P491-492)【关键词】EnVision;System;免疫组织化学;染色技术【作者】刘丽梅;柳凤轩【作者单位】第三军医大学附属西南医院病理学研究所【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.微波EnVision免疫组织化学技术及其应用 [J], 马大烈;郑青渝;李全华;黄玲;魏建丽2.微波修复抗原和微波酶消化法同时应用在P16和CyclinD1免疫组织化学方法中的体会 [J], 魏国红;孙智才;刘嵘;张彤3.免疫组织化学Envision^(TM)二步染色法的应用 [J], 黄照权;李春英;李华;庞恩桥;黄志勇4.EnVision免疫组织化学二步法在诊断深部真菌感染上的应用 [J], 马蕾;李挺;李若瑜5.病猪肺组织中PRRSV抗原免疫组织化学Envision法的原位检测 [J], 杨鸿;钱君娣;何启盖;马春全;卢玉葵;邓桦;曾振灵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫组化染色过程中遇到问题？那你需要看这里！
免疫组化染色过程中遇到问题？那你需要看这里！良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果。
因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
“杂音”染色片：免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。
“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种：1.全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。
解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，即使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。
免疫组化4免疫组化
一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第
二抗体（桥抗体）--PAP复合物 步骤：三步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性AP的基础上再重复
第二抗体和PAP复合物
一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体
（第一抗体）上，抗原--抗体● HRP复合物
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一
性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。
二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上，
抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。
第四节 酶抗酶法
● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
酶桥法
产物（显色）
HRP的底物：
HRP的底物为低浓度的H2O2， 供氢体为胺类及酚类化合物。
HRP显色反应： HRP＋H2O2 电子供体 HRP
＋H2O＋电子供体（氧化型）
电子供体被氧化后，迅速改变 颜色，通过聚合等反应，生成不溶 性有色颗粒，并就地原位沉淀。
HRP常用的电子供体： ● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易
辣根过氧化物酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶一辣根过氧化物酶hrp分子量40000不会遮盖抗原的结合部位稳定易获得较高纯度酶具有较高活性及特异性可溶性佳生成的产物不扩散组织中内源性酶较少可作用于多种底物产生不同颜色hrp穿透力强易进入细胞内二硷性磷酸酶akp从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取组织穿透能力较弱内源性akp较高左旋咪唑具有抑制作用三葡萄糖氧化酶god底物为葡萄糖终产物稳定体内无内源性god分子量大穿透力较弱二底物及其特点酶底物酶底物酶产物显色hrp的底物
两种LsAB染色标记方法及其抗原修复方法的比较
