肺组织特异性基因HIMF的克隆及其真核表达载体的构建

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构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜_省略_fs25在CHO细胞中的重组表达_陈勇

药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology2013，20（1）：012 016·研究论文·构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白ｐｆｓ２５在ＣＨＯ细胞中的重组表达陈勇，陆俭，李刚，雷清，蒋琳*（国药集团兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃兰州730046）摘要构建一种可实现外源基因高效的、适用于中华仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞的质粒表达系统，并成功实现了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因在CHO细胞中的表达。

新构建的真核表达载体是在pBudCE4.1质粒载体上改造获得的，被命名为pCMV-WD，包含了人工合成的、完整的弱化SV40启动子与二氢叶酸还原酶（DHFR）基因组成的顺式表达元件和全新设计的多克隆位点，该载体属于CHO细胞通用载体，理论上可以实现任何外源基因在CHO细胞中的表达。

基于该载体，采用定向克隆策略插入了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因，构建的重组表达质粒为pfs25/pCMV-WD。

经zeocin抗生素和撤除H、T（次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷）双筛选，获得了DHFR+基因阳性的细胞克隆。

对表达量最高的克隆株进行亚克隆，并经MTX加压筛选以获得高表达pfs25蛋白的CHO细胞株。

ELISA和Western Blot结果表明，重组pfs25蛋白具有良好的免疫学反应性，且表达量为0.1mg/mL。

该研究首次获得了可分泌重组pfs25蛋白的CHO细胞株。

关键词真核表达载体；CHO细胞；二氢叶酸还原酶；弱化SV40启动子；pfs25中图分类号Q812文献标志码A文章编号1005-8915（2013）01-012-05随着DNA重组技术的日臻完善和普及化，国内外已经在中华仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cells，CHO）中表达了多种外源基因，但是，有工业生产价值的蛋白质并不多。

与大肠杆菌相比，CHO细胞具有获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等缺点，其中最重要的缺点是目的蛋白质在CHO细胞的表达量不高［1］。

如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体

争鸣如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体余砚笈由外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理，可以从启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数等方面进行改善构建。

一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

启动子是在转录水平上影响基因表达。

转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。

也就是说启动子会有强弱之分。

要获得高效表达必须选择强启动子。

由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。

通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λp L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。

三、终止子有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。

贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。

这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。

同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。

四、核糖体结合位点1、Shine-Dalgarno（SD）序列一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

中国组织工程研究与临床康复第 15 卷第 31 期 2011–07–30 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 30, 2011 Vol.15, No.31
真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定*☆
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
5839

邱明链，等. 真核表达载体 pIRES2-EGFP-hFasL 的构建及鉴定
福建医科大学附属第一医院，1 胸外科，4 肝病中心，福建省福州市 350005；2 西安医学院附属医院病理科，陕西省西安市 710077；3 福建医科大学基础医学院病理系，福建省福州市 350004
上海艾普拓普生物科技有限公司
大连 Takara 公司
QIAGEN 公司上海艾普拓普生物科技
有限公司大连 Takara 公司 Pharmacia Biotech 公司 Thermo
实验方法：外周血单核细胞的制备：取正常人新鲜抗凝血 5 mL与Hanks液等量混匀后，加于4 mL淋巴细胞分离液上，离心收集细胞，用5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640CM培养液悬浮，加入25 mg/L的ConA，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育24 h。 RT-PCR 扩增 hFasL 基因：ConA刺激后的淋巴细胞，经 Trizol 试剂盒据说明书提取总 RNA。反转录体系：模板RNA溶液5 µL，5×RT buffer 4 µL，dNTP(各10mmol/L)混合物2 µL， RNA酶抑制剂0.5 µL，引物设计参照GenBenk 上hFasL序列分别设计上、下游引物。上游引物： 5’ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT C 3’；下游引物：5’TTA GAG CTT ATA TAA GCC GAA AAA CGT C 3’。Oligo(dT)引物1 µL， AMV反转录酶1 µL，DEPC水6.5 µL。42 ℃保温1 h，置95 ℃温育5 min使AMV反转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR。目的片段大小约846 bp，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min， 94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100 V， 30 min)，凝胶成像系统摄像。真核表达栽体pIRES2-EGFP-hFasL的构建： 1% 琼脂糖凝胶电泳分离并回收 PCR 产物及 pIRES2-EGFP空载体，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，T4 DNA连接酶4 ℃连接，过夜，其产物按常规方法转化于DH5a感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养，采用HiSpeed Plasmid Midi Kit质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

