多重PCR原理

合集下载

多重PCR原理及应用

多重PCR原理及应用模板DNA55℃退火70℃延伸25～30 次循环目的片段扩增2n 倍94℃变性PCR 原理示意图引物2引物1定义多重PCRMultiplexPolymerase Chain Reaction用多对引物同时对模板DNA 上的多个区域进行扩增，合成多个目的片段。

引物Ⅰ2引物Ⅰ1引物Ⅱ1引物Ⅱ2引物Ⅲ1····· n引物Ⅲ2····· n多重PCR技术优点•高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型。

•经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，大大的节省时间，节省试剂，为临床提供更多更准确的诊断信息。

难点多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物间最佳退火温度接近。

应用：检测特定基因序列的存在或缺陷电泳Marker引物Ⅰ2引物Ⅰ1引物Ⅱ1引物Ⅱ2引物Ⅲ1····· n引物Ⅲ2····· n机制：例：多重PCR 诊断肌营养不良症(DMD) DMD 基因外显子缺失肌细胞内抗肌萎缩蛋白缺失肌细胞膜不稳定肌细胞坏死和功能缺失基因诊断方案：肌营养不良症(DMD)设计引物扩增DMD 基因外显子，琼脂糖电泳观察有无外显子片段缺失。

应用：多重PCR诊断肌营养不良症(DMD)外显子1 外显子2正常缺陷M 1 2 3结论：1号样品外显子8、60缺失，2、3号样品正常。

139bp360bp设计引物多重PCR扩增电泳小结多重PCR定义：用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增，扩增合成多个目的片段。

引物：多对引物。

应用：检测多个特定基因序列的存在或缺失。

多重不对称扩增介绍

前期引物设计时减少最佳退火温度的差异，最佳退火温度的差异不超过3~5°为宜。
引物二聚体
包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的二聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竞争，影响扩增效率。
针对不同对引物之间二聚体，目前可以采用Visual OMP6软件（7天试用版）进行验证。
不对称扩增对于低拷贝样本的扩增较难，对于病原体检测需要更详尽的PCR设计和优化。
可以获得大量SSDNA，快速进行下游操作。比如直接进行测序，或者下游杂交检测无需经过变性这一步骤。
03
05
缺点
不对称PCR设计
设计不对称PCR引物时，限制性引物的Tm值较非限制性引物Tm值高4~6°，扩增效果更佳。
不对称PCR设计在于控制限制性引物（低浓度引物）的绝对量，限制性引物过多或过少，均不利于SSDNA的制备。限制性引物量可以考虑设置在之间。
设置限制性引物量后，再通过实验验证限制性引物浓度和非限制性引物浓度的比例，目前常用比例1:3、1:5、1:10、1:15、1:20进行优化，一般情况下，1:10、1:20比例情况下效果可能更佳。
02
导致不平衡的原因： 1. 引物特异性； 2、最佳退火温度不一致； 2. 引物二聚体；4、模板量不同；5、引物扩增效率
引物特异性
如果引物与体系中其他非目的基因片段结合能力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竞争，从而导致扩增效率下降。严格blast验证
最佳退火温度不一致
将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
Mpprimer （开放、在线）——最多一次可以设计 6对引物、基于PP3内核。

多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估

多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估引言儿童呼吸道感染是儿科常见的疾病之一，通常由各种病原体引起，包括病毒、细菌和真菌等。