两种LsAb染色标记方法及其抗原修复方法的比较赵莹李萍A李贵星邓文斌四川大学华西临床医学院医学检验系(成都610041)摘要目的比较两种标记生物素链亲和素法(LSAB)并探讨抗原修复的最佳方法方法采用碱性磷酸酶(AP)LSAB法和辣根过氧化物酶(~RP)LSAB法染色肺癌合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺组织石蜡切片中类胰蛋白酶(tryptaSe)的抗肥大细胞类胰蛋白酶抗体(AA1 小鼠抗人)并比较染色效果用高压~胰蛋白酶和微波三种方法进行抗原修复比较修复效果结果AP LSAB法染色比~RP LSAB法背景清晰~颜色对比鲜明高压修复效果优于胰蛋白酶和微波修复结论在肺组织免疫组化染色中推荐使用AP LSAB法并采用高压修复抗原关键词碱性磷酸梅辣根过氧化物酶LSAB抗原修复中图分类号R392Comparing two kinds of Labeled streptavidin biotin methods and selecting the best Antigen retrieval method ZHAO ying LI ping A LI GUi xing DENG WSn bin. e en Z e ne e n S le ne S n U n U e C h e ngdu610041 C hin aAbstract O b j ective To com pare t Wo kind S of l a b e l e d Strepta vidin bio t in(LSAB)m et hod S a nd pr ovid e t h e o pt im a l m et hod of a n t ig e n retr i e v a l.methods Th e a lk a lin e p ho Sp h ataSe(AP)LSAB m et hod a nd t h e ho rSera di S h per oxid aSe(~RP)LSAB m et hod W ere u Se d t o Sta in a n t i tryptaSe in para ffin e mb e dding t i SS u e of pat i e n tS Wi t h ch r onic ob Str uc t iv e p ulmon ary di SeaSe(COPD)a nd t h e i r Sta ining e ff e c tS W ere com pare d.Th e a n t ig e n S W ere repa i re d b y high preSS u re cooking trypt in dig eSt ion a nd mic r oW a v e a nd t h e repa i r ing e ff e c tS W ere com pare d. res l lts Th e b a ckg r ound S of Sta in e d Se c t ion S W ere mo re di St inc t a nd t h e colo r di St inc t ion of nucl e u S a nd p o S i t iv e S ign a l W ere b r igh ter b y AP LSAB com pare d Wi t h t ho Se b y~RP LSAB t h e repa i r ing e ff e c t of high preSS u re cooking W aS b etter t h a n t h e repa i r ing e ff e c t of trypt in dig eSt ion a nd t h a n t h at of mic r oW a v e.Concl l sion AP LSAB a nd high preSS u re cooking retr i e v a l W ere re comm e nd e d fo r u Se in immunohi St och e mic a l Sta ining of p ulmon ary infl a mm at o ry t i SS u e.ke y words A lk a lin e p ho Sp h ataSe~o rSera di S h per oxid aSe LSAB A n t ig e n retr i e v a l标记生物素链亲和素法(LSAB)具有反应快~敏感性和特异性高以及染色背景清晰的特点对链亲和素有两种应用较多的标记酶,~RP标记显色剂常为二氨基联苯胺(DAB)AP标记显色剂常为快红(F aSt Re d T R N apt hol A SMX)~快蓝或新复红我们采用这两种标记方法对合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)的肺癌患者肺组织中类胰蛋白酶抗体进行染色[13]并比较AP标记LSAB法的高压~胰蛋白酶和微波三种抗原修复方法选择出最佳方案1材料与方法1.1材料抗肥大细胞类胰蛋白酶抗体由英国南安普敦大四川省科技厅基金(03JY029 081 2)资助A C o rreSp onding a u t ho r 学免疫药理学小组赠送AP和~RP系统试剂盒及快红显色剂由Sigm a公司提供DAB~中性树胶和水性封片剂由北京中山公司提供选择肺癌合并COPD患者经肺叶切除术切除的未受累肺组织1.