分子生物学实验
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。
常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。
提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。
常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。
2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。
反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。
PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。
3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。
转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。
转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。
表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。
以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。
这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。
分子生物学实验
实验一：细胞的传代与培养实验材料：1、细胞：PC12细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％胎牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养板，吸液枪，酒精灯等实验原理：从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
操作步骤：1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1到2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、放入培养箱中消化2-3分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代。
5.根据确定的比例来取需要的量，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养皿放入培养箱7.收拾整理超净台实验结果：生长良好的PC12细胞图如下：实验二：MTT比色法实验材料：1、细胞：PC12细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％胎牛血清）、DMSO、MTT 溶液MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。
分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。
实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。
根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。
生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。
根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。
核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。
核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。
其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。
酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。
酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。
电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。
PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。
PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。
PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。
扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。
蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。
常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。
总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。
通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是研究生命分子结构和功能的基础。
分子生物学的研究对象是生命体内的DNA、RNA、蛋白质等生物分子，通过实验可深入了解生命分子的结构及其功能，为治疗疾病等产生重要的科研意义。
本文将着重介绍PCR扩增、基因克隆、蛋白质表达和酶联免疫吸附实验等分子生物学实验。
PCR扩增PCR扩增是分子生物学领域中使用最广泛的实验技术之一。
PCR扩增技术是通过不断的复制，使DNA分子增多。
PCR主要操作步骤包括：DNA样品提取、模板DNA扩增、DNA回收纯化和定量检测等。
PCR扩增实验分为两部分：第一部分是制备PCR反应混合物，包括模板DNA、引物（Primer）、反应缓冲液、酶、脱离剂、种子液等。
制备反应混合物的过程中，需要将所有的试剂按照一定比例混合后，将混合液均匀吸入PCR管内。
第二部分是PCR反应实验本身，包括控制PCR反应温度变化、确保每个PCR 反应的时间和温度一致、等等。
PCR反应时间通常在2-6小时之间，取决于所扩增的DNA片段的长度和针对不同目标所使用的引物。
基因克隆基因克隆是利用重组DNA技术将外源DNA和载体DNA组装重组成新的DNA分子，然后通过转化等方式将新的DNA分子转移到感受态宿主细胞中，使得新的DNA分子被细胞所接受并复制，从而达到克隆目的的一种实验方法。
基因克隆实验的主要操作步骤包括：选取适当的载体，将所需要的外源DNA和载体DNA连接起来组成重组DNA分子，将重组DNA分子转化至感受态宿主细胞中，最后从发酵液中提取所需的目标DNA分子。
基因克隆技术在分子生物学实验研究中起到了重要的作用，使得我们能够制备大量目标分子用于进一步的研究。
蛋白质表达蛋白质表达是一种将蛋白质合成出来的实验技术。
蛋白质表达技术的主要目的是利用外源基因的扩增技术，将目标蛋白表达并纯化出来，从而进一步深入了解蛋白质的结构及其功能。
