电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质
家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性
家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性屈军梅1,黄庭汝2,屈孝初1,李文平1,陈平洁2* (1.湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙410128; 2.广东省农业科学院畜牧研究所,广东广州510640)摘要:将诱导家蝇提取的家蝇抗菌肽提取物,经凝胶过滤层析和离子交换层析,得到具有抗菌活性的单一峰,质谱结果显示抗菌肽分离物含有4种小肽,相对分子质量678.3～1017.2。
家蝇抗菌肽对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、巴氏杆菌)的抗菌活性优于革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌),对耐药性巴氏杆菌有较强的抗菌活性,对大肠杆菌的M I C为4.2～8.4mg/L,对耐药性巴氏杆菌的M IC为3.8～7.8mg/L。
扫描电镜观察发现,家蝇抗菌肽通过损伤细胞壁使细胞质外流而达到杀菌的目的。
家蝇抗菌肽对家兔、鸡、猪、小鼠、番鸭、鹅和家鸭红细胞无溶血反应和凝集反应。
关键词:家蝇;抗菌肽;生物学活性;质谱中图分类号:Q816;S852.74 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2007)03-0387-04Purification and biological activities of a antibacterial peptides from housefly QU Jun-mei1,HU ANG Ting-ru2,QU Xiao-chu1,LI Wen-ping1,CHEN Ping-jie2* (1.College of A nimal S cience and Technology,H unan A griculture Univer sity,Changsha410128,China; 2.I nstitute of A nimal Science,Guangdong A cad emy of A griculture S cience,G uangz hou510640,China) Abstract:A fter ant imicr obial peptide ex tr act s induced and ex tr acted fr om ho usefly(M usca domestica)wer e separ ated by sephadex G-50and CM-sepharo se,a sing le hill w ith antimicro bial activity w as o bt ained.By L C/M S/ M S analysis,it w as sho wed that purificatio n contained4peptides of678.3-1017.2.Antimicro bial peptide w hose activ ities ag ainst g ram-positive wer e bett er than ag ainst g r am-negat ive bacteria,had stro ng act ivity ag aint P.multocid a w it h dr ug resist ance.M IC of t he peptide wer e4.2-8.4mg/L on E scher ichia coli,and3.8-7.8mg/L on P.multocida.It was fo und by scanning elect ro n micro sco pe t hat ba ct erio cidal actions wer e accomplished thr ough injur ying cell membr ane and making cy topla sm flow ing o ut.T here w ere no hemolysis and hemagg lution of peptide to r ed cells of r abbit,chick,pig,rat,musco vy duck,g oo se and duck. Key words:housefly;antibacter ial peptides;biolog ical act ivites;electro spr ay ionization mass spectrum *Corr esp onding author 抗生素的发现对抗病原菌感染性疾病的治疗产生了巨大的影响,已成为人们对抗病原菌强有力的武器。
家蝇抗菌肽分子结构及抗菌谱研究
家蝇抗菌肽分子结构及抗菌谱研究【摘要】目的研究家蝇抗菌肽的分子结构和抗菌谱，寻找广谱高效天然抗菌肽。
方法家蝇被损伤感染诱导免疫后制成组织
匀浆，用蛋白质纯化技术分离纯化抗菌肽，
测定抗菌活性及抗菌谱，纳升电喷雾飞行时间质谱测定氨基酸序列。
结果家蝇组织提取液经蛋白质纯化，得到一纯化的抗菌活性成份，纳升电喷雾飞行时间质谱测序，得到
两个肽段的氨基酸序列：肽段和肽段 2. PNNVYYTK。
通过NCBInr蛋白质数据库检索，未发现有与之序列相匹配的蛋白质。
该抗菌肽对11种临床标本分离菌株铜绿色假单胞菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、普通变形菌、异形柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、福氏痢疾杆菌、表葡菌、耐甲氧西林金
葡菌(MRSA)和白念珠菌的MIC分别为：、、、、、、、、、和μmol/L。
结论本文得到的抗菌肽是一个新型抗菌肽，有广谱抗菌活性，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有一定的
抑制作用。
昆虫抗菌肽的分离纯化技术
昆虫抗菌肽的分离纯化技术Technical standard for isolation and purification of insect antimicrobial peptides昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准1范围本标准规定了昆虫抗菌肽的分离纯化技术要求，本标准以家蝇作为材料提纯血淋巴的抗菌肽。
本标准适用于以家蝇为材料的抗菌肽分离纯化，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。
本规程规定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS-PAGE电泳、抗菌肽活性测定方法等技术要求。
本规程适用于抗菌肽的快速分离。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。
GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》GB/T6682-2016《分析实验室用水规格和试验方法》GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定3术语下列术语和定义适用于本文件：3.1抗菌肽（antimicrobial peptides）抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是一种基因编码的、在体内诱导的、具有抗菌活性的碱性多肽物质，强碱性、热稳定性、对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性。
某些抗菌肽还具有抑杀肿瘤、中和内毒素、促进伤口愈合、调节免疫等多种生物学功能。
3.2家蝇（Musca domestica）在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。
幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。
3.3多肽（polypeptides）介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。
3.4多肽活力（antimicrobial activity）抑制微生物的能力，以抑菌圈直径（mm）来表示。
不同微生物诱导家蝇幼虫表达抗菌肽的特性
不同微生物诱导家蝇幼虫表达抗菌肽的特性翟培;侯丽霞;乐国伟;施用晖;韩晋辉;代卉【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2006(025)003【摘要】研究不同微生物诱导家蝇幼虫表达的抗菌肽特性.用3种不同的病源菌通过针刺感染的方法诱导家蝇幼虫表达抗菌肽,通过Sephadex G25分离,用Hult mark改进法和抑菌圈测定法作抑菌试验,用毛细管电泳(CE)分析不同微生物诱导得到的抗菌肽样品差异,检测抗菌肽的热稳定性和酸碱耐受性.发现不同微生物诱导产生的家蝇抗菌肽具有广谱抑菌性,但不同样品对不同病源菌抑菌活性有差异,不同测定抑菌效果的方法对抑菌结果有影响,各种抗菌肽样品CE蛋白谱具有明显不同.抗菌肽样品都具有热稳定性和酸碱耐受性.说明不同微生物诱导产生的家蝇抗菌肽类型以及抗菌肽含量与诱导源有关,抗菌肽为家蝇幼虫体内固有成分,诱导增加了抗菌肽的表达量同时刺激新抗菌肽的产生.用志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌诱导家蝇幼虫可产生较多含量高活性好的抗菌肽.【总页数】5页(P41-45)【作者】翟培;侯丽霞;乐国伟;施用晖;韩晋辉;代卉【作者单位】江南大学,食品学院食品营养与安全研究所,江苏,无锡,214036;江南大学,食品学院食品营养与安全研究所,江苏,无锡,214036;江南大学,教育部食品科学与安全重点实验室,江苏,无锡,214036;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏,无锡,214036;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏,无锡,214036;江南大学,食品学院食品营养与安全研究所,江苏,无锡,214036;江南大学,食品学院食品营养与安全研究所,江苏,无锡,214036;江南大学,食品学院食品营养与安全研究所,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】Q514.3【相关文献】1.家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性 [J], 徐建华;朱家勇;金小宝;许琴英2.家蝇幼虫抗菌肽粗提物与8种纯化物对SUP－B15细胞增殖抑制和诱导的凋亡作用 [J], 王文健;赵瑞君;李珀;杜斌;原发家;聂守民;程璟侠;李彦红3.家蝇幼虫抗菌肽的超声诱导及分离纯化和活性研究 [J], 陈曼;文阳安;周义文;涂植光4.一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测 [J], 李文婷;闫恕;张丹丹;贾博岩;唐艳;孔令聪;裴志花;刘树明;马红霞5.不同诱导方法诱导家蝇幼虫血淋巴中抗菌肽差异性的SDS-PAGE检测 [J], 常楚瑞;吴建伟;国果;付萍;董冰洁;杨滢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测
化获 得 纯 度 较 高 的 重 组 蛋 白， 采 用 管 碟 法 检 测 重 组 蛋 白 的 生 物 学 活 性。 结 果 显 示 ， 重 组 质 粒
ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ９ Ｋ— ＭＤ Ａ Ｐ一 ２ 获得 高 效表 达 ， 蛋 白分 子 量为 ７ ． ８ ｋ Ｄ， 管碟 法 检测 重组 蛋 白对 大肠 杆菌 与沙 门 氏 菌 均具 有体 外抑 菌 活性 。ＭＤ Ａ Ｐ一 ２基 因的成 功表 达 为进 一步研 究表达 产 物 的生物 学及 免疫 学 活性
裴 志花 ， 刘树 明 ， 马红 霞
（ １ ． 吉林农业大学 ， 动物科学技术学 院， 长春 １ ３ ０ １ １ ８ ； ２ ． 动 物 生 产 及 产 品质 量 安 全 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 吉林农业大学 ， 长春 １ ３ ０ １ １ ８ ） ［ 收 稿 日期 ］２ ０ １ ５—０ ７— ２ ３ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号］ １ ０ ０ ２—１ ２ ８ ０（ ２ ０ １ ５ ）１ １—０ ０ １ １— ０ ６ ［ 中图 分 类 号 ］ ￥ ８ ５ ２ ． ６
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｐｉ ｃ ｈｉ ａ ｐａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ ｗａ ｓ ａ ｐｐ ｌ ｉ ｅ ｄ ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｎｏ ｖ ｅ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ Ｍ ＤＡＰ 一２ ｇ ｅ ｎ ｅ
ＫＯＮＧ Ｌ ｉ ｎ ｇ—ｃ ｏ ｎ ｇ ， Ｐ ＥＩ Ｚｈ ｉ— ｈ ｕ ａ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｓ ｈ ｕ — ｍｉ ｎ ｇ ，Ｍ Ａ Ｈｏ ｎ ｇ— ｘ ｉ ａ ，
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家蝇抗菌肽生产及制剂研究的开题报告
家蝇抗菌肽生产及制剂研究的开题报告一、研究背景及意义家蝇抗菌肽作为一种天然的抗菌物质，在中国古代医学中应用已有数千年的历史，具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
目前，国内外已有很多家蝇抗菌肽相关的研究，但是还存在一些问题，例如生产工艺不成熟、制剂不稳定等，限制了其在医药、食品等领域的大规模应用。
