蛋白质的特性和分离纯化

蛋白质的理化性质与分离纯化-101109

III. Sepharose或Bio-gel A
琼脂糖凝胶
（３）凝胶过滤的原理：
当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白
质就可以穿入珠子的内部。
这样在洗脱时，小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
一、蛋白质分离纯化的一般步骤
1.蛋白质样品的前处理 2.蛋白质粗提液的粗分级分离 3.浓缩蛋白质的细分级分离
4. 蛋白质的结晶
二、蛋白质的分离纯化方法
分子大小主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力
（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法
任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中纯化出来。
但对任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离纯化
程序以获得高纯度的制品。
一、蛋白质分离纯化的一般步骤
1.蛋白质样品的前处理 2.蛋白质粗提液的粗分级分离 3.浓缩蛋白质的细分级分离
4. 蛋白质的结晶
一、蛋白质分离纯化的一般步骤
1.蛋白质样品的前处理
(1) 去除杂质：
透析流程
蛋白质等大分子不能透过半

蛋白质的理化性质与分离纯化

酸碱性质分子量胶体性质
紫外吸收
变性作用化学反应
分离纯化分析鉴定
生物化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化
蛋白质变性、蛋白质变性、沉淀与凝固蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团某些物理或化学因素，：某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变状态，状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生的暴露而易于沉淀，，溶解度下降物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白，物理性质：旋光性改变溶解度下降，理活性丧失，称为蛋白质的变性。理活性丧失，称为蛋白质的变性。沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；质不一定都是变性后的蛋白质。质不一定都是变性后的蛋白质。蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排，蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排，化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被有些变性蛋白质在一定条件下还不涉及肽键的断裂。不涉及肽键的断裂。蛋白酶水解。蛋白酶水解。引起蛋白质变性的因素。可以复性，是可逆变性。生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性生物学性质：原有生物学活性丧失，物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离抗原性改变。抗原性改变。高温、高压、紫外线、加热使蛋白质变性并凝聚成块状辐射、超声波、机械剪切等；辐射、超声波、机械剪切等；称为凝固。因此，强碱、有机溶剂化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质、重化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、金属盐等。金属盐等。一定发生变性。一定发生变性。

简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质

电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳离子交换剂（羧甲基纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
离子交换层析带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
将蛋白质样品的调至pH等电点附近。
（五）根据配体特异性的分离方
法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinitychromatography）是根据某些蛋白质与另一种称为配体 (Ligand）的分子能特异而非共价地结合。这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
是分离蛋白质的一种极为有效的方法
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质都可以盐析出来。

蛋白质的理化性质及分离分析

的空间结构被破坏（肽键不断裂，一级结构不变），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。
变性的因素及作用机制
1、变性理论
蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规则的紧密排列方式因氢键及其他次级键的破坏而变成不规则的松散排列方式。
2、引起蛋白质变性的因素：
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应
两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样反应肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫红，蓝紫受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度
六、蛋白质的颜色反应
2. 茚三酮反应灵敏度差。
3.考马斯亮蓝G-250 本身为棕色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高 1---1000微克/毫升
二、蛋白质的胶体性质
2、稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：
水化膜 ---- 通过氢键与水结合表面电荷---- 在非等电点状态下，双电层，带
同性电荷蛋白质分子互相排斥。
蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质在等电点的蛋白质
碱
－－
－
－
酸
－－－