蛋白质表达实验的主要操作步骤是：蛋白质的基因落库、基因克隆到重组基因载体中、启动子、子纯化表达及活性鉴定等。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学实验
分子生物学实验在分子生物学领域，实验是非常重要的手段，可以帮助科学家们深入研究细胞和遗传信息的奥秘。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常见技术，为读者提供一个全面的了解。
实验准备在进行任何分子生物学实验之前，实验室必须准备好所有必需的试剂和器材。
这些试剂包括DNA酶、引物、缓冲液等，而器材则包括PCR仪、电泳仪、热循环仪等。
此外，实验室还需要保持清洁、有序，以确保实验结果的准确性和可重复性。
核酸提取在进行分子生物学实验时，研究人员通常需要提取目标细胞或组织中的核酸，如DNA和RNA。
这个步骤非常关键，因为核酸是遗传信息的载体，对后续实验至关重要。
PCR扩增PCR（聚合酶链反应）是一种常用的技术，可以在体外复制DNA片段。
通过PCR扩增，科学家们可以快速获得大量特定DNA序列，为后续实验提供充足的材料。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术。
通过在凝胶电泳仪中施加电场，可以使DNA片段根据大小在凝胶中移动，从而实现分离和检测。
蛋白表达和纯化在分子生物学研究中，研究人员经常需要表达和纯化特定蛋白。
通过基因工程技术，科学家们可以将目标基因插入表达载体中，在宿主细胞中大量表达目标蛋白，并通过纯化步骤获得纯净的蛋白样品。
分子克隆分子克隆是将某一DNA片段插入到另一DNA分子中的过程，常用于构建重组DNA、重组蛋白等。
通过分子克隆技术，科学家们可以研究和改变生物体内的基因组成。
实验结果分析一旦实验完成，科学家们需要对实验结果进行分析和解读。
这通常涉及到数据处理、图表绘制、统计学分析等工作，以确保实验结论的准确性和可靠性。
结论与展望分子生物学实验在揭示生命的奥秘和解决重大疾病方面起着至关重要的作用。
随着技术的不断发展和创新，我们相信分子生物学实验将在未来展现出更广阔的发展前景，为人类健康和生活质量带来更多的希望。
希望本文能够帮助读者更好地了解分子生物学实验的基本原理和方法，激发更多人对分子生物学这一神奇领域的兴趣和热爱。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验1.基因克隆实验：基因克隆实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的DNA序列克隆到重组DNA分子中。
这个实验通常包括DNA的摘取、PCR扩增、限制性内切酶的消化、连接载体、转化大肠杆菌等步骤。
2. 蛋白质表达实验：蛋白质表达实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质表达到大肠杆菌等宿主细胞中。
这个实验通常包括将感兴趣的基因克隆到表达载体中，表达载体转化至宿主细胞，利用诱导剂等物质诱导表达蛋白质等步骤。
3. PCR实验：PCR实验是一种基于酶催化反应的分子生物学实验。
该实验通过模板DNA、引物、酶及核苷酸等原料，经一系列温度变化，扩增目标DNA片段。
该实验通常用于基因克隆、DNA测序、点突变检测等领域。
4. DNA测序实验：DNA测序实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是确定DNA序列。
这个实验通常包括PCR扩增、DNA纯化、测序反应、数据分析等步骤。
5. RNA干扰实验：RNA干扰实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
这个实验通常包括制备siRNA、合成siRNA、转染细胞等步骤。
6. 蛋白质纯化实验：蛋白质纯化实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质从混合物中提纯出来。
这个实验通常包括细胞裂解、纯化、检测等步骤。
7. 荧光检测实验：荧光检测实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用荧光分子标记分子或细胞等，观察其分布、表达及功能等。
这个实验通常包括荧光染色、荧光显微镜观察等步骤。
8. 基因编辑实验：基因编辑实验是一种新兴的分子生物学实验，其目的是通过基因编辑技术，直接改变DNA序列，从而实现对基因的修饰。
这个实验通常包括CRISPR/Cas9等基因编辑技术的设计、实现、检测等步骤。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验
分子生物学实验引言分子生物学实验是研究生物体分子层面的结构和功能的实验方法。
通过在分子水平上研究细胞中的基因表达、蛋白质合成和代谢等过程，可以全面了解生物体的生理机制和疾病发生的分子基础。
本文将介绍常见的分子生物学实验方法和技术。
1. DNA提取实验DNA提取是分子生物学实验中的基础步骤，它的目的是从细胞中分离出DNA。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、CTAB法和商业试剂盒法等。
以下是酚/氯仿法的步骤：1.收集样本组织或细胞：可以使用动植物组织、细菌、真菌等样本。
2.细胞破碎：使用细胞破碎缓冲液将样本破碎，释放出内部的细胞和胞浆。
3.蛋白质沉淀：加入酚/氯仿缓冲液，使蛋白质从细胞裂解物中沉淀。
4.DNA沉淀：将上一步的上清液加入异丙醇中沉淀DNA。
5.洗涤和溶解：用乙醇洗涤并净化DNA沉淀，最后用缓冲液溶解DNA。
2. PCR实验PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中的一种重要技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR实验一般包括以下步骤：1.DNA模板准备：提取好的DNA作为PCR反应的模板。
2.反应组分配置：配置PCR反应体系，包括引物、脱氧核苷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等。
3.反应条件设定：设置PCR反应的温度和时间参数，包括变性、退火和延伸步骤。
4.PCR扩增反应：将PCR反应体系放入热循环仪中进行循环扩增。
5.PCR产物分析：使用凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析和检测。
3. 克隆实验克隆实验是将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化和筛选得到含有目标DNA的克隆。
以下是常见的克隆实验步骤：1.DNA片段选择：根据需要选择目标DNA片段，并通过酶切或PCR方法制备。
2.载体准备：选择适当的载体，如质粒或噬菌体，并进行酶切或PCR扩增。
3.构建重组体：将目标DNA片段和载体DNA连接，形成重组DNA。
4.细胞转化：将重组DNA引入宿主细胞中。
5.筛选克隆：通过筛选方法（如抗生素筛选）获得含有目标DNA的克隆。
分子生物学实验
分子生物学实验1. 幸免长时刻的培养，大肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。