因此，开展家蝇抗菌肽生产及制剂研究，对于提高家蝇抗菌肽的生产效率和制剂的稳定性，并加快其在各领域的应用具有积极意义。
二、研究内容与方法1. 家蝇抗菌肽生产工艺研究通过实验研究，确定家蝇幼虫的最适生产条件，包括饲料配方、温度、湿度、光照等方面的调控，以提高家蝇抗菌肽的生产效率和质量。
2. 家蝇抗菌肽制剂研究选择合适的载体，将家蝇抗菌肽制备成不同形态的制剂，包括液态、固态和半固态等。
通过实验考察制剂的稳定性、抑菌效果、毒性等方面的性质，确保制剂的安全有效。
3. 家蝇抗菌肽应用研究将制备好的家蝇抗菌肽制剂应用于不同领域，包括医药、食品、养殖、植保等，考察其应用效果和安全性，推广家蝇抗菌肽制剂的应用。
三、预期成果1. 确定家蝇抗菌肽的最适生产条件，并建立相应的生产工艺。
2. 制备出一系列稳定性好、抑菌效果优、毒性低的家蝇抗菌肽制剂。
3. 推广家蝇抗菌肽制剂的应用，促进其在医药、食品、养殖、植保等领域的应用。
四、研究意义1. 提高家蝇抗菌肽的生产效率和制剂的稳定性，有利于家蝇抗菌肽的商业化生产和应用推广。
2. 家蝇抗菌肽具有广泛的应用前景，能够广泛应用于医药、食品、养殖、植保等领域，具有巨大的市场价值。
3. 家蝇抗菌肽是一种天然的抗菌物质，具有绿色环保的特点，有利于促进生态环境的保护和促进可持续发展。
家蝇幼虫分泌物抗菌组分的抗菌效果观察及筛选(1)
平板滤纸片法检测抗菌活性，并观察其对金黄色葡萄球菌等多种细菌的抗菌活性。 结果经５０％～ ８０％硫酸铵盐析沉淀、ＳｅｐｈａｄｅＸ Ｇ一１００、Ｇ５０凝胶过滤柱层析分离得到一活性峰，该活性峰对大肠埃希
菌及金黄色葡萄球菌等细菌显示较强的抗菌作用，进一步用反相高效液相色谱纯化，该活性峰由３个活
性组分构成。 结论家蝇幼虫分泌物中含有３个抗菌组分，对多种革兰氏阳性及阴性菌具有较强的
参照ｗＨｏ－８。的方法，采用营养琼脂培养基，以 大肠埃希菌为指示菌种，通过测定抑菌圈直径榆测 抗菌活性。 １．５抗菌肽定性试验
茚三酮试验、双缩脲反应。 １．６抗菌肽浓度测定
采用美国ＰＩＥＲｃＥ公司的蛋白检测试剂盒，以 牛血清白蛋白（ＲＳＡ）为标准，绘制蛋白浓度标准曲 线，利用标准曲线计算出分离纯化各阶段的蛋白浓 度。 １．７抗菌肽对其他菌株的抗菌效果
样品
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幼虫分泌物租提液ｃｎｌｄｃｃｘｔｍｔｓ Ｓｅｐ｝划味Ｇ＿１００过滤层析组分Ｆｒａｃ Ｌｊｏｎ。ｆ ｓ印｝ｌａｄｅ）【Ｇ１００仙ｒａｔｌｏｎ ｓｅｐｈａｄｅｘＧ‘５０过滤层析组分Ｆｒａｃｔｌ呻。ｆ ｓ印ｈａｄ雌０５０ ６【ｔ卅１。ｎ 罂兰￡丝丝塑佥旦兰！生！堕！里！：￡罂盟ｉ望！ｉ些
洗脱时间Ｔｌ口ｅ（ｍｉｎ）
图３、４反相色谱抗菌多肽洗脱峰
№ ３ ４ Ｅｌｕｔ研１ ｐｅａｋｓ。ｆ ａｎ“ｋｔ商越ｈＢｄ研ｌ（８ｒ∞ｗ）ｗ Ｌｔｈ ｒ即ｃｒｓｅ ｐＩｍ靶ＨＰＬｃ
表１抗菌肽抗菌活性及浓度检测
‰ ｅ Ｉ Ｃｂｎ。∞ｔｒａｔｉ㈣Ｂ ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅ打ａｌ ａｃ“ｔｙ ｏｆ ａ１１廿ｂａｃｔｅｒ瑚ｐ印ｔｉｄｅｓ
传代；大肠埃希菌４１１３（Ｂｃ矗Ｐｒｉ咖么∞Ｚｉ）、金黄色葡 萄球菌２６１１２（Ｓ￡丑础∥ｏ∞叱“ｓ删理“ｓ）、绿脓杆菌 ＡＴＣ（２５８５３（Ｒｅ“幽ｍｏ咒口５伽俐威规。鼢）、枯草芽孢杆 菌６３５０１—２５（Ｂ口ｃ删“ｓ ｓ“沈饿ｓ）均由我院微生物学教 研室提供；凝胶过滤介质Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ＿１００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ＿５０由北京华美进口分装；甲醇（ＣＨ３０Ｈ）、乙腈 （ＡＣＮ）为美国Ｔｅｄｉａ公司（ＨＰＬＣ级）产品；三氟乙 酸为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；色谱柱为德国ＭＥＲＣＫ 产品；营养琼脂购自上海生物工程有限公司；其他试 剂均为国产分析纯；层析、色谱用水均为Ｍｉｌｌｉ—Ｑ超 纯水。 １．２家蝇幼虫分泌物粗提液的制备
一个家蝇抗菌肽的分离纯化
蝇 类生 活 在腐 败 肮脏 的环境 中 ， 内外携 带 很 （ Ｉ 体 Ｔ ＡＮＧＥ ； Ｎ） 其它试 剂 均为进 口分装 分析 纯 。 多病菌 而 自身 却无 感 染 ， 种适 应 恶 劣 环境 的能 力 这 ２ 主要 仪器 。层 析 系统 （ 典 Ａｍｅｓａ ； ） 瑞 ｒｈ ｍ） 分 预示着 它在 免疫 防御 方面有 着独 特 的机制 。从蝇 类 析兼 半 制 备 型 高 效 液 相 色 谱 仪 （ 国 Ａｇｌｎ） 美 ｉ ｔ； ｅ 中分离抗 菌 活性 物 质 ， 对抗 菌 药 物 的 开发 是 １种 新 Ｔ Ｋ （ＤＳＣ ８柱 （ ｍ， ． Ｓ ） ＿１ ５ ９ ４ ｍｍ ×２ ０ｍｍ， 国 ５ 美 的有效途 径 。 国外 学 者 在 肉蝇 、 绿蝇 、 果蝇 Ｌ 、 中 ３地 ］ Ｂ ｃ ｍａ ） 微量 蛋 白质垂 直 电泳 仪 和 电洗 脱 仪 （ ｅｋ ｎ ； 美 海实蝇 ［ 和厩螫 蝌 ｊ中分离 出具有 不 同抗 菌 活性 的 ｛ ］ 国 Ｂ ｏｒｄ ； 干 机 （ 同 Ｓ ｖ ｎ ） 高 速 冷 冻 离 心 ｉ￣ａ ） 冻 美 ａａｔ ； 抗菌肽 ， 但未 对家蝇 抗菌 物质进 行研 究 ， 同也 长期 我 机 （ 沙英 泰） 长 。 停 留在 免疫 应答 和血 淋 巴理 化 性 质 的研 究 阶 段 ， 直
出 １０多 种抗菌肽 。 目前根 据 昆虫抗菌 肽氨 基 酸 Ｃ ７ ＭＣ ３ Ａｍｅｓ ａ ； ２（ ｒｈ ｍ） 乙腈 （ ｉ ｅ） 三 氟 乙酸 Ｔ Ａ Ｆｓ ｒ ； ｈ Ｆ 组 成和结 构特点将 抗菌 肽分 为 ４ ［ 。 类 】 （ Ｅ Ｉ ； 烯酰胺 、 Ｔ Ｄ Ａ） 丙 双丙 烯 酰胺 ； 准 蛋 白分 子量 标
生 耐药性 等 特 点 。 自从 瑞 典 科 学 家 Ｂ ＯＭＡＮ 等 从 术 学 院微 生物 实验 室 提供 ）金 黄 葡萄 球 菌 、 草芽 ； 枯 惜古 比天 蚕的滞 育蛹 中分离 出第 １ 昆 虫抗 菌 肽之 孢 杆菌 （ 中科 技 大学 微 生 物实 验 室提 供 ）海 藻酸 个 华 ； 后， 科学 家陆续从 家 蚕 、 蚕 、 虫 等 昆虫 体 内分离 （ 典 Ｋ ｒｌ ｓ ａ学 院 赠 送 ） Ｓ ｐ ａ ｅ ５ｆ ｅ 柞 蚊 瑞 ａｏｉ ｋ ｎ ； ｅ ｈ ｄ ｘＧ２ ｉ 、 ｎ
家蝇幼虫培养及其抗菌肽的初步研究
家蝇幼虫培养及其抗菌肽的初步研究
家蝇幼虫培养及其抗菌肽的初步研究
通过天然家蝇幼虫的人工培养及Tricine-SDS-PAGE电泳,分离纯化出2种抗菌肽(命名为MDL-1、MDL-2),并检测了该抗菌肽的抑菌活性.MDL-1的相对分子量10772Da,MDL-2的相对分子量6091Da.实验结果表明:剩肉菜(骨头和虾皮等)对天然家蝇的产卵引诱力最大;红糖和奶粉的最佳比例为3:1;家蝇幼虫食料最佳含水量为80%;家蝇幼虫单体平均增重最大的最佳培养基为麦麸和骨头的混合物.抑菌活性检测结果:MDL-1对枯草芽胞杆菌的抑菌效果最强,大肠杆菌次之,金黄色葡萄球菌最差;MDL-2对大肠杆菌的抗菌效果最好,金黄色葡萄球菌次之,枯草芽胞杆菌稍差.