方法1..1组织切片的准备将手术切除的肺组织切成1cm1cm0.4cm的组织块后放入40g L的甲醛中固定612h后脱水~浸蜡和包埋免疫组化染色前切成3m厚的切片将其分为AP LSAB 组和~RP LSAB组放入冰箱保存1..切片脱蜡和一抗前处理切片在室温下放置10min后置3孵箱10min再放入二甲苯中脱蜡经1000ml L~90ml L~00ml L乙醇分别处理min和蒸馏水水化1min ml L过氧化氢甲醇溶液处理10min以阻断内源性过氧化物酶的干扰0g L牛血清白蛋白(B S A)处理10min以四川大学学报(医学版)sich l an niv(med sci di)(), 1 18阻断非特异性蛋白结合位点 加入100pl 1=50稀释的一抗(5g /L BSA -PBS 稀释) 37C 孵育2h 1.2.3抗原修复AP -LSAB 组切片脱蜡~水化后分别采用以下三种方法修复暴露抗原:D 高压修复使用医用消毒锅 以0.01mol /L p~6.0柠檬酸缓冲液淹没切片 在121C 202kPa 加热10min ;@1g /L 胰蛋白酶消化修复即将切片放入37C 预热的酶溶液中消化15min ; 微波修复即将切片放入0.001mol /L p~8.0EDTA 枸橼酸缓冲液中用家用微波炉在95C 加热10min 以不修复切片为对照1.2.4二抗处理和免疫组化染色条件加入1=15稀释的二抗(山羊抗小鼠)biotin 37C 孵育30min 两组切片分别加入1=20稀释的AP -Streptavidin 和~RP -Streptavidin 37C 孵育30min再分别用FaSt -Red TR /Napthol ASMX 和DAB /~202在p~7.2条件下显色 镜下观察 适时终止 苏木素复染3min 自来水充分冲洗15min 最后分别用Clearmount 和中性树胶封片 以PBS 代替一抗作空白对照 以临床骨髓活检确诊的肥大细胞增生症病人皮肤切片为阳性对照 二抗Biotin ~AP -Streptavidin 和~RP -Streptavidin 均用50g /LBSA -PBS 稀释2结果2.1免疫组化染色结果~RP 标记LSAB 法免疫组化阳性结果(图1)为胞浆颗粒呈棕黄色 核复染呈蓝色 背景不清晰 空白片(图2)呈现大片假阳性信号 AP 标记LSAB 法免疫组化阳性结果(图3)为胞浆颗粒呈红色 核复图1肥大细胞胞浆颗粒DAB 显色呈棕黄色 HRP -LsAB 法X 700图2空白片呈现大量假阳性信号 HRP -LsAB 法X 700图3肥大细胞胞浆颗粒快红显色呈红色 抗原未经修复呈现阳性信号少 AP -LsAB 法X 700图4空白片无阳性信号 AP -LsAB 法X 700图 肥大细胞胞浆颗粒快红显色呈红色 经高压修复抗原充分暴露 呈现大量阳性信号 AP -LsAB 法X 700图6肥大细胞胞浆颗粒快红显色呈红色 经微波修复呈现阳性信号少 AP -LsAB 法X 700图7肥大细胞胞浆颗粒快红显色呈红色 经胰蛋白酶修复抗原呈现阳性信号少 AP -LsAB 法X 700Fig 1Cytoplasmic granules o f mast cells w ere staine d b ro w n b y means o f DAB .HRP -LsABX 700Fig 2Blan k control s h o w e d lotso f f alse -positi V e signals .HRP -LsAB X 700Fig 3Cytoplasmic granules o f mast cells w ere staine d re d b y means o f f ast re d ;antigensw ere not repaire d an d s h o w e d f e w positi V e signals .AP -LsAB X 700Fig 4Blan k control d i d not s h o w positi V e signal .AP -LsABX700Fig Cytoplasmic granules o f mast cells w ere staine d re d b y means o f f ast re d ;antigens w ere repaire d b y h ig h pressure coo k ingan d s h o w e d lots o f positi V e signals .AP -LsABX 700Fig 6Cytoplasmic granules o f mast cells w ere staine d re d b y means o f f ast re d ;antigens w ere repaire d b y micro w a V e an d s h o w e d f e w positi V e signals .AP -LsABX 700Fig 7Cytoplasmic granules o f mast cells w erestaine d re d b y means o f f