ｗｔｐＤＡ．（＋）一ｆｃ．ＴｅｅｗｒｍｏｌｏｉｏｍｄａｔｅｅｇｆＡ４ｅｓｔｎｆｃｄｗｔｃ — ｉｃＮ３１ｈｓｎａｉｈｒｅｅｒｆｏｄｓｆｒｅｔｄｅｏ５９ｃｌｒｓｔｉｐＤｅｉｐａｈｌａｅｅｈＮ３１Ａ．（＋）一ａｃｙｉｍｕｏｕｒｅｎｓｉｉｇｏｃｓｎ：ｅｅｋｒｏｃｅｐｅｓｎｖｃｒｃＮ３１ｆｓｉｂｎｍｎｆｏｅｅｔｔｎｎ．ＣｎｌｉＴｕａｔｘｒｓｏｅｔＤＡ．（＋）ｌｓａｕｏｈｙｉｉｏｐ
（校：志明）编张
Ｆｓｉａｃｎ真核表达载体的构建及其在肺癌Ａ４５９细胞中的表达
赵晋波马楠白光振张志培姜，，，，涛韩，勇，周勇安李小飞，
Ｃｎｔｃｉｎｏｓｉｅｅｅｋｒｏｉｅｐｅｓｏｅｔｒｎｓｅｐｅｓｏｎｌｎａｃｒｏｓｒｔｆａｃｎｇｎｕａｙｔｘｒｓｉｎｖｃｏｄｉｘｒｓｉｎｉｕｇｃｎｅｕｏｆｃａｔ
一
ｆｃｎｗａｕｃｓｆｌｏｓｒｃｅｎｒｎｆｃｅｎｏＡ５９ｃｌ．Ｉｗａｂｅｅｈｔｒｌｐｄａｏｔｎｎｓａｉｓｓｃｅｓｕｌｃｎｔｕｔｄａｄｔａｓｅｔｄｉｔ４ｅｌｙｓｔｓｏｓｒｄｔａｅｆｏｏｉｓｃｎａｉｇｖｍｏｉｉ
ｈｌＴ，ｈｎＫ，ＷａｇＺ，ｃ１ＩｄｃｉｎｏｅｎＸｔａ．ｎｕｔｆｔｏｈｅ［４Ｂｗａ— ＫａｆＣｅｇＪ１］ａ

NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建的开题报告

NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建的开题报
告
NR4A1基因是核受体超家族的一员，具有多种调控细胞生长、分化和凋亡的功能。

因此，研究NR4A1基因的表达和调节机制对于理解细胞的生理过程和疾病发生发展具有重要意义。

本研究旨在对NR4A1基因进行克隆并构建真核表达载体，为后续研究提供良好的实验工具。

具体研究内容如下：
1. NR4A1基因的克隆。

首先，利用PCR技术从人体组织中提取NR4A1基因的编码序列。

然后，将编码序列与载体连接，并克隆到大肠杆菌中进行扩增。

2. 真核表达载体的构建。

将NR4A1基因的编码序列克隆到真核表达载体中，构建出pCMV-NR4A1质粒。

通过限制性酶切及PCR鉴定，确保pCMV-NR4A1质粒的准确构建。

3. 真核表达载体的验证。

将构建好的pCMV-NR4A1质粒转染到细胞中，利用Western blotting等技术检测NR4A1蛋白的表达情况，并分析其对细胞功能的影响。

总之，本研究旨在通过克隆和构建真核表达载体，为后续研究提供重要工具和技术，同时深入探究NR4A1基因的生物学功能和调控机制。

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达吴勇

VEGFA 基因重组真核表达载体的构建与表达吴勇1，刘学刚2，郭嘉诚1，李慧敏1，丁周志1，王亚明1，宋伟3，徐家丽1，赵武1(蚌埠医学院第一附属医院1．儿科;2．心胸外科;3．超声心动图，安徽蚌埠233004)摘要：目的构建VEGFA 基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA ，并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T ）中的表达。