作者：凌庆枝袁怀波赵帅魏兆军江力姜绍通 LING Qing-zhi YUAN Huai-bo ZHAO Shuai WEIZhao-jun JIANG Li JIANG Shao-tong 作者单位：合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009 刊名：食品科学ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE 年，卷(期)：2006 27(11) 分类号：Q969.9 关键词：天然家蝇幼虫人工培养抗菌肽 Tricine-SDS-PAGE 电泳抗菌活性。
家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究
昆虫学报Acta Entomologica Sinica,February2007,50(2):106-112ISSN0454 6296家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究陆婕*,钟雅*,柳林,付康,陈正望**(华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所,武汉430074)摘要:蝇蛆抗菌肽多有广谱抗菌、抗癌等功能,是很好的天然抗菌药物来源,但由于得率较低,目前对其产品开发的研究较少。
以家蝇Musca domestica干蝇蛆为原料,利用加热 层析法和海藻酸吸附法2种工艺提取蝇蛆抗菌肽。
结果表明:加热 层析法快速、简便,抗菌肽提取得率达0 26%,是海藻酸吸附法提取抗菌肽得率的5 2倍。
提取的家蝇抗菌肽主要是分子量6 2~17 2kD、等电点5 59~5 91的弱酸性小分子多肽,其热稳定性高,能杀灭枯草杆菌Bacillus subtilis等多种革兰氏阳性菌。
加热 层析法能有效去除外源性蛋白酶,保证肽类产品的稳定性,同时还能提取出非蛋白类的抗菌成分,提示其对开发具有高附加值的抗菌产品将会有良好的应用前景。
关键词:家蝇;抗菌肽;提取工艺;资源利用;抗菌产品中图分类号:Q514 3文献标识码:A文章编号:0454 6296(2007)02 0106 07Optimization of extraction technique for antibacterial peptides from Musca domestica larvaeLU Jie*,Z HONG Ya*,LI U Lin,FU Kang,CHEN Zheng Wang**(Institute of Biophysical and Bioche mistry,Colle ge of Life Science and Technology,Huazhong University of Science and Tec hnology, Wuhan430074,China)Abstract:It is not good enough to produce antibacterial peptides by genetic engineering because of much technology troubles involved and the mono kind of peptide with narrow antimicrobial spectrum.It is very significant and valuable to isolate antibacterial peptides from abundant crude resource.Antibacterial peptidese xtracted from Musca larvae,which have multi functions such as antibacterial and antitumor activities,aregood natural medicine resources,but the product development research is fe w for the lo wer extracting ratio.Using natural material of dried Musca domestica larvae,by c omparing the activities and characteristics of antibacterial peptides extracted by two methods such as heat chromatography and alginic acid absorption,it had been proved that heat chromatography was a quick,simple method with0 26%peptides e xtracting ratio which was5 2 fold to that of alginic acid absorption.The major antibacterial peptides extracted by heat chromatography were determined having Mw6 2-17 2kD with Tricine SDS PAGE and pI5 59-5 91withI EF P AGE.The peptides were very thermo stable and had antibacterial activity against Gram positive bacteriasuch as Bacillus subtilis.Besides maintaining the stability of bioactive peptides by re moving the exotic proteases,the heat chromatography could also extract non peptides with antibacterial activity.This technique may be used to exploit the resource of houseflies sufficiently and develop the antibacterial produc ts with high additional value supplying to medical treatment and health protection.Key words:Musca domestica;antibacterial peptide;extraction technique;resource utilization;antibacterial product利用基因工程方法生产抗菌肽除了工艺等问题外,还由于抗菌肽种类单一而效果欠佳。
家蝇幼虫抗菌肽对幽门螺杆菌抗菌作用分析
检 测 发 现 实验 组 在 分 子 量 约 ６ ６ ． ４ ｋ Ｄａ的 蛋 白条 带 浓度 较 对 照 组 降低 ， 而在 分 子 量 约 ４ ０ ｋ Ｄ ａ的 蛋 白条 带 浓度 较 对 照 组 增 高 。 双 向 电泳 结 果 显 示 家 蝇 幼 虫 抗 菌 肽 干 扰 了 Ｈ． ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ 的 抗 氧 化 系统 ， 影 响 了 Ｈ． ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ 能 量代 谢 和 应 激 作 用 功 能蛋 白的 表 达 。 结 论 家 蝇 幼 虫抗 菌 肽 对 Ｈ． ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ 具有 明显的抑制作用 ， 是通过抑制其生长 、 干扰 其 抗 氧 化 系 统 ， 以及 影 响 其 能 量 代 谢 等 方 面， 发 挥 家 蝇 幼 虫 抗 菌 肽 的抑 菌机 制 。
中 国 人 兽 共 患 病 学 报
２ Ｏ１ ３， ２９ （ １ ０）
Ｃｈｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏｕ ｒ ｎａ ｌ ｏｆ Ｚｏ ｏ ｎｏｓ ｅ ｓ ９ ８１
ＤＯＩ ： １ ０． ３ ９ ６ ９ ／ ｃ ｊ ｚ ． ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２— ２ ６ ９ ４． ２ ０ １ ３ ． １ ０． ０ ０ ９
家 蝇 幼 虫 抗 菌 肽 对 幽 门螺 杆 菌 抗 菌作 用 分析
黄 健 ， 莫 非 。
