Northern_Blot
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
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编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
Northern blot 分析
Northern blot分析RNA的提取和电泳（1）RNA的提取：以休眠解除不同时期的花芽为植物材料，采用Aidlab的EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒分别提取不同时期花芽的总RNA。
（2）制胶：将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热融化均匀。
待胶凉至60-70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS buffer和0.5μl EB，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
（3）RNA样品缓冲液：去离子甲酰胺50%，甲醛5%，10×MOPS1%，EB（1mg/ml）1%。
（4）样品制备：取DEPC处理过的500μl离心管，将每个样品25μg左右的RNA沉淀溶于30μl RNA样品缓冲液中，将离心管置于65℃水浴中保温10min，再置于冰上5min；每管中加入3μl甲醛凝胶加样缓冲液，混匀。
（5）上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1-2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔。
（6）电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于3-4V/cm的电压下电泳3-4h，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
试剂配制：（1）10×MOPS缓冲液：200mM MOPS；50mM NaAc；10mM EDTA；调pH值为7.0，过滤灭菌后，避光保存。
（2）甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25%(m/v)溴酚蓝；0.2mg/ml 溴化已锭（3）RNA样品缓冲液：10%10×MOPS缓冲液；17%甲醛；45%去离子甲酰胺转膜及烘膜（1）按胶块大小剪取膜一张，剪去膜一角，在DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡至使用时取出。
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Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交A．探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml于-20℃保存。
核酸检测篇8-Northern blot_修正版
编号：2-8主题：Northern blot概述：Northern blot （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine、David Kemp和George Stark发明。
Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家Edwin Southern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。
目的：Northern blot 可用来检测不同组织、器官、生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达模式，还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和用探针进行杂交检测RNA的表达水平。
步骤：1、总RNA提取；2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC 水12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min；3、样品制备：取总RNA约20-30μg，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 μl、37%甲醛3.6 μl、甲酰胺10 μl，65℃温育15min、冰浴5min。
加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2小时左右），电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5、将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜；6、使上述RNA转移持续进行15hr左右。
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Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA（多达10μl）5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
NorthernBlot原理及实验方法
Norther n Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RN A探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：Norther nMax Kit（Cat. # 1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，RandomPrimer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free KlenowFragmen t和10 X Buffer, Sephade x G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RN AZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZa p。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denatur ing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
NorthernBlot实验方法步骤
Northern Blot实验方法步骤实验原理在变性条件下将待检的RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，既而依据同Southern Blot同样的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中能否含有基因的转录产物（mRNA ）及其含量。
实验试剂1. NorthernMax Kit（Cat.# 1940，Ambion, Inc.）2.琼脂糖3.DEPC4.X 光底片5.底片暗盒6.Random Primer7.dNTP Mixture8.111 TBq/mmol[a-32P]dCTP9. Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer10.Sephadex G-5011.SDS12.双氧水 , 灭菌水等实验设施1.恒温水浴箱2.电泳仪3.凝胶成像系统4.真空转移仪5.真空泵6.UV 交联仪7.杂交炉8.恒温摇床9.脱色摇床10.旋涡振荡器11.分光光度计12.微量移液器13.电炉（或微波炉）14.离心管，烧杯，量筒，三角瓶等实验资料.总 RNA 样品或 mRNA 样品，探针模板DNA(25 ng) ，尼龙膜实验步骤1. 器具的准备：180 度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等 4 小时。
电泳槽：冲洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡留宿，用DEPC 水冲刷，干燥备用。
办理 DEPC 水(2 L) 备用。
2.用 RNAZaP 去除器具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，电泳槽，刀片等，而后用DEPC 水冲刷二次，去除RNAZap 。
3.制胶1) 称取 0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 32.4mlDEPC 水后，微波炉加热至琼脂糖完整溶化。
60 ℃空气浴均衡溶液 ( 需加 DEPC 水增补蒸发的水分 ) 。
2) 在通风厨中加入 3.6ml 的 10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量防止产生气泡。
3)将熔胶倒入制胶板中，插上梳子。
Northern Blot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
Northern blot技术-1
Northern blot技术-1核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot )(一)Southern Blot 原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…(一)Southern Blot原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
(二)Northern Blot原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
(三)探针标记技术1 标记物:放射性和非放射性两种放射性:非放射性:生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法(1)切口平移法(2)随机引物法(3)末端标记法(4)单链DNA探针标记(5)寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Northern_Blot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法northern blot（RNA印迹杂交）注：Southern blot（DNA印迹杂交）Western Blot（蛋白质印迹)Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。