ast re d ;antigens w ere repaire d b y tryptin d igestion an d s h o w e d f e w positi V e signals .AP -LsABX 700714j Si c huan U niv (Med S c i Edi ) ol .35No .32004染呈蓝色背景清晰空白片图)无阳性信号抗原修复结果P s B组切片不修复高压修复微波修复及g胰蛋白酶修复抗原的结果依次见图6 7 可见图所示阳性信号最强即高压修复后抗原暴露最好讨论类胰蛋白酶是肥大细胞特异性标志物可应用免疫标记技术检测肥大细胞的成分和分布其特异性抗体的产生为与肥大细胞相关疾病的发病机制的研究开辟了宽阔的前景目前s B法被认为是最理想的免疫组化染色方法RP标记的s B法显色剂为D B染色后阳性颗粒呈棕黄色但该染色系统不能用于血液及骨髓病理学标本因为血细胞本身含较多的内源性过氧化物酶而过氧化氢既是RP的底物又是抑制剂其量过多反而抑制RP活性使D B显色效果差使皮肤和脂肪组织染色结果表现出一片棕黄色很难分辫阳性和阴性反应从我们的研究结果可见该染色系统对C PD病人肺石蜡组织进行处理不能完全消除内源性过氧化物酶的干扰 D B显色与内源性和外源性的色素颗粒难区分开得到的结果假阳性严重阴性和阳性细胞不易区别而且D B有较强的致癌性而采用P标记与快红显色能得到很好的效果阳性颗粒呈红色阴性片不显色非特异性染色消失背景清晰及抗原定位清楚底物无危害 6 7 而且RP s B法最后一步需要脱水透明采用的封片剂是中性树胶而P s B法不需要脱水透明直接采用水性封片剂封片简化了操作步骤对显微摄影及幻灯片的制作效果也很好 6病理标本常用g甲醛固定石蜡包埋由于甲醛固定时组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键不少抗原决定簇被封闭或破坏同时甲醛的聚合作用使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络导致抗原决定簇的掩盖使相当一部分的抗原抗体反应不能很好进行从而影响了免疫组化染色效果可用加热和酶消化的方法打开醛键改变蛋白构象暴露抗原我们曾经减少单抗的稀释但不能增强胞浆内阳性信号采用高压胰蛋白酶和微波三种抗原修复方法从结果可见高压修复的效果最好即暴露的抗原最多阳性信号比不修复增强胰蛋白酶修复效果次之微波修复效果相比之下最差高压处理过程比微波炉和胰蛋白酶经济方便8同时由于抗原决定簇充分暴露即使不增加抗体浓度也能得到好的染色效果并节省了珍贵的抗体参考文献何韶衡李萍Buckley M 等应用双重免疫技术鉴定肥大细胞亚型中华病理学杂志 2 29 )82e S Peng Walls Potent induction of a neutrophil and eosinophil rich infiltrate in vivo by human mast cell tryptase: Selective enhancement of eosinophil recruitment by histamine J Immunol997 9 2):62 6aron SD ngel JB unau M et al ranulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease m J Respir Crit Care Med 2 6 2):9Wang W McNeil P usain et al Delta tryptase is expressed in multiple human tissues and a recombinant form has proteolytic activity J Immunol 2 2 69 9):李金明辣根过氧化物酶及其酶免疫试验中的应用研究进展国外医学临床生物化学与检验学分册99 ):2 76熊呈琦彭瑞云高亚兵等s B免疫组化方法的改进及在血液和骨髓病理学中的应用中国实验临床免疫学杂志999 ):7Milanese M Crimi E Scordamaglia et al n the functional conseguences of bronchial basement membrane thickening J ppl Physiol 2 9 ):8杨红免疫组化质量控制中的个基本影响因素临床与实验病理学杂志 2 7 2):89Norton J Jordan S Yeomans P Brief high temperature heat denaturation pressure cooking):a simple and effective method of antigen retrieval for routinely processed tissue J Pathol99 7 ):7Montero C The antigen antibody reaction in immuno histochemistry J istochem Cytochem 2 ):2 72收稿 2 2 修回)编辑汤洁8四川大学学报医学版)2 年第卷第期两种LsAB染色标记方法及其抗原修复方法的比较作者：赵莹， 李萍， 李贵星， 邓文斌作者单位：四川大学华西临床医学院,医学检验系,成都610041刊名：四川大学学报(医学版)英文刊名：JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：2004,35(3)被引用次数：1次1.