蛋白质的分离、纯化和鉴定

碱酸
等点电时的蛋白亲水胶体）质（亲水胶体）
碱酸
－－－－－－－－
带负电荷蛋白质亲水胶体）（亲水胶体）
带正电荷蛋白质疏水胶体）（疏水胶体）
脱水 ++ + + + ++ +
脱水碱
不稳定蛋白颗粒沉淀）（沉淀）
酸
脱水－－－－－－－－
带负电荷蛋白疏水胶体）质（疏水胶体）
粗分级 fractionation）（rough fractionation）
盐析等电点沉淀有机溶剂分级沉淀层析凝胶过滤离子交换层析亲和层析
细分级 fractionation）（fine fractionation）
电泳
六、蛋白质混合物的层析分离方法
层析技术，亦称色谱技术，层析技术，亦称色谱技术，是利用混合物中各组分的物理、化学、生物性质的差别，的物理、化学、生物性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中（其中一个相为固定的，称为程度分布在两个相中（其中一个相为固定的，固定相；另一个相则流过此固定相，称为流动相）固定相；另一个相则流过此固定相，称为流动相）流动相并使各组分以不同速率随流动相移动，并使各组分以不同速率随流动相移动，从而达到分离各组分的效果。离各组分的效果。

4蛋白质的分离纯化和表征

• ◇ （2）蛋白质的沉淀
（1）蛋白质的胶体性质
• • 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，如一NH2， -COOH,-OH以及 –CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层，每克蛋白质分子能结合0.3～0.5克水。蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条下．都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。蛋白质溶液由于具有水化层—— 双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相凝集而沉淀。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜。
加热变性沉淀法
• 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是
由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破
坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2 )的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。
• • •
（2）蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性既然与质点大小、电荷和水化作用有关，那么很自然，任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性。

蛋白质的分离纯化.ppt

(3) 重金属盐沉淀法
(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法
(5) 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处于等电点时）。
少量盐类促进蛋白质的加热凝固。（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成）为支持物。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电荷效应、分子筛效应)。
盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有生命危险。
第四节
蛋白质分离纯化的一般原则
分离纯化某一特定蛋白Fra Baidu bibliotek的一般程序可以分为：
1、前处理 2、粗分级分离 3、细分级分离
1、前处理 (pretreatment)
分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。

蛋白质的分离、纯化

有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度离心技术，将不同密度的蛋白质进行分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
疾病标志物的检测
通过分离纯化技术，从生物样本中提取出特定的蛋白质标志物，用于疾病的早期诊断和监测。
药物靶点的筛选
利用蛋白质分离纯化技术，从生物样本中筛选出与药物作用相关的靶蛋白，为药物研发提供依据。
在食品工业领域的应用
1 2
功能性食品的开发
通过蛋白质分离纯化技术，获得高纯度的功能性蛋白质，用于开发具有特定功能的食品。
利用半透膜，根据不同物质之间的分子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进行分离，再通过染色或放射自显影等技术进行检测。
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。

蛋白质的理化性质和分离纯化

术。
（四）层析
层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋
白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分
离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同
速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利
空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无
序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生
物活性的丧失。
• 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 • 造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。
• 应用举例
临床医学上，变性因素常被应用来消毒及
二、蛋白质的分离和纯化
（一）透析及超滤法 * 透析(dialysis)
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分
开的方法。
* 超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留
分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。
（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
* 使用丙酮沉淀时，必须在 0 ～ 4℃ 低温下进行，
的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种

第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2

分段盐析
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清
(NH4)2SO4 50%饱和度
球蛋白
析出
清蛋白
饱和析出
2.有机溶剂沉淀反应
在蛋白质溶液中，加入一定量的与水
体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液
pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离性质。蛋白质在pH值低于或高于其pI时带有电荷，在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶电泳等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶.
蛋白质的呈色反应
蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白质定性、定量检测，如双缩脲反应。
蛋白质的颜色反应：
双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子大小与形状

蛋白质的性质及分类纯化基本方法

蛋白质在水溶液中的行为

酸碱性质

蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端a-氨基和a-羧基以及侧链上的各种官能团。因此蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。

胶体性质

蛋白质溶液是一种分散系统。在这种分散系统中，蛋白质是分散相，水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体，是由蛋白质分子与溶剂(水)所构成的均相系统。

蛋白质溶液是一种亲水胶体。蛋白质溶液由于蛋白质分子具有水化层与电荷两种稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相聚集而沉淀。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质。