要紧是因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。
重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。
其他未重组菌在A mp存在的情形下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就能够生长了。
卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也生长出来了。
一句话，你的板子培养时刻过长了。
这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col分泌beta 内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。
2.3. 乙醇能够排除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
Na＋之类的平稳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。
因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。
1.什么原因用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一样在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，什么原因一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的N aAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (3)实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (5)实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (6)实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (8)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (9)实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (10)实验八RNA提取与纯化 (12)实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (15)实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (17)实验十一感受态细胞的制备及转化 (18)实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (20)实验十三DNA分析——Southern杂交 (22)一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的技术手段。
以下是常用的分子生物学实验方法：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过体外DNA扩增技术来复制DNA 片段的方法，可以快速、高效地扩增特定DNA序列。
2. 基因克隆：通过将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子，再将重组DNA导入到宿主细胞中，从而得到大量目标DNA的方法。
3. 电泳：电泳是一种利用电场将DNA、RNA或蛋白质分子按照大小和电荷进行分离的方法。
常用的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4. 蛋白质表达与纯化：通过在宿主细胞中表达目标蛋白质的基因，然后利用蛋白质的特异性结构、功能或抗体亲和纯化技术，从宿主细胞中纯化目标蛋白质。
5. 免疫沉淀：利用抗体与特定蛋白质结合来纯化对应的蛋白质复合物的方法。
6. 荧光显微镜：利用荧光探针标记目标生物分子，通过荧光显微镜观察和分析分子在细胞或组织中的位置和数量。
7. Northern blot和Western blot：用于检测和分析RNA和蛋白质的方法。
Northern blot可以检测特定的RNA序列，Western blot可以检测特定蛋白质。
8. 基因敲除和基因转染：通过基因敲除技术可以去除或禁止特定基因的表达，而基因转染技术可以将外源基因导入细胞中，从而改变细胞的表型。
9. 蛋白质相互作用分析：利用蛋白质相互作用分析技术，如酵母双杂交、质谱分析等，研究蛋白质之间的相互作用关系。
这些方法是分子生物学研究中常用的实验技术，可以用于从分子水平解析生物学问题，探索生物的结构和功能。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种基于分子水平研究生物学现象和分子机制的实验方法。
它通过对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的研究，揭示生物体内发生的各种生物学现象及其分子机制，从而推动生物学的发展和进步。
分子生物学实验的方法多种多样，常用的实验手段包括DNA提取、PCR、Western blot、RT-PCR等。
其中，DNA提取是一项常用的实验技术，用于从生物样品中提取出DNA分子。
这一技术可以应用于许多领域，如基因检测、疾病诊断和亲子鉴定等。
PCR是一种用于扩增DNA片段的技术，可以快速获得大量特定的DNA序列。
Western blot则是用于检测蛋白质的一种实验方法，可以用来研究蛋白质的表达水平和功能。
RT-PCR是一种将RNA逆转录为DNA的技术，可以用于检测和测定RNA的含量及其转录水平。
在分子生物学实验中，实验者需要进行一系列实验操作，如样品处理、核酸或蛋白质分离、电泳、转染等。
在样品处理过程中，实验者需要注意样品的选择、保存和预处理，确保实验结果的准确性。
核酸或蛋白质分离是将混合物中的目标分子从其他成分中分离出来的过程。
电泳则是一种利用电场将分子按照大小和电荷进行分离的方法，常用于检测DNA、RNA和蛋白质。
转染是将外源DNA或RNA导入到细胞中的过程，通常用于基因表达、基因沉默以及细胞信号传导等研究中。
分子生物学实验还需要合理选择实验方法和实验设计，制定实验方案和步骤，并采集实验数据进行分析和解释。
通过科学的实验设计和精确的实验操作，可以获得可靠的实验结果，为生物学研究提供有力的支持。
总之，分子生物学实验是一种重要的实验方法，它为我们深入了解生物体内分子机制提供了有力的手段。
通过不断开展分子生物学实验，我们可以揭示更多生物学现象的分子机制，推动生物学领域的发展和进步。
分子生物学实验
物、小麦胚芽提取物等
表达蛋白的纯化
• SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰
胺胶分离不同大小的的蛋白。
• 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树
脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白， 利用亲和层析洗脱出目标蛋白