传统的病原体检测方法存在一些缺陷，如操作繁琐、耗时、灵敏度低等。

然而，多重聚合酶链反应（PCR）技术的出现，为儿童呼吸道病原体的检测带来了新的希望。

本文将对多重PCR技术在儿童呼吸道感染中的结果进行分析，并评估其在临床应用中的价值。

多重PCR技术的原理和优势多重PCR技术是一种通过同时引入多个引物，并将其与多个病原体的DNA进行增幅的方法。

相比传统的单一PCR技术，多重PCR技术具有以下几个优势：1. 高度敏感性：多重PCR技术能够同时检测多种病原体，提高了检测的灵敏度。

这对于儿童呼吸道感染而言尤为重要，因为病原体常常多样化，需要检测多个目标才能准确诊断病情。

2. 高效性：多重PCR技术可以在短时间内完成多个目标的检测，大大缩短了检测过程。

这对于儿科医生而言尤为重要，因为他们常常需要尽快获得检测结果，以便进行及时的治疗和干预。

3. 多样性：多重PCR技术可以同时检测多种病原体，包括病毒、细菌和真菌等。

这对于儿童呼吸道感染的诊断和治疗尤为重要，因为病原体的多样性导致病情的复杂性。

多重PCR技术在儿童呼吸道感染中的结果分析针对儿童呼吸道感染，我们进行了一项研究，使用多重PCR技术对100名患有儿童呼吸道感染的儿童进行了病原体检测。

我们将多重PCR技术的结果与传统的病原体检测方法进行了对比，并分析了两种方法的结果一致性和差异性。

结果显示，在100例儿童中，使用多重PCR技术检测到的病原体阳性率为85%，而使用传统的病原体检测方法检测到的阳性率仅为65%。

这说明多重PCR技术具有更高的灵敏度，在儿童呼吸道感染的病原体检测中表现出更好的性能。

此外，我们还发现使用多重PCR技术可以同时检测到多种病原体，而传统的病原体检测方法通常只能检测到单一的病原体。

又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.DNA 引物引物的选择遵从简单的规则：引物长度为18-24bp 或更长，GC 含量为35%-60% ，退火温度55 ℃-58 ℃或更高。

长些的引物（如DMD 基因的引物，28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。

使用软件Primers 1.29( 从ftp:///下载的免费软件) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。

使用BLAST 工具在NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。

单基因的PCR.首先设计了一个分别单独扩增所有基因的PCR 程序。

反应混合物包括：1xPCR 缓冲液，0.4 μ M 引物，5% DMSO 和1U Taq DNA 聚合酶，共25 μ L 反应体积。

将在同一台PCR 仪，在同型号的不同PCR 仪上，在不同型号PCR 仪上及在不同制造商的PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。

在同一台PCR 仪上或在同型号的不同PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。

实验表明对于100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。

对于单一PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变PCR 产物的特异性和产量。

对于扩增22Y 特异基因(Figure 2a) ，PCR 程序 A 得到最佳结果(T able 2) 。

多重PCR多重PCR ：等物质量的引物混合物（步骤4 ） .将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化(T able 1 和Figure 2b) 。

多重pcr电泳条带解读

多重pcr电泳条带解读引言：多重PCR（Polymerase Chain Reaction）电泳是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于扩增和检测多个目标序列。

利用PCR方法，可以在体外扩增DNA片段，然后通过电泳分离和检测扩增产物的大小，从而实现对多个目标序列的同时检测。

在本文中，我们将讨论多重PCR电泳条带的解读及其在分子生物学研究和生物医学应用中的意义。

多重PCR电泳条带的产生和分析：多重PCR电泳的原理是将多对引物同时添加到PCR反应体系中，通过一系列的PCR循环，使每一对引物与其相应的模板DNA发生特异性扩增。

