蛋白质的修饰和表达

外源DNA
酶切割
限制性内切酶
限制性内切酶
受体细胞
新突变质粒
转化
蛋白基因
退火
目的基因
核苷酸片段
重组质粒
筛选
表达
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盒
同时获得酶多切个割 突变体
式
蛋白基因
突
变
新突变质粒
核苷酸片段
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（二）定向进化（directed evolution）
• 范围：特定的蛋白质 • 条件：大量突变体、合适的筛选系统
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1、制造突变体
方法：易错PCR、DNA改组技术
易错PCR原理： 改变正常PCR反应体系 中某些组分的数量或者 质量，随即引入错误碱 基创造序列多样性的 DNA文库。 难点：适当的突变频率
DNA改组技术原理： 靶基因酶切产生随机DNA 片段，以3’-末端的片端为 引物和模板，随机互补结 合并延伸。 优点：突变率高、
表真达核载表体达(体ex系pr：es酵si母on、v昆ec虫tor、) 哺乳动物 为使插入的外源DNA序列可转录和翻 译成多肽链而特意设计的载体称为表达 载体。
类型
特点
应用
亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体
不可逆
光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点
不可逆
鉴别蛋白质
光反应基团
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
• PEG特点：亲水、不带电荷
• 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免 疫反应和酶的水解
• 修饰方式：活化-OH（剧烈条件）
的信号肽之后；
➢在目的基因的两端分别加上不同的亲和标签；
➢将目标基因插入到信号肽序列和插入序列之间
2、影响基因融合的因素：
➢融合蛋白接头的设计和选择 ➢构建融合蛋白的常用技术
问题？
3、 主要应用
➢利用其生物学功能 ➢利用其与受体结合的特异性，构建导向药物
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第三节 重组蛋白质的表达
克隆载体(cloning vector) 为依使据插其入宿的主外细源胞D的NA不序同列可被分扩为增: 而特 原意核设表计达的体载系：体大称肠为杆克菌隆载体。
修饰试剂
反应类型
TNBS
黄色复合物（420nm）
Baidu Nhomakorabea烷基化试剂
（卤代乙酸、芳基卤、芳族磺酸）
磷酸吡哆醛
光吸收
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（三）羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性质使蛋白质 分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很 有限，产物一般是酯类或酰胺类。
• 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团， 最广泛，可在较温和的条件进行
• 偶连基团：氨基、巯基、羧基
• 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、
酶降解作用降低……
?
• 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶
PEG 修饰脂质体包被的阿霉素
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四、蛋白质的化学交联和化学偶联
• 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。
• 偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。
侧链上的特定功能团发生化学反应 修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键
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（一）巯基的修饰
特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团
修饰试剂 烷基化试剂 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺
DTNB
反应类型 羧甲基化
光吸收 二硫键、 有颜色的TNB
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（二、氨基的化学修饰）
特点：亲和反应活性高 赖氨酸的ε –氨基
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二、基因的融合
• 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一 个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后， 获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功 能蛋白。
• 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者 多肽基因，实现两个基因的融合表达
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基因融合的策略
1、方法
➢将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当
适用不同物种
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2、筛选
方法：表型观察选择、高通量筛选 （1）噬菌体表面展示技术 概念：外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合存于噬菌体表面的技术 特点：基因型和表型统一在同一病毒颗粒内
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噬 菌 体 展 示 技 术 的 基 本 原 理
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（2）核糖体展示技术 原理：
该技术是基于一种稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的构象基 础。抗体蛋白与它的编码序列物理连接。抗体基因转录，产生 许多mRNA分子，每一个代表着不同抗体基因。mRNA分子与 细菌的核糖体孵育，然后mRNA翻译成蛋白质。每个复合体展 示一种不同的抗体，当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后， 一些能结合上去的复合体不会被洗去，该展示技术完全在体外 完成，并且不需要克隆就能完成大规模抗体库的构建。
（一）定点突变
• 定义：改变一个或两个碱基 • 特点：突变率高、简单易行、重复性好 • 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变 • 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清
除率，延长血浆半衰期
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1、重叠延伸PCR技术
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重 叠 延 伸
PCR 介 导 的 定 点 突 变20
2、快速定点突变
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质粒
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 第二节 第三节
蛋白质修饰的化学途径 蛋白质改造的分子生物学途径 重组蛋白质的表达
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第一节 蛋白质的化学修饰
一、蛋白质侧链基团的化学修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 四、蛋白质的化学交联和化学偶联
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一、蛋白质侧链基团的化学修饰
修饰部位：蛋白质的侧链基团 修饰机制：选择性的试剂或者亲和标记试剂与
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化学修饰影响条件
1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个 必要条件；
2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所 处的可反应和不可反应的离子状态；
3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机
溶剂可使蛋白质变性。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性
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蛋白质的化学交联
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蛋白质的化学交联
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蛋白质分子固定示意图
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第二节 蛋白质的分子生物学改造
• 基因突变 定点突变 定向进化
• 基因融合
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质粒
外源DNA
限制性内切酶
限制性内切酶 一、目的基因的获得
退火
目的基因
受体细胞二、重组
转化
五、外源基因在受体细胞内表重组达质粒
四带重筛、组选筛体的选细三和胞、鉴重定组接体受转了表达入重受组体目体的细的产胞细物胞17
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（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原 • 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是
链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形 成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形 成二硫键。