• 自动核酸/蛋白纯化工作站
目标蛋白功能分析
克隆化基因的表达及表达蛋白的纯 化和功能分析
•
克隆化基因的表达
•
表达蛋白的纯化
•
功能分析
克隆化基因的表达
• 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的
反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一 致的DNA片段（通过测序确证）
• 体内表达：选择合适的表达载体插入目标
片段。利用化学方法或电转化仪等手段转 入细胞表达
• 抗体的制备：多抗、单抗 • DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、
蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等
• 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交
系统、噬菌体表面展示技术等
蛋白体内表达研究
• Western blotting：利用抗原-抗体反应，对
蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定 量
• 铺板培养后通过蓝白
斑，原位裂解杂交分 离出含有目标质粒的 单个菌落
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR或RACE
电泳
凝胶成像系统
长波紫外观察箱
切胶
胶回收试剂盒
T载体、平末端载体 转化细菌并铺板培养
筛选目标菌落
提取目标质粒
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR仪
PCR或RACE
Taq酶、薄壁管、矿物油
分子生物学实验
分子生物学实验引言分子生物学是研究生物分子结构与功能的一门学科，通过实验手段来研究分子水平上的生物现象。
分子生物学实验是该学科的基础，通过实验可以得到有关分子生物学的重要数据和结论。
本文将介绍分子生物学实验的基本原理、实验方法和常用技术。
实验目的分子生物学实验的目的是为了研究和探究生物分子结构、功能和相互作用，揭示生物体内基因表达和调控的机制。
具体实验目的可以根据研究方向和课题的需求来确定。
实验材料和仪器•DNA/RNA样品：可通过提取方法从细胞或组织中获得。
•酶：常见的酶有限制性核酸内切酶、DNA/RNA聚合酶等。
•缓冲液和试剂：用于调节反应条件和提供必要的物质。
•电泳仪：用于分离和检测DNA/RNA片段。
•PCR仪：用于DNA扩增反应。
•逆转录仪：用于合成cDNA。
•光镜和荧光显微镜：用于观察和记录实验结果。
基本原理DNA/RNA提取DNA/RNA提取是分子生物学实验的基础步骤，通过此步骤可以从细胞或组织中提取出DNA或RNA，并用于后续反应。
提取方法主要包括细胞破碎、蛋白酶处理、有机溶剂抽提和纯化等。
聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种在体外合成DNA的方法，能快速扩增DNA序列。
PCR反应需要DNA模板、引物、聚合酶和核苷酸等组分，通过多个循环的温度变化，重复进行DNA的核酸链分离、引物结合和DNA合成等步骤，达到扩增目标序列的目的。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离DNA/RNA片段的方法。
将DNA/RNA样品加入琼脂糖凝胶孔隙中，加电使其迁移，根据片段大小不同，进行分离和检测。
凝胶电泳主要分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）PCR-RFLP是一种通过PCR扩增后的DNA样品再经由限制性核酸内切酶的切割，根据不同的酶切位点产生不同的DNA片段组合，从而区分不同基因型的方法。
PCR-RFLP常用于基因型鉴定和基因突变检测等。
基因克隆基因克隆是研究分子生物学的重要方法之一，通过将DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA，再将其转化到宿主细胞中，实现大量复制和表达目的基因。
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所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：
① 样品细胞或组织的有效破碎；
② 有效地使核蛋白复合体变性；
③ 对内源RNA酶的有效抑制；
④ 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；
⑤ 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要 可采用两种途径:1、提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出 来；2、直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有 机相而RNA留在水相。
55 ℃ 30 ″
3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′端开始， 结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA
量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板
层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相 层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
（二）mRNA的提取
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最 为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（ A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓 冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的
1.3 去除RNA酶的实验用品处理
①
DEPC水：每1L双蒸水中加入1mL DEPC，终浓度为0.1%，
于室温搅拌过夜，高压灭菌。
②
金属解剖器具和玻璃器皿经180℃烘烤5小时，以灭活 RNA酶。
③
塑料离心管、枪头及枪头盒等塑料用品均用DEPC水浸 泡过夜后，高压灭菌烘干后使用。
④
琼脂糖凝胶电泳槽、制胶模具用3%的过氧化氢浸泡过
，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。
PCR 的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
PCR技术原理
Template DNA 5 Primer 1 5 Primer 2
5
5
Cycle 1
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5 5
5 5
5 5
实验相关知识及操作方法
1. 2. 3.