摘 要 ： 目的 探 讨 家 蝇 抗 菌 肽 （ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ） 对 幽门螺杆菌（ Ｈｅ ｌ ｉ ｃ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ ，Ｈ． ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ ） 的抗 菌 机 制 。 方 法 通 过 绘 制 抑 菌 曲线 、 十 二 烷 基 硫 酸 钠一 聚丙烯酰胺凝胶 电泳（ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｄ ｏ ｄ ｅ ｃ ｙ ｌ ｓ ｕ ｌ ｆ ａ ｔ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ ａ ｃ ｒ ｙ ｌ ａ ｍｉ ｄ ｅ ｇ ｅ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ， Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧ Ｅ） 及双 向电泳（ ｔ ｗ ｏ — ｄ ｉ ｍｅ ｎ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ０ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ， ２ － ＤＥ ） 方 法和 技 术 ， 初 步 探 讨 家 蝇 对 幽 门螺 杆 菌 作 用 机 虫 抗 菌 肽 使 Ｈ． ｐ ｙ ｌ ｏ ｒ ｉ 不 能 达 到 正 常 的 生长 高 峰进 入 对 数 期 ， 而 １ ｄ后 直 接 进 入 衰 亡 期 ； 通过 Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ ＡＧＥ
家蝇幼虫抗菌肽diptericin_2基因的克隆及原核表达-鉴定
·实验技术及其应用·家蝇幼虫抗菌肽diptericin_2基因的克隆及原核表达－鉴定杨小蓉1，金小宝2，丁彩屏1，朱家勇2（1.广东药学院附属第一医院检验科，广州510080；2.广东药学院基础学院生物活性物质研究所）摘要：目的扩增出全长diptericin2基因，并构建表达pGEX-4T-1／diptericin2重组蛋白。
方法运用经典的5′末端扩增法（5′-Full RACE）法，通过双酶切、连接反应，将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上，转化大肠埃希菌BL21，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析diptericin2重组蛋白的表达情况，蛋白质印迹实验（Western-blotting）对其进行了鉴定。
结果获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因（GENBANK登录号FJ795370），双酶切鉴定及DNA测序结果显示，目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上，SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27kDa。
结论扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1／diptericin2重组蛋白原核表达系统，融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达，为下一步研究其生物活性打下初步的基础。
关键词：家蝇抗菌肽；diptericin2基因；5′-Full RACE；原核表达鉴定中图分类号：R394文献标志码：A文章编号：1003-8507（2012）11-2791-03Diptericin2gene cloning expression and identification of antibacterialpeptide from musca domesticaYANG Xiao-rong*，JIN Xiao-bao，DING Cai-ping，ZHU Jia-yong.*Laboratory，First Affiliated Hospital，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong510080，China Abstract：OBJECTIVE To amplify the full-length diptericin2gene and construct expression pGEX-4T-1／diptericin2 recombinant protein.METHODS The5′-Full RACE was used to amplify the full-length sequence that then digested by double enzymes，and ligated so it was cloned into the pGEX-4T-1and transformed in E.coliBL21.Analysed the recombinant protein expression by sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）after induced with isopropyl-β-D-thiggalactoside （IPTG）and identified with Western-blotting.RESULTS The target sequence（Genbank accession number：FJ795370）was attained by sequencing and ligated in vetor by double digestion.And the molecular mass was detected by SDS-PAGE. CONCLUSION The full-length diptericin2gene and pGEX-4T-1／diptericin2recombinant prokaryotic expression system is successfully amplified and constructed.The fusion protein expression by inclusion bodies in E.coli BL21provides the bases for further study of biological activity.Key words：Musca domestica；Diptericin；5′-Full RACE；Prokaryotic expression and identification家蝇属昆虫纲，双翅目，环裂亚目，家蝇科，为完全变态昆虫，家蝇在长期抵御微生物的侵袭中形成了其独特的免疫系统，生物活性物质抗菌肽便是其中的一种。
家蝇抗菌肽的分离纯化及抗菌活性、机理研究的开题报告
家蝇抗菌肽的分离纯化及抗菌活性、机理研究的开
题报告
一、研究背景
家蝇（Musca domestica）是人类常见的害虫之一，其肠道中含有多种抗菌肽，具有对多种微生物的抗菌活性，可以抵御外界细菌入侵，维
护肠道微生态平衡。
其中，家蝇抗菌肽具有较强的抗菌活性，其结构简单、易于合成，具有广阔的应用前景。
因此，本研究旨在分离纯化家蝇
抗菌肽，并研究其抗菌活性和机理，为开发新型的抗菌药物提供理论基
础和技术支持。
二、研究内容
本研究计划主要包括以下内容：
1.家蝇抗菌肽的提取和分离：通过提取家蝇肠道中的抗菌肽，运用
层析技术进行纯化，得到高纯度的家蝇抗菌肽。
2.家蝇抗菌肽的质谱鉴定：通过MALDI-TOF质谱技术对家蝇抗菌肽进行质谱鉴定，确定其分子量和氨基酸序列。
3.家蝇抗菌肽的抗菌活性检测：采用平板扩散法和管内稀释法对家
蝇抗菌肽的抗菌活性进行检测，并比较其抗菌效果和广谱性。
4.家蝇抗菌肽的机理研究：通过荧光染料法和流式细胞术研究家蝇
抗菌肽对细胞膜的破坏作用及其对细胞内物质的影响，揭示其抗菌机理。
三、研究意义
家蝇抗菌肽具有较强的抗菌活性和广泛的应用前景，其不仅可以作
为新型抗菌药物开发的一种重要候选，还可以应用于食品工业、化妆品
工业等领域中。
因此，本研究的结果具有较高的理论和应用价值，有助
于推动抗菌肽的研究和开发。
家蝇幼虫抗菌肽对幽门螺杆菌抗菌作用分析
家蝇幼虫抗菌肽对幽门螺杆菌抗菌作用分析黄健;莫非【摘要】目的探讨家蝇抗菌肽(antibacterial peptides)对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的抗菌机制.方法通过绘制抑菌曲线、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及双向电泳(two dimensional electrophoresis,2-DE)方法和技术,初步探讨家蝇对幽门螺杆菌作用机理.结果浓度为40 μg/mL家蝇幼虫抗菌肽使H.pylori不能达到正常的生长高峰进入对数期,而1d后直接进入衰亡期；通过SDS-PAGE检测发现实验组在分子量约66.4 kDa的蛋白条带浓度较对照组降低,而在分子量约40 kDa的蛋白条带浓度较对照组增高.双向电泳结果显示家蝇幼虫抗菌肽干扰了H.pylori的抗氧化系统,影响了H.pylori能量代谢和应激作用功能蛋白的表达.结论家蝇幼虫抗菌肽对H.pylori具有明显的抑制作用,是通过抑制其生长、干扰其抗氧化系统,以及影响其能量代谢等方面,发挥家蝇幼虫抗菌肽的抑菌机制.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(029)010【总页数】5页(P981-985)【关键词】幽门螺杆菌;家蝇;抗菌肽;抗菌机理【作者】黄健;莫非【作者单位】贵阳医学院附属医院生化科,贵阳 550004;贵阳医学院临床检验教研室,贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R378幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori，）是定植于胃黏膜表面的常见致病菌，与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃 MALT淋巴瘤的发生密切有关［1－3］，有效根除H．pylori成为大家关注的焦点。
