浙江中医药生化大实验题库

复习参考资料：1、生物化学的实验技术有哪些?1、①离心技术②层析技术③电泳技术④免疫化学技术⑤分光光度技术⑥高效液相技术3、什么是离心力? 什么是相对离心力? 各用什么表示?3、 1 ）离心力(centrifugal force，Fc)离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。

离心力(Fc)的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积。

2 ）相对离心力(relative centrifugal force，RCF)就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

4、制备性离心机可分为几类,叙述每类的特点？4、制备性离心机可分为三类：⑴普通离心机：最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。

⑵高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。

⑶超速离心机：转速可达50000～80000 rpm，相对离心力最大可达510000×g，它能使亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。

5、转头可分为几类,每类的特点是什么?5、转头：⑴角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。

它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20～40度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。

这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。

⑵荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成。

当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。

其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。

⑷垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。

6、离心管可分为几类,每类的优缺点是什么?6、离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。

塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。

缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。

不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。

但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。

7、何谓差速沉降离心法, 优缺点(特点是)是什么?适用于分离哪些物质的离心?7、差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

8、差速区带离心法, 优缺点(特点是)是什么?适用于分离哪些物质的离心?8、速率区带离心法速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。

9、等密度区带离心法, 优缺点(特点是)是什么?适用于分离哪些物质的离心?9、等密度离心法等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。

当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρp <ρm时粒子上浮；在弯顶处ρp>ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρp =ρm时，dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

一般在物质的大小相近，而密度差异较大时应用此法。

常用的梯度液是CsCl。

等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。

10、离心操作的注意事项有那些?10、离心操作的注意事项：1)使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡后对应管子必须互相对称地放在转头中。

2)装载溶液时，要根据离心管不同要求选择装载量。

3)若要在低于室温的温度下离心时。

转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

4)离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

5) 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时不得过速、过时使用。

11、层析的概念11、层析技术：层析技术是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，在物质经过两相时，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。

12、层析的分类及其分离原理12、1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。

2）分配层析：固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。

3）离子交换层析：固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。

4）凝胶层析：固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。

5）亲和层析：根据生物特异性吸附进行分离，固定相只能和一种待分离组分有高度特异性结合，而与无结合能力的其它组分分离。

14、凝胶层析常用的凝胶及其商品名14、1）葡聚糖凝胶（dextran gel，商品名为Sephadex）、2）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，商品名为Bio-Gel P）3）琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名为Sepharose）4）复合凝胶15、保留值、分离度、柱效、理论塔板等效高度的概念15、保留值：是表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的多少。

它用来描述层析峰在层析图上的位置。

分离度（Rs）：是指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍，分离度愈大，说明分离效果愈好。

柱效：即分离效果的高低，常用塔板数的多少来衡量，某一组分随流动相经过一定距离后，流动相中某组分的平均浓度与固定相的平均浓度达到分配平衡，完成这一平衡所需要的层析柱的柱长称为板高或理论塔板等效高度。

用H表示；一定柱长（L）中含有多少板高（H）称为理论塔板数（n）即 n= L/H 。

16、层析峰区域宽度的描述方式16、层析峰区域宽度的三种表示方法是标准差（σ）、峰宽（Wb）、半峰宽（W1/2）。

17、如何提高柱效17、（1）增加柱子高度（2）凝胶柱中避免气泡（减少涡流）（3）合适的流速（4）合适的上样体积（2-5%柱体积）（5）透析除盐降低样品粘稠度18、影响电泳的主要因素有哪些？18、影响电泳的主要因素：1）电泳介质的pH2）缓冲液的离子强度3）电场强度4）电渗作用5）对支持物的选择6）温度对电泳的影响20、什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？20、聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺和交联剂N,N’–甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺聚合而成。

可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。

21、聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基的引发有哪两种方法？21、聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基团的引发有化学、光合两种方法。

22、不连续凝胶电泳的分离原理。

22、（1）样品的浓缩效应1）凝胶层的不连续性2）缓冲液离子成分的不连续性（2）分子筛效应：因蛋白质分子量的大小而达到分离。

蛋白质分子量大，迁移速率小，蛋白质分子量小，迁移速率大。

（3）电荷效应。

23、请说出常用蛋白质染色的几种方法。

23、常用蛋白质染色剂有：氨基黑10B 、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250 、固绿、荧光染料、银染色法。

24、请说出常用脂蛋白染色方法。

24、脂蛋白染色可用油红O、苏丹黑B染色。

25、SDS在SDS-PAGE中的作用。

25、SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。

这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量有关。

26、请叙述一下血浆低密度脂蛋白LDL的分离纯化鉴定过程，并列出在此过程中应用了哪些生化实验技术26、请叙述血浆低密度脂蛋白的分离纯化鉴定过程。

（1）超速离心得到的密度在1.019 -1.063 g/L之间富含LDL血浆置于透析袋中，4℃，0.01M PBS透析过夜。

（2）放入40% PEG20000中浓缩至1/3-1/4体积。

取出，4℃，3000×g离心30min。

（3）取上述方法处理的样品1-2ml，上已平衡的Sepharose 6B柱。

上柱时待上部缓冲液近干时再沿内壁缓缓加入样品。

待样品全部进入凝胶后，再两次用1ml洗脱液轻洗内壁。

（4）接上洗脱液，以0.4ml/min流速洗脱，紫外检测器280nm检测，部分收集器收集流出液，每管1ml。

共收集到3个峰。

（5）取各峰的峰顶及前后1/2峰高管洗脱液与相应抗血清作免疫双扩散鉴定，第二峰只与山羊抗人LDL抗体有清晰沉淀线，与其它抗血清无免疫沉淀反应；再经7.5% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，仅在PAGE凝胶上部接近原点处有一蛋白条带。

证明第二峰为纯的LDL。

(6) 合并第二峰各管，Lowry法测定蛋白质含量后分装，-20℃保存或冷冻干燥保存。

技术有：①离心技术②层析技术③电泳技术④免疫化学技术⑤分光光度技术⑥高效液相技术27、蛋白质含量测定方法有哪些，简述其原理27、1) 紫外吸收法测定蛋白质: 蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在波长280nm处，在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度A280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。