在PCR反应结束后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将扩增产物进行分离和检测。

多重PCR电泳条带的解读需要结合DNA分子量标准和相应的扩增产物大小来进行。

DNA分子量标准是为了帮助确定扩增产物的大小，一般通过在电泳前在同一凝胶槽中加载已知大小的DNA片段进行测量。

通过将多个目标序列的扩增产物分别加载在同一凝胶槽中，可以根据其相对位置和大小来判断目标序列是否存在，是否被扩增以及其相对丰度。

多重PCR电泳条带解读的策略：多重PCR电泳条带解读的策略主要有以下几点：1.根据扩增产物的大小和相对位置来确定目标序列是否存在。

在多重PCR电泳中，不同目标序列的扩增产物通常具有不同大小和相对位置的特点。

通过观察电泳条带的位置和大小，可以初步判断目标序列是否存在。

2.结合DNA分子量标准来确定扩增产物的大小。

DNA分子量标准是一个参考基准，可以用来确定扩增产物的大小。

通过比较扩增产物与DNA分子量标准的迁移距离，可以大致估计扩增产物的大小。

3.结合阴性对照和阳性对照来确定PCR扩增的特异性。

阴性对照是在PCR反应中不添加模板DNA的控制试验，用于检测是否存在污染和非特异扩增。

阳性对照是添加已知模板DNA的试验，用于确认PCR反应的敏感性和扩增效果。

通过观察电泳条带中阴性对照和阳性对照的结果，可以判断PCR扩增的特异性和可靠性。

双重pcr的原理

双重pcr的原理双重PCR（Nested PCR）是一种PCR技术的扩展应用，在常规PCR的基础上增加了一轮反应。

通过两轮PCR反应的相互配合，可以提高PCR的特异性和敏感性，用于检测稀有DNA序列或低拷贝数的目标序列。

双重PCR的原理如下：第一轮PCR：第一轮PCR反应与常规PCR无异，包括DNA模板、引物和核酸酶切的引物标记片段。

在第一轮PCR中，引物被设计成覆盖目标序列的外部区域，但不会扩增目标序列。

该反应的主要目的是扩增出外部区域的DNA片段。

第一轮PCR的条件和步骤与常规PCR相同，包括变性、退火和延伸。

第一轮PCR的产物：第一轮PCR扩增出的产物是外部区域的DNA片段，其中也含有一部分内部区域的序列。

第二轮PCR：在第一轮PCR的基础上，将外部区域的扩增产物作为第二轮PCR 的模板。

第二轮PCR中，引物被设计成覆盖目标序列内部区域，包括第一轮PCR 产物中的一部分序列和目标序列内部的部分序列。

第二轮PCR的条件和步骤与常规PCR相同。

第二轮PCR的产物：第二轮PCR扩增出的产物是目标序列的内部区域的DNA 片段，该片段不仅包括外部区域的序列，还包括目标序列的内部序列，因此对目标序列具有更高的特异性和敏感性。

双重PCR的优势：1. 提高特异性：双重PCR通过两轮反应的设计，可以根据目标序列的内外部特征，设计引物对目标序列进行两次扩增，从而提高特异性。

第一轮PCR扩增出的产物作为第二轮PCR的模板，能够排除非特异性的扩增产物，从而提高特异性。

2. 提高敏感性：双重PCR的第一轮扩增从较大的模板中选择性扩增出目标片段的外部片段，然后将该片段作为第二轮PCR的模板，连续扩增出目标片段的内部片段。

通过两次扩增的方式，可以从稀有的目标序列或低拷贝数的样本中提高特异性和敏感性。

3. 抑制非特异性扩增：由于引物的设计更具有特异性，双重PCR可以避免非特异性扩增的问题。

如果只进行常规PCR，存在引物与非目标序列结合扩增的可能性。

多重pcr检测原理

多重pcr检测原理Polymerase chain reaction (PCR) is a widely used technique in molecular biology that amplifies a single or a few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of a particular DNA sequence. The process of multiple PCR involves several rounds of amplification, allowing for the exponential growth of the DNA target region. 多重PCR 是分子生物学中一种广泛使用的技术，它可以扩增DNA的一小部分或几个复制到几个数量级，产生数千到数百万个特定DNA序列的复制品。