然而H．pylori对抗生素日趋耐药［4］，研发新型抗 H．pylori药物成为临床治疗的迫切需求。
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第22卷第6期2003年11月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.22 No.6Nov. 2003 文章编号:10092038X (2003)0620025206 收稿日期:2003204224; 修回日期:2003206210.基金项目:中央级科研院所基础性专项资金项目(2001DEA —20022)资助课题.作者简介:宫霞(19662),女,山东济宁人,副教授,粮食、油脂与植物蛋白工程博士研究生.电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质宫霞1, 乐国伟1, 施用晖1, 付景春2(1.江南大学食品学院营养与生物技术研究室,江苏无锡214036;2.无锡市疾病预防控制中心检验部,江苏无锡)摘 要:通过体壁损伤法诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,透析浓缩处理,后经Tricine 2SDS 2PA GE 得到诱导前后家蝇幼虫血淋巴中蛋白差异表达带,将该条带电泳回收,复性,抗菌活性检测等步骤,分离纯化得到3种抗菌肽:MDL 21、MDL 22、MDL 23.研究结果表明:MDL 21分子中富含G ly ,相对分子质量为6200,对革兰氏阴性菌 E.coli 有较强抗性;MDL 22分子中富含Pro ,相对分子质量为11000,对革兰氏阴性菌 E.coli 和革兰氏阳性菌S.aureus 均有抗性;MDL 23分子中富含G ly ,相对分子质量为14000,对革兰氏阳性菌S.aureus 有较强抗性;3种抗菌肽具有很强的温度耐受性,均没有凝血活性和溶血活性.同时电泳制备抗菌肽的实验方法为此类微量生物活性物质的分离纯化提供了有效的途径.关键词:家蝇幼虫;抗菌肽;电泳制备中图分类号:Q 514.3文献标识码:AElectrophoretic Preparation and Biologic Characterization ofAntibacterial Peptides from M usca Domestica L a rvaeGON G Xia 1, L E Guo 2wei 1, SHI Y ong 2hui 1, FU Jing 2chun 2(boratory for Nutrition and Biotechnology Research ,School of Food Science and Technology S outhern Y angtze Uni 2versity ,Wuxi 214036,China ;2.Ins pection Department of Disease Preventive Controlled Center ,Wuxi 214000,China )Abstract :The immunized hemolymph was produced from Musca domestica Larvae by inducing injury.Three antibacterial peptides were purified by means of boiling water bath ,dialysis and concentration ,Tricine 2SDS 2PA GE preparation ,and retrieval and renatural of peptides.The result of amino acids analysis showed that there were abundant alkaline amino acid in these antibacterial peptides.The molecule weight of antibacterial peptide 1(MDL 21)was 6200.It contained abundant G ly ,which had potential activity against Gram 2negative bacteria , E.coil.MDL 22,molecule weight was 11000,contained plentiful Pro ,potently acted on Gram 2positive and Gram 2negative bacteria , E.coil and S.aureus.MDL 23,with molecule weight of 14000and abundant G ly ,showed antibacterial activityagainst Gram 2positive ,S.aureus.The antibacterial peptides do not have the activity of coagulating red cells ,and that suggested that they were not lectin.The electrophrosis is an effective way to prepae the antibacterial peptides.However ,the mechanism and the structure of peptides were remained to be clarified.K ey w ords :M usca domestica L arvae ;antibacterial peptides ;electrophoretic preparation 昆虫体内没有B和T淋巴系统这种完善的免疫体系,但昆虫具有高效的自我防御机制来抵抗病菌的传染.1972年,瑞典科学家Boman[1]首先从天蚕蛹中发现抗菌肽,以惜古比天蚕(Hyalophorace2 cropia)为实验材料,注射蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)诱导产生抗菌肽(cecropins),后又从家蚕、柞蚕、蓖麻蚕及多种昆虫中均分离得到抗菌肽[2],从此昆虫防御机制的研究进入了一个崭新的发展时期.由于昆虫抗菌肽具有相对分子质量低、热稳定和广谱高效抗菌活性,而且不同于现有的抗生素的抗菌机理,已成为昆虫学、生理学及药理学等生命科学研究的热点[3～6].目前根据抗菌肽的氨基酸组成和结构特点分为5类[6]:天蚕素类(cecropins)、昆虫防御素(insect defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(proline2rich peptides)、富含甘氨酸的抗菌肽(glycine2rich peptides)、抗真菌肽(anti2fungal pep2 tides).这些抗菌肽的发现和结构的阐明,为肽类抗菌药物的研究及其应用开辟了广阔前景.家蝇(M usca domestica L)属于双翅目、环裂亚目、蝇科、家蝇属的昆虫,从幼虫到成虫都生活在杂菌横生的污浊环境中,有着极强的适应恶劣环境的生存能力,预示着它们体内存在着独特的免疫防御机制,具有很高的理论和潜在的应用价值.但长期以来由于人们对家蝇认识偏见,再者家蝇个体小,经济价值未被深入开发等原因,国内外对其研究较少,我们经过血淋巴的电泳制备、回收、复性等实验从家蝇幼虫中得到了3种新的抗菌肽,并对其氨基酸组成、生物活性及性质进行了检测.1 材 料1.1 家蝇幼虫三龄幼虫:无锡昆龙生态生物环保有限公司提供.1.2 菌株大肠杆菌A TCC25922(Escherichia coli A TCC25922)、金黄色葡萄球菌A TCC6538(S taphilococcus aureus A TCC6538)由无锡市疾病预防控制中心提供;大肠杆菌J m109(Escherichia coli J m109抗氨苄青霉素型)由作者所在实验室保存菌株.1.3 仪器D Y2A电泳仪:上海生化所西巴斯生物技术有限公司生产;高速组织捣碎机:上海标本模型厂产品;Waters600/500高效液相色谱仪:美国Waters 公司生产;Ag1100氨基酸色谱仪:美国Agilent公司生产;UV755B紫外分光光度计:上海精密仪器有限公司制造;G L216G2II冷冻离机:上海安亭科学仪器厂制造.1.3 试剂丙烯酰胺:Canalab产品;N,N′2甲叉双丙烯酰胺(分析纯):Biomol公司产品;Tricine:Amresco公司产品;过硫酸铵和TEM ED:B IB产品;标准相对分子质量上海生化所监制;胰岛素(40U/mL):上海生物化学制药厂;透析袋:Sigma公司产品.2 方 法2.1 抗菌肽的分离纯化2.1.1 家蝇幼虫的免疫 用沾有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的小针斜刺幼虫的腹腔,刺伤后继续饲养24h,同时设立对照组(只饲养不进行诱导).