首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
[方法与步骤]1. 用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
然科生物Northern Blot技术服务
Northern blot技术服务一：技术简介RNA印迹杂交（Northern blot ）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。
Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。
Northern blot 可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。
如northern blot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northern blot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
二：服务介绍服务内容（1）RNA提取及浓度测定（2）探针合成（3）Northern Blot实验（4）实验结果扫描图片及完整的实验报告客户提供（1）组织、细胞样品或RNA（2）制备探针用的模板DNA或提供探针序列我们提供（1）Northern Blot X光片（2）实验结果扫描图（3）实验结果分析和统计（4）完整的实验报告单质量保证我们保证所提供的实验结果客观真实。
northern blot
RNA的浓度测定测定提取的总RNA的浓度打开浓度测定仪器，用挡板挡住通光孔获得暗光普，再取1ulRNAse free的水作为空白对照获得空白光谱。
依次取1ul的样品进行测定。
得到RNA的浓度。
（取浓度为2ug-3ug进行变性然后转膜RNA的变性向RNA样品加入变性剂（相当于RNA样品体积的0.5倍～1倍），振荡混匀后稍离心，然后65℃PCR仪器加热10分钟，冰上速冷2分钟后电泳。
（总体积大约30-50ul）RNA电泳分离变性胶的制备称取0.6g琼脂糖用36mlDEPC处理水溶解，在微波炉中加热溶解好，等到60°左右加入9ml的30%的甲醛和6ml 10Xmops溶液。
混匀后制胶。
晾半小时以上电泳分离将稀释好的1Xmops溶液大约500ml倒进电泳槽。
进行电泳。
电压120V，电泳1小时或者1小时30分。
照胶检测将电泳完的胶用用透明EP手套包好，检测RNA的质量，进入转膜转膜准备10Xssc 100ml。
DPEC水200ml。
转膜液200ml（0.4molNaOH-3molNaCl）。
将尼龙膜浸入10Xssc使其充分湿润后方可使用将滤纸先用depc水浸湿，再浸入转膜液中，已备使用将胶从电泳槽中取出来，用DEPC水浸泡胶2min，将表面杂质洗掉。
然后浸入转膜液20min构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，浸湿滤纸，并向盘中加入足量的转膜液用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。
将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后封口膜凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
剪一片与凝胶暴露面略大的尼龙膜，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。
膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用玻棒赶出气泡。
Northern blot
Northern blot实验目的1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。
2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。
3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。
由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。
其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。
在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。
例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白研究。
通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。
两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对Northern blot的结果要有客观的分析。
类似目的的实验主要为RTPCR。
原理采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。
应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。
与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。
最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。
实验准备（略）实验步骤1．RNA电泳取10ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓冲液。
置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却，再加4ul上样缓冲液，混匀。
移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。
接通电源，负极靠近上样孔。
吸取样品24ul，注入上样孔内。
开启电源，电压调至100V。
电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。
轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。
在凝胶一侧放把尺，拍照。
2．RNA转移至硝酸纤维素膜取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。
取2-4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。
Northern Blot实验方法
Northern Blot实验方法一、胶的配制(试剂盒中已有)二、样品配制试剂加样量RNA loading buffer 3μLmiRNA 7μL将微量离心管盖严，将RNA溶液置于70℃温育5分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
三、凝胶电泳用0.5X TBE作为电泳缓冲液，预跑空胶（撕下空胶板底部封住的胶布，为了使其通电），60V（恒压）,30min。
加10μL RNA样品到一个15%尿素聚丙烯酰胺凝胶，留出两边最外侧的加样孔加入5μRNA分子标准样品作为Marker。
注：不同的RNA样品可以被加载到凝胶与一个单一的miRNA探针或相同的检测60V（恒压）运行，直到溴酚蓝达大约距离凝胶底部3厘米的处停止，大约两小时左右。
四、转膜1、转移凝胶至充满0.5X TBE缓冲液的玻璃盘中。
2、提前将膜与滤纸浸泡在0.5X TBE中半小时。
3、组装转膜装置：一个纤维垫，一个滤纸，凝胶，膜和一张滤纸，一纤维垫4、确保凝胶在负极侧，膜在正极侧的一面，转移盒里倒满预冷的0.5xTBE。
6、60V，在寒冷的房间或冰箱里转移1小时7、转移后，RNA用紫外交联仪固定8、在42℃干燥15分钟。
(若无条件，7、8两步可以省去。
)五、杂交1）膜放入杂交管（科宁50毫升的一次性管）。
（2）利用dH2O泡膜，然后倒去dH2O（3）放入预热的NB hybridization buffer 4 毫升（预热到42℃）。
（4）转动杂交管42 ℃，30分钟（5）倒掉缓冲液，加入新鲜的预热的NB hybridization solution4毫升（预热到42℃）（6）加10μL RNA探针，42℃杂交过夜。
（7）用20ml 1xNB hybridization wash buffer.在瓶中冲洗膜。
（8）添加NB hybridization wash buffer 20毫升，42℃旋转30分钟。
六、检测（1）用镊子将膜转移到杂交管容器（200mL杂交管）。
NorthernBlot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法发布日期：[2012-9-6] 共阅[41388]次原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
点击查看核酸杂交系列产品实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
[方法与步骤]1. 用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1．称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分) 2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
Northern印迹杂交(Northern
Northern blottingNorthern印迹杂交（Northern blotting）：是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。
DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA 变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。
RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。
在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。
为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。