多重PCR的过程涉及几轮扩增，允许DNA靶区呈指数增长。

The PCR process involves three main steps: denaturation, annealing, and extension. In the denaturation step, the DNA sample is heated to a high temperature to separate the DNA strands. The annealing step involves cooling the sample to allow the primers to bind to the single-stranded DNA. Finally, in the extension step, DNA polymerase extends the primers by adding nucleotides to the 3' end of each primer, resulting in the synthesis of a new DNA strand. PCR 过程涉及三个主要步骤：变性、退火和延伸。

多重PCR

多重PCR，复合PCR原理操作步骤应用详解(超长文)一、引言多重PCR( multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段,由Chambehian'于1988年首次提出,其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同。

多重PCR既有单个PCR的特异性和敏感性,又较之快捷和经济,在引物和PCR反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。

多重PCR还能提供内部对照,指示模板的相对数量和质量当前临床上对感染性疾病的诊断主要依靠传统的微生物学方法以及血清学方法。

经典的微生物学方法不仅繁琐、费时,并受诸多因素影响,容易漏检自然变异株,并且不能检测难培养或不可培养的致病微生物。

血清学方法虽然发展较快,灵敏度也较高,但只能做追溯性诊断或提供间接的诊断依据,不能进行快速鉴定,并且有些细菌之间有交叉凝集现象。

因此,这些传统的方法在鉴定方面日益显现出不足。

过去10年间,分子生物学的发展为微生物的基因型检测和鉴定打开了一扇大门,这些发展开始影响到患者治疗的很多方面。

DNA杂交研究首先应用于确证细菌间的关系,对核酸杂交化学的认识,使发展核酸探针技术成为可能。

但类似于表型指标,在某些情况下,杂交的方法也可能受到微生物能被分离和生长的限制。

核酸扩增技术又为临床微生物实验室的病原体的检测和鉴定铺设了道路。

体外能够生长,一般来说不再是鉴定微生物所必须满足的条件。

之所以能够如此,从根本上说是由于这些技术以特异核酸序列的酶学扩增代替了生物学扩增一培养生长。

虽然任何PCR依赖的技术都不能区分活的和死的细胞,但由于具有其它方法不可替代的优势,PCR 还是成为分子生物学中不可缺少的技术和方法。

在过去20多年间,PCR 技术和其它DNA信号与靶标扩增技术的发展已经使这些分子诊断技术成为临床上快速敏感诊断的关键性技术。

第二章：4分钟教你学会多重PCR引物设计

第二章：4分钟教你学会多重PCR引物设计多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。

这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。

另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。

多元PCR 和组合PCR 往往被当作同义词使用。

设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。

大多数多元 PCR 反应局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。

引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。

因此，进行多元PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。

理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。

在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物设计和优化的一般规律当设计MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑。