方法以人脐血单核细胞的RNA 为模板，采用RT-PCR 技术扩增VEGFA 基因，并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl 中，构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA 。

经限制性核酸内切酶BglII 和SalI 酶切和DNA 测序鉴定后，用脂质体法将pEGFP-VEGFA 转染HEK293T 细胞，转染后24h 和48h 采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA 的表达。

结果pEGFP-VEGFA 被双酶切为4697bp 和1251bp 两条条带，测序结果证实VEGFA 序列与GenBank 公布的VEGFA mRNA 序列完全一致。

在经转染的HEK293T 细胞内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP-VEGFA 成功转染HEK293T 细胞，并在其中得到了表达。

结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA ，为进一步研究VEGFA 基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子A ；基因；遗传载体Construction and expression of recombinant eukaryoticexpression vector of VEGFA geneWU Yong 1，LIU Xue-gang 2，GUO Jia-cheng 1，et al（Department of 1．Pediatrics ；2．Cardiothoracic Surgery ，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ，Bengbu 233004，China ）Abstract ：Objective To construct a recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，and to detect its expression in HEK293Tcells．Methods VEGFA gene was amplified from the total RNA of human umbilical cord blood monocytes by RT-PCR andthen directionally inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1in order to construct the recombinant expression vector pEG-FP-VEGFA．The recombinant vector pEGFP-VEGFA was identified by restriction endonuclease BglII and SalI digestion analysis ，and se-quence analysis．The pEGFP-VEGFA was then transfected into the HEK293T cell by lipofectin reagent ，and its expression was detectedby fluorescence microscopy at 24and 48h post-transfection．Results The recombinant vector pEGFP-VEGFA was digested into twobands of 4697and 1251bp．Sequencing results showed that the sequence of VEGFA in pEGFP-VEGFA was identical to GenBank VEG-FA accession number NM_001025366．Strong green fluorescence was observed in the HEK293T cells transfected with the pEGFP-VEG-FA ，which showed that the pEGFP-VEGFA had been successfully transfected into the HEK293T cells and acquired expression．Conclu-sion We successfully construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，which lays a foundation to further study the biological function of VEGFA gene．Key words ：vascular endothelial growth factor A ；gene ；genetic vectors基金项目：安徽省自然科学基金面上项目（No 11040606M198）作者简介：吴勇，男，硕士研究生通信作者：赵武，男，博士，副教授，研究方向：小儿血管疾病的临床与基础研究，E-mail ：zhaowuronghai@yahoo．com．cn ·54·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013Jan ;17(1)左室流出道梗阻（Left Ventricular Outflow Tract Obstruc-tion，LVOTO）是一类常见的先天性心脏病，占先天性心脏病发病总数的14%，遗传率高达0．71 0．90［1］。

NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建

核表达载体，为研究其在心肌细胞中的功能做准备。方法：从Ｐａｘ一８敲除的小鼠心肌组织中提取总ＲＮＡ，通
过逆转录得到总ｃＤＮＡ，利用逆转录ＰＣＲ法扩增，将目的产物与ｐＧＥＭ — ＴＥａｓｙ载体连接，测序分析正确后，
第４３卷第４期
２０１３年４月
温
州
医
学
院
学
报
ＶＯ１．４３Ｎｏ．４
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ
Ａｐｒ．２０１３
潮ＮＲ４Ａ１基因的克隆及真核表达载体的构建
小鼠ｐＩＥＲＳ２一ＺｓＧｒｅｅｎｌ — ＮＲ４Ａ１真核表达载体。转染重组载体到细胞后，相比Ｂｃ组（１．Ｏ０士０．Ｏ０）和Ｎｃ组
（０．９９±０．１６），ＰＺ — ＮＲ４Ａ１组（２．６２±０．２１）ＮＲ４Ａ１ｍＲＮＡ表达水平明显升高（Ｐ＜０．０５），而Ｂｃ组和Ｎｃ
［关键词］ＮＲ４Ａ１；真核表达载体；心肌细胞；基因；克隆［中图分类号］Ｒ３６３．１［文献标志码］Ａ［文章编号］１０００ — ２１３８（２０１３）０４ — ０２３２ — ０５
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅＮＲ４Ａ１ｇｅｎｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＷＡＮＧＬｉａｎｇｇｕｏ，