蛋白质的沉淀

蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。

沉淀蛋白质的方法有以下几种：

(1)盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。

(2)有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加异性电荷间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易聚集而沉淀。

(3)重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。

(4)生物碱试剂和某些酸沉淀法当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易跟生物碱试剂和某些酸的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。

($)加热变性沉淀法几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。

蛋白质分离纯化的一般程序

1、前处理

分离纯化某种蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，避免丢失生物活性。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物离心或过滤除去，得到所谓粗提取液。如果所要的蛋白质主要集中在某一亚细胞成分，如细胞核、染色体、核糖体或细胞溶胶等，则可利用差速离

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质分离纯化是生物学研究的基础，也是生物技术的重要内容。蛋

白质的分离纯化包括各种技术，有基于物理性质的分离技术，基于化学性

质的分离技术，也有基于生物学性质的分离技术，以及结合物理学、化学

和生物学的复合分离技术。

（一）物理性质分离

物理性质分离是指根据蛋白质的热稳定性、电荷和非电荷性等物理性质，运用精馏、沉淀等方法来分离纯化蛋白质。例如通过超速离心可以将

悬浮于溶液中的悬液分离出来；用电泳来分离稠浆状溶液中的粒状固体；

通过精馏来分离不同分子量的蛋白质；结构性蛋白质可以利用蒸发或热稳

定性差异进行分离；在高倍弥散能够分离多肽链；通过简单沉淀和浓缩等

技术也可以分离纯化蛋白质。

（二）化学性质分离法

化学性质分离法是指根据蛋白质的氨基酸组成、汞结合能力、还原性、可溶性等化学特性，运用离子交换色谱、酸-碱色谱、凝胶电泳、乙醇沉

淀等技术来分离纯化蛋白质。

蛋白质分离纯化的方式及基本原理

蛋白质分离纯化是指将蛋白质从混合物中分离出来，并将其纯度提高到足够高的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。

蛋白质分离纯化的基本步骤包括取样、提取、分离和纯化。首先是取样，这是蛋白质分离纯化的第一步，其目的是从可用样品中取出一部分样品以进行分离纯化。接下来是提取，这是蛋白质分离纯化的第二步，主要是将蛋白质从样品中提取出来，以便进行后续处理。第三步是分离，这是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的有效分离。最后是纯化，这是将分离的蛋白质的纯度提高到足够的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。

蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。它是一个复杂的过程，涉及到各种技术，如沉淀、溶解、离子交换、硅胶等。分离的基本原理是利用蛋白质的分子特性，如电荷、大小、结构等，在不同的溶剂环境中，蛋白质的分子结构、分子质量和电荷状态会发生变化，从而使蛋白质的分离和纯化变得可能。

蛋白质分离纯化是一个复杂的过程，涉及到多种技术，其基本原理

是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。蛋白质分离纯化可以帮助我们更好地理解蛋白质的功能和结构，为后续的生物学研究和药物开发提供重要的信息。

蛋白质的分离和纯化

C.在蒸馏水和甲苯的作用下,细胞破裂,释放出血红蛋白
D.释放血红蛋白后再经过离心,就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来
6、下列有关血红蛋白提取和分离的相关叙述
中,正确的是
D
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤,其目的是去除
细胞表面杂蛋白
B.将血红蛋白溶液进行透析,其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C.血红蛋白释放时加入有机溶剂,其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
2、下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品
处理步骤的描述,正确的是 C
A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水,缓慢搅拌,低速短时间离心
B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌
C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后,用分液漏斗分离
D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋,然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h
凝胶色谱柱的装填
洗涤平衡：装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在50cm高的操作压下,用300ml的磷酸缓冲液 pH为7.0 充分洗涤平衡 12小时,
注意：1、液面不要低于凝胶表面,否则可能有气泡混入,影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果,2、不能发生洗脱液流干,露出凝胶颗粒的现象,
凝胶色谱柱的装填
凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,