将虫体与饲料剥离,立即放入液氮速冻.2.1.2 血淋巴的提取 将一定量虫体放入高速组织捣碎机中,按m(mg)∶V(mL)比为1∶3加入提取液(0.05mol/L乙酸铵缓冲液,p H5.0,35μg/mL PMSF),充分捣碎,匀浆用12000r/min高速冷冻离心30min,取上清液,重复3次,合并上清液;用400目纱网过滤,得滤液.将滤液于沸水浴中搅拌加热5min,迅速冷却后,4800r/min离心30min,上清液相对分子质量用2000透析袋透析浓缩,将浓缩液-20℃冰箱保存备用.2.1.3 抗菌肽的电泳制备 寻找家蝇幼虫诱导前后蛋白表达差异条带,将免疫的血淋巴和对照组未免疫的血淋巴分别与上样缓冲液(未加巯基乙醇)加热处理后,进行Tricine2SDS2PA GE电泳.其参照Schagger[7]的方法并进行改进,分离胶质量浓度16.5g/dL,间隙胶质量浓度6.2g/dL,浓缩胶质量浓度4g/dL,交联度3%,胶厚1.5mm,电压60V,电流30mA,电泳6h,将凝胶银染色.(1)回收:将蛋白凝胶剪碎,加入适量的Tris2 HCl缓冲液p H7.0,浸泡,然后放入2000透析袋进行洗脱电泳,电压60V,时间3h,400目纱网过滤,得滤液;向滤液中滴加乙酸使p H值为5.5,然后离心得抗菌肽,室温干燥.但部分肽已变性,其水溶性较差,必需进行复性.(2)复性:将干燥的肽中加入p H8.0,TE缓冲液和终浓度为0.5mol/L的盐酸胍,振荡均匀,静止24h,肽得以复溶、复性后,再经抗菌活性及纯度的检验.3种抗菌肽制备都按以上步骤直接进行操作.62无 锡 轻 工 大 学 学 报 第22卷2.2 抗菌活性的检测采用2种方法(1)抑菌圈测量法:采用LB培养基,通过测定抑菌圈直径表示定性检测抑菌活力;(2)比浊法:用0.1mol/L p H6.5磷酸盐缓冲液冲洗固体斜面上的检测菌,配成一定浓度的悬浊液(A =0.3～0.5),取该悬浊液置于冰浴中,再加入100μL淋巴液或纯化抗菌肽,混匀,测其保温前在600 nm波长处的光密度值A0,然后将其放入37℃恒温水浴中1h,取出后立刻置冰浴中5min,终止反应,测其600nm处的光密度值A,按Hultmark[3]的方法计算抗菌活力,U=A0-A/A0,U为抑菌活力单位.2.3 蛋白及抗菌肽的测定Bradford[8]方法测定,以牛血清白蛋白为标准,考马斯亮蓝G2250染色,595nm比色测定.抗菌肽的测定:参照Steiner[9]的实验方法.2.4 抗菌肽的初步性质2.4.1 纯度鉴定 采用HPLC与Tricine2SDS2 PA GE分别进行鉴定.HPLC鉴定:采用分析型C18反相柱,流动相A:体积分数0.05%TFA,B:体积分数70%乙晴(含0. 05%TFA),线性梯度洗脱,流速1mL/min,检测波长λ=220nm.2.4.2 抗菌肽相对分子质量测定 采用Tricine2 SDS2PA GE不连续电泳测定,分离胶质量浓度14 g/dL,间隙胶质量浓度6g/dL,浓缩胶质量浓度4 g/dL,交联度3%,胶厚0.7mm.标准相对分子质量(14400～97400)为上海生化所监制,考虑到抗菌肽相对分子质量实际情况,在测定时添加胰岛素亦为相对分子质量标准.2.4.3 氨基酸组成分析 样品加6mol/L盐酸真空封管,水解24h后,用氨基酸分析仪测定.2.4.4 凝血和溶血试验 取新鲜家兔血液,用生理盐水3000r/min离心10min反复洗涤多次,保存于生理盐水中备用,取血细胞200μL滴加到载玻片上,在加入纯化的抗菌肽50μL(0.5μg/μL)显微镜下观察血细胞凝集现象,以麦胚凝集素为阳性对照,同时观察有无溶血现象.2.4.5 对温度的稳定性试验 分别将3种抗菌肽溶于TE缓冲液中,经-20℃冰箱反复冻融数次和沸水浴中处理10min,然后分别测定其抗菌活性.3 结 果3.1 抗菌肽的纯化及抑菌活性为了准确快速得到抗菌肽,在分离纯化的主要试验步骤中都进行定性、定量抗菌活性的跟踪检测,免疫血淋巴对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌J m109均有抑菌活性见图1～3.图1 血淋巴对金黄色葡萄球菌抑菌圈检测Fig.1 Antib acterial effect of immunized hemolyph against S.aureus图2 血淋巴对大肠杆菌抑菌圈检测Fig.2 Antib acterial effect of immunized hemolyph against E.coil图3 血淋巴对大肠杆菌Jm109抑菌圈检测Fig.3 Antib acterial effect of immunized hemolyph againstE.coil Jm109 经Tricine2SDS2PA GE电泳得到6条差异表达蛋白条带(图4).将这6条条带回收、复性后,做抗菌活性检测,得到3种抗菌谱和抗菌活性不同的抗菌多肽(图4中所示6、4、3条带),分别命名为MDL21、MDL22、MDL23,具体结果见表1.72 第6期宫霞等:电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质A B Lane A :immunized hemolyph Lane B :unimmunized hemolyph图4 家蝇诱导蛋白表达差异电泳Fig.4 Protein differential expression electropherogram ofMusca domestic larvae hemolymph表1 家蝇幼虫血淋巴、抗菌肽的抗菌活性T ab.1 Antib acterial activity in hemolymph and antib acterialpeptides of Musca domestica larvae样品蛋白质质量浓度/(mg/mL )抗大肠杆菌活力/U比活力/(U/g )抗金黄色葡萄球菌活力/U比活力/(U/g )未加热血淋巴 3.20.2760.0860.3420.106加热血淋巴0.70.2050.2920.3130.447透析浓缩血淋巴1.40.5310.3790.8060.575MDL 210.0340.0410 1.2050.00020.050MDL 220.0250.0300 1.2000.02180.872MDL 230.0180.00010.0050.07304.056 从表1中得出,MDL 21对大肠杆菌有强烈的抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌几乎没作用(图5);MDL 22对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抗菌活性(图6、7);MDL 23对金黄色葡萄球菌有强烈的抗菌活性,而对大肠杆菌没有作用(图8).图5 MDL 21对大肠杆菌的抑制作用Fig.5 Antib acterial effect of MDL 21against E.coil图6 MDL 22对金黄色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Antib acterial effect of MDL 22against S.aureus图7 MDL 22对大肠杆菌的抑制作用Fig.7 Antib acterial effect of MDL 22against E.coil图8 MDL 23对金黄色葡萄球菌的抑制作用Fig.8 Antib acterial effect of MDL 23against S.aureus3.2 纯度检测电泳制备得到3种抗菌肽:MDL 21、MDL 22、MDL 23,经HPLC 检测均为单一峰,Tricine 2SDS 2PA GE 后银染均得到单一条带,因此认为3种抗菌肽达到均一程度(图9).3.3 抗菌肽的相对分子质量经Tricine 2SDS 2PA GE 不连续电泳,测定标准相对分子质量的R f 值,计算出家蝇幼虫抗菌肽相对分子质量:MDL 216200;MDL 2211000;MDL 2314000(图10).82无 锡 轻 工 大 学 学 报 第22卷图9 抗菌肽纯度鉴定Fig.9 Purity analysis of antib acterial peptides MDL 21,MDL 22,MDL 23 Lane A :MDL 21,MDL 22,MDL 23 Lane B :insulin 100,chain A 3500,chain B2600图10 抗菌肽相对分子质量测定Fig.10 T rincine 2SDS 2PAGE indicating molecular w eightof Antib acterial peptides MDL 21,MDL 22,MDL 233.4 抗菌肽氨基酸组成分析:3种抗菌肽均不含有甲硫氨酸和半胱氨酸,MDL 21氨基酸组成分析结果见表2,此肽由51个氨基酸组成,富含碱性氨基酸和甘氨酸.MDL 22氨基酸组成分析结果见表3,此肽由106个氨基酸组成,富含脯氨酸,其质量分数达38%.