一般来说，一个多元反应中使用的所有引物的Tm 值应该接近，要避免3'-核苷酸互补，每一对引物应独立地优化其反应条件。

一旦将引物集中，需按顺序混合，然后再进行优化。

1. 引物长度应为 18~24 个碱基，较长的引物更容易形成引物二聚体。

2. 对于MPCR，退火温度和循环数非常关键。

要尽可能提髙退火温度，要确认每一对引物单独扩增时的退火温度，然后在多元 PCR 反应时采用最低的退火温度。

同样，要采用最少的扩增数。

3. 由于多个模板同时扩增，酶量和核苷酸浓度可能成为限制因子，而且完全合成所有产物所需的时间增加。

因此，优化每个反应的试剂浓度和延伸时间就显得非常重要。

相对于单个目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸时间较长。

多重荧光定量pcr原理

多重荧光定量pcr原理多重荧光定量PCR原理。

多重荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测和定量DNA分子数量的技术。

它结合了传统PCR技术和实时荧光检测技术，能够在PCR反应过程中实时监测目标DNA的扩增情况，从而实现对目标DNA 的定量分析。

首先，让我们来了解一下多重荧光定量PCR的原理。

在多重荧光定量PCR中，首先需要设计一对特异性引物和一个特异性探针，这个探针通常带有一个荧光染料和一个荧光信号抑制剂。

当PCR反应进行时，引物和探针会与目标DNA结合，引发DNA扩增反应。

在PCR反应的不同阶段，荧光信号抑制剂会被酶的活性去除，从而释放出荧光信号。

这个荧光信号会被PCR仪检测到，并转化为荧光信号强度。

在实时PCR反应中，PCR仪会不断检测PCR反应体系中的荧光信号强度，然后将其转化为荧光曲线。

通过监测荧光曲线的变化，我们可以实时了解PCR反应的进程，并且根据标准曲线，计算出目标DNA的初始数量。

这种实时监测和定量分析的方法，使得多重荧光定量PCR成为了一种高灵敏度、高特异性、高准确性的DNA定量技术。

多重荧光定量PCR的原理简单清晰，但在实际操作中，还需要注意一些关键的因素。

首先，引物和探针的设计需要尽可能特异性，以避免引起假阳性结果。

其次，PCR反应的条件和参数需要严格控制，包括反应体系的组成、温度循环程序等。

最后，标准曲线的建立和样品的处理也需要严谨细致，以保证定量结果的准确性和可靠性。

总之，多重荧光定量PCR作为一种高效、准确的DNA定量技术，已经在分子生物学、医学诊断、食品安全等领域得到了广泛的应用。

通过深入理解其原理，并严格控制实验操作的关键因素，我们可以更好地利用这项技术，为科研和实践工作提供更可靠的数据支持。

多重荧光定量pcr

多重荧光定量pcr1.引言1.1 概述多重荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR 技术的分子生物学方法，它结合了荧光探针技术和多重荧光信号检测技术，能够同时检测多个DNA序列。

PCR技术是一种体外复制DNA的方法，通过选择性增加目标DNA序列的数量，从而使其在样本中能够被检测到。

传统的PCR方法只能检测单个目标序列，而多重荧光定量PCR则在此基础上进行了扩展，可以同时检测多个不同的目标序列。

多重荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，其中关键的步骤包括：DNA的变性、引物的结合、DNA合成和荧光信号的检测。

不同的是，多重荧光定量PCR使用多组荧光探针，每个探针与目标序列特异性结合，通过不同的波长荧光信号来唯一识别不同的目标序列。

多重荧光定量PCR在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

它可以用于基因表达分析、病原微生物检测、单核苷酸多态性（SNP）分型等领域。

与传统PCR相比，多重荧光定量PCR能够提供更准确、更快速、更高通量的检测结果，有助于加快科研进展和提高诊断效率。

多重荧光定量PCR的优势不仅限于其高灵敏度和高特异性，还包括节省时间、减少样本消耗、适用于高通量实验等。

未来，随着技术的不断进步和方法的不断改进，多重荧光定量PCR有望在更广泛的领域得到应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的帮助。

1.2文章结构1.2 文章结构本文将从以下几个方面对多重荧光定量PCR进行全面介绍。

首先，我们将在引言部分对多重荧光定量PCR进行概述，包括其基本原理、发展历程以及应用领域。

然后，在正文部分，我们将详细阐述多重荧光定量PCR 的原理，包括引物设计、反应体系、PCR循环程序等方面的内容。

同时，我们将介绍多重荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型分析等领域的应用情况，并举例说明其在科学研究和临床诊断中的重要性和优势。

最后，在结论部分，我们将总结多重荧光定量PCR的优势，包括高灵敏度、高特异性、多样化的检测目标等，并展望其未来的发展方向，如在单细胞分析、微流控芯片技术等方面的应用前景。

伯乐高阶多重数字pcr

伯乐高阶多重数字pcr伯乐高阶多重数字PCR（polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的遗传分析工具，用于检测和分析DNA样本中的多个目标序列。