何韶衡,李萍,Mark G.Buckley应用双重免疫标记技术鉴定肥大细胞亚型[期刊论文]-中华病理学杂志 2000(5)2.He S;Peng Q;Walls AF Potent induction of a neutrophil and eosinophil-rich infiltrate in vivo by human mast cell tryptase:Selective enhancement of eosinophil recruitment by histamine 1997(12)3.Aaron SD;Angel JB;Lunau M Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease 2001(02)4.Wang HW;McNeil HP;Husain A Delta tryptase is expressed in multiple human tissues,and a recombinant form has proteolytic activity 2002(09)5.李金明辣根过氧化物酶及其酶免疫试验中的应用研究进展 1993(05)6.熊呈琦;彭瑞云;高亚兵LsAB免疫组化方法的改进及在血液和骨髓病理学中的应用 1999(03)anese M;Crimi E;Scordamaglia A On the functional consequences of bronchial basement membrane thickening 2001(03)8.杨红免疫组化质量控制中的3个基本影响因素[期刊论文]-临床与实验病理学杂志 2001(2)9.Norton AJ;Jordan S;Yeomans P Brief, high-temperature heat denaturation(pressure cooking):a simple and effective method of antigen retrieval for routinely processed tissue 1994(04)10.Montero C The antigen-antibody reaction in immuno-histochemistry 2003(01)1.赵继红.王晓文.尹有群.卢义生.ZHAO Ji-hong.WANG Xiao-wen.YIN You-qun.LU Yi-sheng不同的抗原修复法和检测法在胃肠道间质瘤CD117检测中的研究[期刊论文]-海南医学2005,16(8)2.施光峰.翁心华.徐肇玥.马瑾瑜秋水仙碱对血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白表达的影响[期刊论文]-中华传染病杂志2000,18(3)3.李伟.朱镭.倪国新.徐学敏.林标扬利用组织芯片检测乳腺癌组织中Ⅲ型胶原α1多肽链表达的研究[会议论文]-20084.权莉.张锦波.李华仁鼻咽癌组织潜伏膜蛋白1不同抗原修复方法的比较研究[期刊论文]-国际医药卫生导报2004,10(16)5.刘维贤.高原侠.林晓萍.管宇颌面部上皮源性肿瘤组织中肥大细胞的定量分析[期刊论文]-中国医科大学学报2000,29(6)6.李卫东.任连生.林志彬灵龙颗粒剂的抗肿瘤作用及对免疫功能的影响[期刊论文]-中国新药杂志2002,11(12)7.李友忠.杨竹林.杨新明.曾益慈.葛益林.LI You-zhong.YANG Zhu-lin.YANG Xin-min.CENG Yi-ci.GE Yi-lin 喉鳞癌组织中肥大细胞和肿瘤相关巨噬细胞计数及其临床意义[期刊论文]-肿瘤防治研究2007,34(2)8.韩文.苗慧.张师前.张琳琳.陈桂莲.陈佳权胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ在盆腔器官膨出并压力性尿失禁患者子宫骶韧带中的表达[期刊论文]-医学信息（手术学分册）2008,21(7)9.周虹抗原修复方法在Ⅳ型胶原免疫组化染色中的应用[期刊论文]-临床与实验病理学杂志2007,23(1)。
对免疫组织化学染色的几点体会
对免疫组织化学染色的几点体会
吴凡;张忠;潘晓蔚;王嘉伦
【期刊名称】《沈阳医学院学报》
【年(卷),期】1999(001)002
【摘要】目前常用的免疫组织化学染色方法有ＡＢＣ法、ＳＰ法和ＬＳＡＢ法等。
免疫组化染色已成为科研和临床工作常用方法。
为此，我们就近年来该方面的工作介绍以下几点体会。
１组织标本、固定液和缓冲液组织标本离体后，应在３０ｍｉｎ之内及时进行固定，所取组织不宜过大，并应...