表2 MDL 21氨基酸组成T ab.2 Amino acid composition of antib acterial peptideMDL 21氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个Asx 332.224Val 35.345G lx341.015Met -0Ser 48.606Phe 9.101His 10.662Ile 11.892G ly 54.498Leu 19.943Thr 17.473Lys 19.193Ala 34.735Pro 9.391Arg 11.342Tyr9.581Total364.9551注:Asx 3代表Asn 或Asp 或Asn +Asp ;G lx 3代表G ln 或G lu或G ln +G lu 以下相同.表3 MDL 22氨基酸组成T ab.3 Amino acid composition of antib acterial peptideMDL 22氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个Asx 6.654Val 10.046G lx 7.096Met -0Ser15.909Phe 6.056His 2.832Ile 5.614G ly 17.658Leu 6.514Thr 4.833Lys 5.904Ala 8.454Pro 71.4941Arg 3.553Tyr2.142Total174.70106 MDL 23氨基酸组成分析结果见表4,此肽由111个氨基酸组成,富含碱性氨基酸和甘氨酸.3.5 凝血与溶血活性检测通过显微镜观察3种抗菌多肽对家兔的红细胞均没有凝集作用和溶血作用,而作为凝集阳性对照的麦胚凝集素使兔红细胞相互聚集形成簇状.表4 MDL 23氨基酸组成T ab.4 Amino acid composition of antib acterial peptideMDL 23氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个氨基酸浓度(pmol/μL )残基数/个Asx 70.7511Val 42.626G lx 105.3618Met -0Ser 78.1110Phe 18.854His 14.636Ile 25.794G ly 95.768Leu 53.809Thr 36.435Lys 42.888Ala 59.706Pro 22.325Arg 35.157Tyr16.744Total718.891113.6 对温度稳定性实验3种抗菌肽经-20℃冻融多次,其溶解性能良好,抗菌活性没有任何改变.沸水浴10min 处理后,MDL 21抗菌活力未发生变化,MDL 22、MDL 23抗菌活力略有下降,但不显著.4 讨 论用蘸有菌液的针损伤体壁的方法诱导家蝇幼92 第6期宫霞等:电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质虫产生抗菌肽和抗菌蛋白,通过离心获得的血淋巴中含有大量的杂蛋白,因抗菌肽具有很高的热稳定性特点,经沸水浴使大部分杂蛋白变性除去,再用透析袋浓缩脱盐,使后续电泳制备得以顺利进行.由于昆虫在创伤或注射感染细菌后诱导抗菌肽基因表达,合成大量抗菌多肽,因此依据诱导前后家蝇幼虫血淋巴中蛋白表达差异的电泳图谱迅速得到3种有不同抗菌活性的多肽,免去了繁琐的凝胶色谱纯化步骤,不仅节省时间,更重要的是通过制备电泳可以快速、准确寻找这些含量较少的生物活性物质并且得到高度均一产品,为抗菌肽的分离纯化提供一种行之有效的方法.从这3种抗菌肽的氨基酸组成分析可知,3种抗菌肽分子中没有含硫的氨基酸即Met和Cys,而碱性氨基酸比例较高,因此3种抗菌肽不属于防御素类,MDL21与MDL23富含G ly,MDL21相对分子质量相对小,且对革兰氏阴性细菌抗性较强,推测MDL21可能属于天蚕素类,MDL23属于富含甘氨酸型,MDL22富含Pro,比率高达38%,但与常规的富含脯氨酸型抗菌肽比较,相对分子质量偏小,抗菌谱较广,是否属于富含脯氨酸型抗菌肽类型目前不能完全肯定.凝集素也是昆虫体液防御的组成因子之一,昆虫凝集素相对分子质量一般较大,家蝇凝集素由一个单体组成,相对分子质量为33000,而得到的抗菌肽相对分子质量较小,且凝血实验表明其均没有凝血活性,因此推测3种抗菌肽不是凝集素类.迄今为止,国内外学者在双翅目蝇类中的肉蝇[17](S arcopgaga peregri na)、绿蝇[17](Phorm ia terranorae)、果蝇[17](D rosophila melanogaster)、地中海实蝇[10](Ceratitis capitata)、厩螫蝇[11](S ton2 zoxys poregri nn)中分离到具有不同抗菌活性的抗菌肽,但以家蝇为试验对象分离抗菌肽的研究我们经计算机联网检索和翻阅大量资料发现国外未见报道,我国对家蝇抗菌物质的研究进展缓慢,长期停留在免疫应答[12]及血淋巴理化性质[13]的阶段.本世纪初国内学者陈留存[14]、柏鸣[15,16]通过离子交换和凝胶过滤层析从家蝇中各分离得到一种抗菌肽,前者得到抗菌肽的相对分子质量为1000,未进行氨基酸组成和结构分析;后者得到抗菌肽的相对分子质量为12600,106个氨基酸残基,富含Pro 和2个Cys,通过电泳得到的3种抗菌肽分子中不含Cys和Met残基,且相对分子质量与氨基酸组成分析比较与他们得到的抗菌肽均不相同,最近将3种抗菌肽进行了圆二色谱和红外光谱分析,目前推断该3种抗菌肽是新型的抗菌肽.并且证明蝇类抗菌肽组分较复杂,表现在一方面随着蝇种类不同抗菌肽类型有明显不同,分离活性成分的难易程度亦有很大不同;另一方面同一物种在不同诱导源诱导下产生的抗菌物质的活性大小有所不同,达到最大活性时间也不同,不同的分离方法可以分离到不同的抗菌肽.综上所述,家蝇免疫血淋巴通过电泳纯化得到的3种新型抗菌肽,具有很强的热稳定性和抗菌活性,不具凝血活性,亦不能引起血细胞溶血,但它们究竟属于哪种类别抗菌肽,还有待于对其一级结构、高级结构,生理生化性质、得到其DNA序列后分析等深入研究后证实.参考文献:[1]Boman H G,Nilsson I.Rasmuson B.Inducible antibacterial defense s ystem in drosophial[J].N ature,1972,237:232-235.[2]Faye I,Pye A,Rasmuson B,et al.Insect immunityⅡ,simultaneous induction of antibacterial activity and selective synthesis ofsome hemolymph protein in Diapausing pupae of hyalophora,cecropia and sarnia cythia[J].Infect Immun,1975,12:1426-1438.[3]Ultmark D,Steriner H,Rasmuson T,et al.Insect 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ostreatus(Jacq.ex.fr.)Quél.cells during stor2age图4 不同含水率对香菇贮藏过程中酸度的影响Fig.4 E ffects of different treatments on the acidity ofLentinula edodes(B erk.)Pegler cells during storage 参考文献:[1]张有林,苏东华.果品贮藏保鲜技术[M].北京:中国轻工业出版社,2000.[2]中科院上海植物生理研究所,上海市植物生理学协会.现代植物生理学实验指南[M].北京:科学出版社,1999.[3]黄邦彦,杨谦.果蔬采后生理与贮藏保鲜[M].北京:轻工业出版社,1992.[4]吕素彬,张庆芳,殷梅.不同处理防止蘑菇褐变的研究[J].沈阳农业大学学报,1997,28(3):248-250.[5]肖功年.两种芒果病原微生物的生物学特性研究及其抗微生物对芒果的保鲜作用研究[D].南宁:广西大学,2000.[6]刘福岭,戴行钧.食品物理与化学分析方法[M].北京:轻工业出版社,1987.(责任编辑:杨勇) (上接第30页)[9]Steiner H.Secondary structure of the cecropins antibacterial peptides from the moth hyalophora cecropia[J].FEBS Letters,1982,137:283-287.[10]Marchini D,G iordano P C.Purification andprimary structure of ceratotoxin A and B,two antibacterial peptides from the femalereproductive accessory glomds of the medfly ceratitis capitata[J].Insect Biochem Mol Biol,1993,23(5):591-598.[11]Lehane M J.Midgut2spectific immune molecules are produced by the blood2sucking insect stonzoxys poregrinn[J].Proc N atl A2cad 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