所有操作均应避免RNase的污染。
1.仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
2.材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜3.试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111TBq/mmol，[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
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一、实验目的：
1、掌握Northern blot的实验原理与操作技 术； 2、了解Northern blot的实验在分子生物学 与转基因领域的应用。
二、实验原理：
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖
凝胶电泳，然后将分离的RNA转移到尼龙膜，然后
用放射性标记的探针进行杂交检测，最后进行放射 性自显影。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物 （mRNA）及其含量。
6. 转膜：
① 用3%双氧水浸泡真空转移仪，用RNAZap擦洗多孔渗水 屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。 ② 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜，在 Transfer buffer 浸湿 5 min后，放置在多孔渗水屏的适当 位置。
③ 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁，将胶的多余部分切除， 切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约 2mm，以防止漏气。 ④ 将胶小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。
20．杂交结果
五、结果与分析：
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7．打开真空泵，使压强维持在50~58 mbar；立即将 transfer buffer加到胶面和四周。每隔10 min在胶上加1 ml transfer buffer，转移2h。
8．转膜后将膜于1× MOPS Gel Running buffer 中轻轻 泡洗10 sec（去残余胶和盐）。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联 仪中自动交联。
② 加入3.6ml 10×Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。
③ 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子。注：胶的厚度不能超 过0.5cm。 ④ 胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1× MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm。 ⑤ 检查点样孔。
1. 用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4h； 清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 水冲洗，干燥 备用；处理DEPC水(2 L)备用 2．RNAZaP去除用具表面的RNase污染，用RNAZap擦洗 梳子、电泳槽、刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去 除RNAZap。 3．制胶：① 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。 60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)
18．曝光：将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止
膜干燥；检查膜上放射性强度，估计曝光时间，将X光 19．去除膜上的探针：将200 ml 0.1% SDS（DE底片，扫描记录结果。 制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS 冷却到室温，取
出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
1、仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪， 真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩 涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉）， 离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
2、材料 总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙 膜
3、试剂 NorthernMax Kit（Cat. # 1940， Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光 底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol [a-32P] dCTP，Exo-free Klenow Fragment和 10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双 氧水, 灭菌水等。
16．杂交： ① 加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀 后，将探针加到预杂交液中。
② 42℃杂交过夜（14~24 h），杂交完后，将杂交液收集
起来于－20℃保存。 17．洗膜：加入High Stringency Wash Solution 2 (100cm2 膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20 min两次。
14．预杂交： ① 将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使 未溶解的物质溶解。 ②加入适量的ULRAhyb到杂交管中(100 cm2加 入10ml ULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 h。 15．探针变性： ① 用10 mM EDTA将探针稀释10倍。 ② 90℃热处理稀释后探针10 min，立即放置于 冰上5 min。 ③ 短暂离心，将溶液收集到管底。
4. RNA样品的制备：在RNA样品中加入 3 倍体积的 formaldehyde load dye和适当的EB。混匀后，65℃ 15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰上 5 min。 5. 电泳： 将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm下进行 电泳（在电泳过程中，每隔30 min 短暂停止电泳，取出 胶，混匀两极的电泳液后继续电泳），当胶中的溴纷蓝 接近胶的边缘时终止电泳； 紫外灯下，检验电泳情况， 并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意 不要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。
④ 100 μl STE缓冲液洗柱，1600 g 离心4 min。重复3次。 ⑤ 倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于15 ml管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离 心管中，注射器口对准1.5ml离心管。 ⑥ 将标记的DNA样品加入25 μl STE，取出0.5 μl点样于 DE8-paper上，其余上样于层析柱上。 ⑦ 1600 g 离心 4 min，DNA将流出被收集在去盖的离心管 中，而未掺入DNA的 dNTP 则保留在层析柱中。取0.5 μl己纯化的探针点样于DE8-paper ⑧ 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。
13. 探针的纯化及比活性测定： ①准备凝胶：将1g 凝胶加入30 ml DEPC水中，浸泡过夜。 用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。 换用新配的TE (pH 7.6)。 ② 取1 ml 的注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化 的玻璃纤维塞住，在注射器中装填12Sephadex G-50。 ③ 将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离 心管口上。1600 g 离心 4 min，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达 注射器 0.9 ml 刻度处。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。 (避免太长的紫外曝光时间)。 11．将膜在-20℃保存。
12. 探针的制备： ① 在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 1μl；Random Primer 2 μl ；灭菌水 11 μl ；总体积：14 μl 。 ② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。 ③在离心管中按下列顺序加入以下溶液： 10×Buffer 2.5 μl dNTP Mixture 2.5 μl 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 μl Exo-free Klenow Fragment 1 μl 混匀后（25ul），37 ℃下反应30 min。短暂离心，收 集溶液到管底。 ④ 65 ℃ 加热5 min 使酶失活。