【总页数】2页(P123-124)
【作者】吴凡;张忠;潘晓蔚;王嘉伦
【作者单位】沈阳医学院医学基础部病理解剖学教研室，沈阳110031
【正文语种】中文
【中图分类】R446.8
【相关文献】
1.自动免疫组织化学染色与手工免疫组织化学染色质量的对比观察 [J], 印永祥
2.CK-pan免疫组织化学染色联合弹力纤维染色时不同孵育方法对染色结果的影响[J], 叶恩如;王教辰;翁寿向;郑海红
3.印片细胞学联合快速免疫组织化学染色细胞学检测对乳腺癌前哨淋巴结转移的诊断价值 [J], 王玉;付刚
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免疫组化二步法
2.用pH6.0 0.01M CB热诱导修复(微波3档20min),室温自然冷却,
3.PBS洗3×3min;
4.0.3％H2O2抑制内源性过氧化物酶20min，室温；
5.PBS洗3×3min；
6..20%正常羊血清室温孵育30min,不洗;
7.滴加适当稀释特异性一抗37℃孵育2h；
∧∧组织抗原
[试剂及材料]
一、试剂：
(1)一抗抗体名称
(2)EnVision试剂(HRP-Rabbit/mouse)即用型购于丹麦Dako公司
(3)0.01mol/L pH7.4 PBS;
(4)0.01mon/L TBS pH 7.8;
(5)3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ3－－二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)
二、材料：
三、[操作流程]
8．PBS洗3×3min；
9．EnVision试剂(HRP-R/M)37℃30min；
10．PBS洗3×3min；
11．DAB显色8～12min；
12．苏木素衬染色，热水蓝化；
13．吹干后，树脂封片；
14．镜下观察，核紫蓝色，阳性呈棕黄色.
[DAB的配制]
称50mg DAB加入至100ml TBS中，搅拌后，过滤，加入终浓度为0.03％H2O2。
EnVision法免疫组化(IGF1R、LYVE1)
[原理]
EnVision法又称为ELPS法（Enhance Labelled Polymer System）。EnVision复合物是利用一种多聚化合物，将HRP或AP和第二抗体（抗鼠或抗兔IgG）同时标记在一个多聚化合物上，即形成酶-多聚化合物-第二抗体巨大复合物。每一个mol的复合物中约含70个mol的HRP和10个mol的第二抗体，复合物中的HRP的绝对数量远高于其它复合物（如ABC），本身已具备高度放大作用，因此EnVision法敏感性显著高于其他方法。复合物中存在多个第二抗体，也增加了该复合物与特异性抗体的结合机会。同时，该多聚化合物人体内不存在，无非特异性干扰，故背景染色轻。此外，染色步骤为两步，且第二抗体孵育时较短，使该方法更省时而简便。
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・实验技术・Envision 法与LSAB 法在免疫组化染色中的对比观察李 雯 梁颜笑 刘国荣(广州医学院附属市一医院病理科,广州510180) 摘要 目的:对目前免疫组织化学染色中应用最为广泛的Envision 二步法与L SAB 三步法进行比较。
方法:将本科常规肿瘤活检标本固定,脱水,石蜡包埋,切片,分别应用CK 、Envision 法和L SAB 法进行相应的30多种不同单克隆/多克隆抗体免疫组化染色。
结果:两种方法特异性强,阳性定位准确,无差异。
Envision 法敏感度及阳性强度均优于L SAB 法,操作更为简便,更省时,背景清晰,非特异性染色少,缺点是试剂盒在价格上略高于L SAB 法。
结论:Envision 二步法特别适合于快速临床病理诊断,而L SAB 法应用于科研或定量试验比Envision 法效果更理想。
关键词 Envision ;L SAB ;免疫组化方法;对比中图分类号 R392-33 文献标识码:A 文章编号:1008-1836(2002)04-0050-03作者简介:李雯,女(1968.11-),主管技师。
研究方向:免疫组织化学。
随着免疫组织化学技术在病理诊断和科研工作中的普及,其检测方法也在不断改进和提高,向着更敏感、更特异方向发展。
本文对免疫组织化学染色中最常用的Envision 二步法和L SAB 三步法进行比较,找出两种方法各自的优缺点,为免疫组化染色提供更好的选择方法。
1 材料和方法1.1 标本取自本科常规肿瘤活检标本,包括多种上皮源性肿瘤、间叶源性肿瘤、神经源性肿瘤和淋巴瘤等。
组织经10%甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,60℃烘烤30min 。