RNA提取 琼脂糖凝胶电泳
PCR及反转录
二、RNA提取的基本原理与方法
（一）总RNA提取的基本原理与方法
1、原理
通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提
RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶 无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要 注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 提取步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
④ 将溶液臵于离心柱中，静臵2分钟，≥8000rpm 离心30S，若一次加不完，可分两次离心。 ⑤ 用通用洗柱液洗两次。
⑥ 短暂干甩后，用RNA洗脱液洗柱，室温离心干
燥30S ，溶解总RNA。 ⑦ 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。
RNA提取注意事项：为防RNA降解，带手套、口罩，少说话； 试剂均为有机挥发试剂，有毒，需在通风厨操作，屏息，若不
分子生物学实验
2010-2011第二学期
目的：掌握分子生物学基本技术，主要包括
RNA提取、反转录、PCR、电泳等
内容：罗非鱼18S基因的cDNA克隆
① ② ③ ④ ⑤
总RNA提取 电泳检测 cDNA合成 PCR扩增 PCR产物的分离、回收和纯化
时间安排： 5月24日 实验准备一：1.3去除RNA酶的实验用品处理 5月25日 实验准备二：灭菌干燥离心管、枪头 5月26日 总RNA提取和电泳检测 5月27日 cDNA合成和PCR扩增 5月28日 PCR产物回收和纯化
Cycle 3
5 5
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。
反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着
循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增
多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种
用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
2、MgCl2:
（1.5～2.0mM）
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片 段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活 性显著下降。
聚合酶链式反应技术
PCR技术：1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可
以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。
优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快 速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等 领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子 克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。
6. 将样品置震荡器上混匀，短暂离心。用加样器吸取样品。依
次分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶
点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。 7. 接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出 ，在紫外灯下观察结果。
影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素：
1. DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子 量的对数 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段大小（kb） 值成反比。 0.4 5~60 2. DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA 0.7 0.8~10 分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分 0.4~6 子快。 1.0 1.5 0.2~4 3. 琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶 1.75 0.2~3 中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中 2.0 0.1~3 ，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分 离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段大小（kb） 4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会 降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用 电压成正比。
引物5’ 端之间的DNA片段。
二、PCR反应体系：终浓度
1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性
25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μ g / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作
Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。
DNA扩增的传统方法：
一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载
体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵 扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技 术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到 数月的时间，且不利于普及。
一、PCR的原理：
有机溶剂：RNA提取试剂为有机挥发试剂（硫氰酸胍-苯酚、
氯仿、异丙醇），均有毒，需在通风厨操作或屏息操作，少
讲话，以免将有毒气体吸入体内。若试剂不小心沾到皮肤上， 请立即用自来水冲洗；
EB：溴化乙锭，是诱变剂，具有高致癌性，配制使用时，应 戴乳胶手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是 接触过EB的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或 弃去。
浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过
两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
总RNA提取（柱式动物RNAout） ① 从低温冰箱(–80℃)中取出肝脏样品，剪取小块（约为
50-100mg）后加入1 ml的溶液A，用1ml一次性塑料注射
器抽打匀浆。 ② 匀浆液室温放臵（15℃–30℃）1分钟以便细胞充分裂解， 每1 ml 溶液A加入0.2 ml的氯仿，用力振荡30秒后，室 温放臵1分钟以便溶液分层，总RNA存在于上层水相中。 ③ 室温，12,000×g离心3分钟，将上清液移至干净的1.5 ml离心管中，加入相同体积溶液B，颠倒混匀。
夜后，用DEPC水洗净备用。
1.5移液枪的正确使用
1.
选择合适量程；
2.
3.
对应合适枪头；
吸液后轻放以避免将液体吸入到枪体内；
4.
用完后调回最大量程。
1.6安全注意事项
DEPC：焦碳酸二乙酯，是强的蛋白变性剂和致癌物。开瓶 时要使瓶子尽可能远离操作者，因为内部的压力可能导致飞 溅。操作中应戴上手套，并在通风厨中进行；
要求：
1、分组实验，以小组为单位进行考核，即以各小
组实际的实验结果进行评分，不另外安排考试。
2、实验结果主要包括：总RNA电泳图、PCR电泳
图，每小组交一份实验报告，实验报告需对实验
结果进行分析讨论。
1 材料 1.1 实验鱼 罗非鱼购自农贸市场，碎冰速冻麻醉后分离垂体、肝脏 组织，立即臵于TRIZOL试剂，或臵于-60℃超低温冰箱保存。 1.2 试 剂 1. 柱式动物RNAout（总RNA 提取试剂盒） 2. RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit （反转录试剂盒） 3. ExTaq PCR kit（PCR反应试剂盒） 4. E.Z.N.A Gel Extraction Kit（胶回收试剂盒） 5. 100bp DNA Ladder
Section2 凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离 ，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象 的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电 压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其