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆＶＥＧＦＡｇｅｎｅ
ＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＶＥＧＦＡｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｉｆｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄｍｏｎｏｃｙｔｅｓｂｙＲＴ— ＰＣＲｎｄａｔｈｅｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎｌｌａｙｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＧＦＰ・ — Ｎ１ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＧ－・ＦＰ— ＶＥＧＦＡ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｐＥＧＦＰ－ＶＥＧＦＡｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＢｇｌＩＩａｎｄＳａｉｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｌｙａｓｉｓ，ａｎｄｓｅ — ｑｕｅｎｃｅａｎｌｙａｓｉｓ．ＴｈｅｐＥＧＦＰ — ＶＥＧＦＡｗａｓｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｒｅａｇｅｎｔ，ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建讲解

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建摘要：目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。

方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因，用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。

经酶切鉴定与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3的相应酶切位点。

结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实，与Erdman株完全一致；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3。

结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功，为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。

关键词:结核分枝杆菌；Ag85B；真核表达载体中号：R378.91＋1,Q782 文献标识码：A文章编号：1007-8738(2000)02-314-03Cloning of Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis and its construction of eukaryotic expression vectorFAN Xiong-lin,XU Zhi-kai,BAI Guang-chun,LI Yuan,LI Bie-hu,XUE Ying (Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an710033,Shaanxi Province,China)Abstract:Aim To construct polynucleotide vaccine based on Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis.Methods The gene encoding Ag85B mature protein was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain,and inserted into cloning vector pUC19 after restriction endonuclease digestion.Gene fragment encoding Ag85B mature protein was correctly inserted into the vector,which was confirmed by partial nucleotide sequencing and restriction endonuclease digestion,and then was subcloned to Corresponding sites cut with HindⅢ plus EcoRⅠ of eukaryotic expression vector pcDNA3.Results The gene encoding Ag85B mature form of Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain is identical with that of Erdman strain.The cloned gene was correctly inserted into the vector pcDNA3,which was confirmed by restriction endonucleasedigestion.Conclusion The successful construction of recombinanteukaryotic expression vector based on the gene encoding Ag85B mature protein of Mycobacterium tuberculosis,lays the foundation for further researching prevention and treatment of tuberculosis.Keywords:Mycobacterium tuberculosis;Ag85B;eukaryotic expression vector结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。

P.f多期多表位基因真核表达载体的构建和免疫学特性初步研究

P.f多期多表位基因真核表达载体的构建和免疫学特性初步研究目的构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究。