1.2 试剂所用的抗体有C K 、C K7、C K19、C K20、CEA 、EMA 、CA125、Vim 、HHF 235、SMA 、C 2K it 、Desmin 、S 2100、CD31、CD34、CD68、HMB 245、ER 、PR 、Cerb 2B 22、V EGF 、PCNA 、P53、GFAP 、NSE 、CgA 、Syn 、LCA 、UCHL1、CD3、CD20、CD79α、HPV 等30多种单克隆和多克隆抗体。
Envision 法和L SAB 法试剂盒均为Da K o 公司产品。
1.3 方法上述抗体同时用Envision 法和L SAB 法进行免疫组化染色。
首先将切片常规脱蜡至水,微波抗原修复或胰蛋白酶消化处理,0.05mol/L PBS 清洗3次,每次3min ,根据组织的需要,滴加不同的一抗,具体染色方法和时间见表1。
表1 E nvision 法与LSAB 法染色步骤和时间T ab.1 The dyeing step and time of E nvision πsmethod and LSAB πs methodDyeing stepEnvision πs (time )L SAB πS (time )First antibody (37℃)20～30min 30～60min Second antibody (37℃)10～30min20～30min Third antibody (37℃)20～30min2 结果两种方法特异性强,阳性定位准确,分别为细胞浆、细胞核、细胞膜和间质,呈棕色的阳性反应,经苏木素复染后,棕色与蓝色对比鲜明,大多数组织片均无显著的背景染色,为免疫组化染色中较为理想的两种选择方法。
Envision 法敏感度与阳性强度均比L SAB 法高,并使一抗的稀释度提高了1～2倍,背景更加清晰,非特异性染色少,而且简化了操作步骤,只需两步就可完成,缩短了染色时间,比L SAB 法节省时间40～60min ,缺点是试剂盒价格上略高于L SAB 法试剂盒。
3 讨论免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体与抗原的特异性结合来鉴定组织或细胞内某种物质的性质,并利用酶作用于底物所产生的颜色反应来显示的一种技术。
它经历了三步法的PAP 法、ABC 法、L SAB 法发展到二步法、一步法,目前应用最广,染色结果最为理想是L SAB 法和Envision 法。
Envision 法是利用葡聚糖多聚体复合物技术,将一5 第30卷第4期 广州医学院学报 Vol.30No.4 2002年12月 ACADEMIC JOURNAL OF GUAN GZHOU MEDICAL COLL EGE Dec.2002个抗小鼠(或兔)的免疫球蛋白与过氧化物酶(或碱性磷酸酶)联结到葡萄糖的聚合物上而成。
L SAB 法为过氧化物酶标记的链霉卵白素-生物素亲和反应,其链霉卵白素有四个亚基可和生物素结合,具有灵敏度高、特异性强、背景清晰的特点[1,2]。
通过对Envision 和L SAB 两种方法的比较发现,Envision 法在敏感度、染色步骤、时间、背景染色等方面均优于L SAB 法,是一种高敏感、快速的试验方法,只是试剂盒价格略高。
Envision 法第二抗体上标记有多聚物酶(HRP 或AP )复合物,含有多个抗兔或抗鼠免疫球蛋白和较多的HRP 分子,能充分与第一抗体结合,敏感度较L SAB 法高出几十倍,同时对抗原有显著的放大作用,使第一抗体稀释度提高1～2倍[3],尤其是对抗原表达较弱的组织,如ER 、PR 等Envision 法比L SAB 法更理想。
Envision 法为非卵白素-生物素反应,第二抗体没有生物素的存在,无非特异性干扰,无需血清封闭,避免了内源性生物素造成的背景染色,背景更清晰,适合于在内源性生物素含量高的组织进行免疫组化染色[4]。
由于L SAB 法中含有生物素,与组织中内源性生物素起交叉反应,形成卵白素(或链霉卵白素)-生物素复合物,易造成一定的背景染色特别是对于S 2100、GFAP 、NSE 、Syn 、CgA 、HPV 等抗体尤为显著。
Envision 法多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间较短,比L SAB 法省时40～60min ,在操作步骤上只需两步,比L SAB 法操作更为简便,同时也减少一次PBS 的冲洗步骤和时间,节省了人力和物力。
特别适合于快速临床病理诊断。
但如果应用于科研或定量试验,特别是较新首次使用的抗体,我们发现使用L SAB 法,一抗在4℃冰箱过夜,结果更理想。
Envision 二步法试剂盒在价格上高于L SAB 三步法试剂盒,一般较适合于大型医院,L SAB 法较经济实惠,在中小型医院应用较为普及。
图1 CK 19细胞浆强阳性,背景清晰。
E nvision ×200图2 CK 19阳性强度较E nvision 法弱。
LSAB ×200图3 VEGF 细胞浆强阳性。