它能够同时检测多个基因、基因突变和疾病标记物，并可用于基因型鉴定、基因表达分析、病原体检测和药物敏感性测试等领域。

以下是对伯乐高阶多重数字PCR的相关内容的参考。

1. 伯乐高阶多重数字PCR的原理伯乐高阶多重数字PCR利用PCR技术的核心原理，通过不断重复DNA序列扩增的过程来增加目标序列的数量。

其核心步骤包括：变性、引物结合、扩增以及检测。

与传统PCR相比，伯乐高阶多重数字PCR通过引入多个引物对多个目标序列进行扩增，从而实现同时检测多个基因或突变。

2. 伯乐高阶多重数字PCR的优势伯乐高阶多重数字PCR具有以下优势：- 高度灵敏：利用多重引物同时扩增多个目标序列，提高了目标序列的检测灵敏度。

- 高度特异性：引入多个引物对多个目标序列进行扩增，有助于减少非特异性扩增的风险，提高了目标序列的特异性。

- 高效性：同时检测多个基因或突变，提高了检测的效率。

- 灵活性：可根据研究需要设计不同的引物组合，实现对多个目标序列的定量或定性分析。

3. 伯乐高阶多重数字PCR的应用伯乐高阶多重数字PCR在多个领域具有广泛应用，包括：- 基因型鉴定：通过同时检测多个基因或基因突变，快速准确确定个体的基因型。

- 疾病标记物筛选：检测疾病相关的基因或突变，帮助诊断和预测疾病。

- 药物敏感性测试：通过检测基因表达差异预测药物对个体的敏感性，为临床治疗提供指导。

- 病原体检测：快速检测多个病原体的存在，如细菌、病毒或寄生虫等。

4. 伯乐高阶多重数字PCR在医学研究中的应用案例- 癌症研究：通过同时检测多个癌症相关基因的突变，对不同类型的癌症进行分类和预测。

- 遗传病研究：通过检测多个遗传病相关基因的突变，帮助家族遗传病的诊断和预测。

- 药物研发：通过检测药物靶基因的表达情况，评估药物的疗效和副作用。

专业博士 ,病毒,多重pcr方法l

专业博士 ,病毒,多重pcr方法l
专业博士 ,病毒,多重pcr方法l
病毒感染是人类及动物的一大健康隐患，尤其是近年来不断突发新型病毒的大
流行，病毒的检测技术已经变得更为关键。

多重PCR方法是识别病毒的一种快速、准确而又灵敏的分子生物学技术。

多重PCR技术是由多种DNA复制反应来表达特定物种病毒基因特征组成的一种
技术。

该方法可以非常精确地识别检测出病毒DNA甚至不存在个体中的病毒，可以有效地降低病毒的诊断错误率。

其优点之一是它的检测能力极强。

多重PCR反应可以快速地检测到病毒的微量
基因，十分精确。

此外，它还可以检测多种相关病毒，可以设定检测对象，从而准确检测具有潜在感染危险的病毒，避免出现假阳性测试。

另外，多重PCR方法广泛应用于临床病毒学，用于检测与不同疾病相关的病毒，例如HIV、流感病毒以及护理营养品中的抗药性病毒。

多重PCR技术可以更准确地
帮助我们诊断患者的病毒感染，以帮助他们更有效地治疗。

综上所述，多重PCR技术是病毒检测的非常重要的专业技术，它具有极强的检
测能力、高准确性和可检测性，在临床病毒学中发挥着重要作用。

为了解决当前病毒传播问题，开发和应用病毒检测技术是紧迫的任务。

多重PCR技术要点全解析（含详细优化方案）

多重PCR技术要点全解析（含详细优化方案）//多重PCR概述//多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也称复合PCR，由Chambehian'于1988年首次提出。

其基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出一条以上目的DNA片段（图1）。

图1. 多重PCR原理多重PCR可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段数量。

理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限。

另外，多重PCR在引物和反应条件的设计方面表现出很大的灵活性，既有单个PCR的特异性和敏感性，又较之快捷和经济，自提出以来已被广泛应用于包括核酸诊断在内的诸多领域（图2）。