E nvision ×400Fig.1 Strong positive reaction for CK 19w as show n in plasm ,with clear b ackground ,E nvision ×200Fig.2 Weaker positive intensity for Ck19w as seen in LSAB πs than E nvision πs ,LSAB ×200Fig.3 Strong positive reaction for VEGF w as seen in plasm ,E nvision ×400 图4 VEGF 阳性强度较E nvision 法弱。
LSAB ×200图5 C erbB 22细胞膜及细胞浆强阳性。
E nvision ×400图6 C erbB 22阳性强度较E nvision 法稍弱。
LSAB ×400Fig.4 Weaker positive intensity for VEGF w as seen in LSAB πs than E nvision πs ,LSAB ×200Fig.5 Strong positive reaction for C erbB 22w as seen in cell membrane and plasm ,E nvision ×400Fig.6 Weaker positive intensity for C erbB 22w as seen in LSAB πs than E nvision πs ,LSAB ×40015第4期 李雯,等:Envision 法与L SAB 法在免疫组化染色中的对比观察参考文献[1]马大烈,郑清渝,李全华,等.微波Envision免疫组化技术及其应用[J].中华病理学杂志,1998,12(2):153.[2]梁英杰,黎红,赖英荣.免疫组织化学LDP染色法在病理诊断中的应用[J].中华病理学杂志,1999,28(1):60.[3]黄照权,李春英,李华.免疫组织化学Envision二步染色法的应用[J].铁道医学,1999,27(6):410-411.[4]刘丽梅,柳凤轩.Envision System在免疫组织化学方法中应用的体会[J].第三军医大学学报,2001,23(4):491-492.(收稿日期 2002-09-12)A Comparative Observation in ImmunohistochemistryStaining Methods:Envision vs LSABL I Wen,L IAN Yan2Xiao,L IU Guo2Rong(Dept.of Pathology,Fi rst A f f iliated M unici pal Hospital,Guangz hou Medical College,Guangz hou510180)Objective:To compare Envisionπs and L SABπs methods that are currently applied widely in immunohistochemistly staining.Method:To fixate,dehydrate,wax and section the usual samples from tumor biopsy.To make the corresponding thirty or more species of monoclonal/polyclonal antibody immunohistochemisty staining respectively with Envisionπs and L SABπs methods.Result:The two methods have no difference in high specificity and exact positive location.The sensitivity and positive intensity of Envisionπs method are better than that of L SABπs.The former is operated more briefly and faster,with clear setting and little non specific staining,but is more expensive than L SABπs method for the test kit.Conclusion: Envisionπs method is especially favorable in fast clinical pathologic diagnosis,while L SABπs method is more effective for scientific research or ratio trial.K ey w ords Envision;L SAB;immunohistolochemistry method;contrast25广州医学院学报(J GZMC) 2002,30(4)。