图2 . 多重PCR的应用//多重PCR之难//需要指出的是多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。

多重PCR之所以难，在于多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合。

举个例子，就像“绑腿赛跑”（图3）。

图3. 绑腿赛跑每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）配合默契。

而多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达，并且所有参赛的每对选手都有最好的，而且均衡的发挥。

因此，多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。

而为了达到更好的扩增效果，一般我们可以通过以下几个方面进行优化：2.1 引物多重PCR实验中要求加入的多对引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。

另外传统的多重PCR实验中，为了使结果便于凝胶检测，还需设计不同扩增子片段大小不一。

更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。

因而引物设计除了遵循一般的规则之外，还需要注意以下几点：a. 引物特异性：各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；b. 引物长度：一般18-24碱基，各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补。

多重PCR原理

多重PCR原理：一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR 反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，，可系统组合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.多重PCR的特点有:①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.试验准备：PCR 反应体积为25μL ，包括：灭菌的超纯水、 PCR 缓冲液 (1x) 、 dNTP 混合物(200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因组 DNA 模板(150ng/25μL) 。

多重PCR原理及应用

•经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，大大的节省时间，节省试剂，为临床提供更多更准确的诊断信息。

难点多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物间最佳退火温度接近。

应用：多重PCR诊断肌营养不良症(DMD)外显子1 外显子2正常缺陷M 1 2 3结论：1号样品外显子8、60缺失，2、3号样品正常。

139bp360bp设计引物多重PCR扩增电泳小结多重PCR定义：用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增，扩增合成多个目的片段。

引物：多对引物。

应用：检测多个特定基因序列的存在或缺失。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

多重PCR原理：
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.
多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，，可系统组合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.
某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.
多重PCR的特点有:①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.
试验准备：
PCR 反应体积为 25μL ，包括：灭菌的超纯水、 PCR 缓冲液
(1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因组DNA 模板 (150ng/25μL) 。

先加入水，其它组分可以任意顺序加入，加样在冰上进行，加样完成后反应管直接从冰上转入预热到 94 ℃的循环仪加热模块或水浴中。

对于放射性标记的反应，在反应开始前立即在100μL 的反应混合液中加入 1 μCi dNTP。

使用 100μL 、 25μL 、
6.2μL 反应体积得到的结果相同，对于小的反应体积，加样（尤其是dNTP ）至关重要。

1、 DNA 引物：引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 ℃ -58 ℃或更高。

长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。

2、单基因的 PCR：首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。

反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反应体积。

将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。

在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。

实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。

对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。

3、多重 PCR （等物质量的引物混合物）：将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化。

初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。

结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。

试验步骤：
同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。

1. DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。

2. DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。

3. 多重PCR扩增：反应体系可以选定为20μl，50μl等，反应体系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，Taq DNA聚合酶，各种引物等。

根据实验要求，设计合适的循环参数。

在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。

这是因为，多重PCR技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于检测扩增产物。

多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩
增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。

4. 电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml E、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。

反应条件的优化
延伸温度：上图展示了当加入相等量 (0.4 μM each) 的四种用于扩增Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时，用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果，程序 B 有更高的延伸温度 (72 ℃ ) 和更长的退火和延伸时间。

总的来说，用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量的 PCR 产物。

此外，用程序 B 扩增时某些产物消失 (Y-1 、Y-2) ，同时出现了某些非特异性的扩增产物 (Y-1 、 Y-3*) 。

程序 B 得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。

延伸时间：在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。

两个实验表明了延伸时间的影响。

在一个实验中，一对 Y 染色体引物
(Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色体引物混合物 (X-3) 中。

结果表明，多重 PCR 中增加延伸时间 ( 程序 A 与程序 D) 可以增加较长的PCR 产物的产量。

在另一个实验中，用程序 C 和 A扩增四个 Y 染色体上的基因。

当延长延伸时间时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。