方法在前期研究基础上，将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020内并大量制备。

以VR1020重组质粒免疫HHD-2小鼠并进行细胞和体液免疫分析。

结果成功获得重组真核表达载体，ELISA显示该重组质粒免疫小鼠后获得了较高效价的抗体，而且显示了较好的CTL杀伤活性，同时诱导了高水平的细胞因子。

结论本研究为新型疟疾疫苗的研制奠定一定的理论和实践基础。

标签：恶性疟原虫；疫苗；多表位基因疟疾是严重危害人类健康的热带传染病，在非洲仅次于HIV/AIDS，排在第2位。

疟疾疫苗的研制对儿童、孕妇等高危人群的保护方面尤为重要。

但是，由于疟原虫具有复杂的生活史、抗原变异等特点，疫苗的研制仍是困难重重。

目前已经结束Ⅲ期临床试验的RTS，S疫苗对低龄婴儿的保护率仅为53%左右[1-2]，但这已经是疟疾疫苗研究领域非常重大的突破。

在疟原虫的生活史过程中，子孢子入侵肝细胞和裂殖子入侵红细胞是两个有决定性意义的步骤，截止目前尚无一种疫苗或疫苗免疫策略可成功兼顾疟原虫红细胞内期和肝细胞内期。

我们在前期构建疟原虫联合红内期和肝内期的多表位基因的基础上，构建其真核表达载体并且研究其诱导小鼠的免疫应答。

本研究从体液免疫和细胞免疫水平研究该多期多表位疫苗的免疫学特性，为研究新型疟疾疫苗提供理论和实践基础。

1 材料与方法1.1 一般材料DNA免疫用载体质粒VR1020由美国海军医学研究所的Stephen L.Hoffman博士惠赠。

T-AMA-1和T-MEG均为本教研室制备，HHD-2小鼠由本教研室转基因动物室提供。

1.2 方法1.2.1 VR1020/AMAMEG重组表达载体的构建采用参考文献[3]方法，用BamHI和BgLII双酶切的真核载体VR1020，以BamHI和NdeI双酶切T-AMA-1，以NdeI和BgLII双酶切T-MEG，将三片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α。

hβ-NGF基因真核表达载体构建及亚细胞定位

ｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐａｒｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｂｕｔｎｏｔｎｕｃｌｅｕｓ．Ｔｈｅ
ｍｏｓｔｏｆｈｉ？一ＮＧＦｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｅｄｉｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｐａｃｅ，ａｓｍａｌｌｎｕｍｂｅｒｏｆｉｔｓｗａｓｌｏｃａｔｅｄｅｎｄｏｓｏｍｅａｎｄ
文章编号：１００７— ４２８７（２０１８）０２—０３００—０３
ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１８，Ｖｏｌ２２，Ｎｏ．２
ｈ』３一ＮＧＦ基因真核表达载体构建及亚细胞定位
杨智，赵冬梅，任秀敏。，桑川，尹兴忠，程春凤 ¨
１．２．２ｐＥＧＦＰ—Ｎ１＿ｈＪ３一ＮＧＦ融合蛋白的表达和定位转染前２４ｈ将ＨＥＫ２９３细胞以适宜密度接种于２４孑Ｌ板中，分为空白组、空载组和实验组，后两组基因转染参照Ｌｉｐ２０００说明书进行。转染后置孵箱中培养２４ｈ后荧光显微镜下拍照各组细胞ＥＧＦＰ表达和位置，ＩｍａｇｅＪ软件计算荧光图片中细胞的平均光密度值一累计光密度（Ｉ（）Ｄ）／Ａｒｅａ面积。得到各组数据以ｏｒ±５表示，采用ＳＰＳＳ１７．０软件组间方差分析，Ｐ＜０．０５有显著差异。１．２．３ｈｉ？一ＮＧＦ基因编码蛋白生物信息学分析和
中国实验诊断学２Ｏｌ８年２月第２２卷第２期

6His-hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定

6His-hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定目的:本实验拟构建hVEGF165基因的真核表达载体,为其应用于治疗大鼠缺血皮瓣的研究奠定基础。

方法:设计引物P1和P2,在每一个引物的两端分别添加BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。

从人外周血中提取总RNA,用RT-PCR方法得到hVEGF165的cDNA。

随后再将得到的cDNA连入中间载体pMD19-T,得到pMD19-T-hVEGF165,双酶切鉴定并测定序列。

将hVEGF165的cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA6/His A中,构建hVEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165。

结果:对pMD19-T-hVEGF165的测序结果表明,本研究成功地从人外周血中扩增到hVEGF165的cDNA。

将hVEGF165定向克隆入真核表达载体pcDNA6/His A,经双酶切及PCR鉴定,将阳性克隆测序,经测序证实序列正确。

结论:本研究成功地构建了VEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165,并且目的基因上游融合有His标签。

标签：VEGF165;皮瓣;载体构建;融合基因Construction and identification of eukaryotic expression vector for6His-hVEGF165ZHANG Xianyu1, WANG Tao2, CHEN Weihua2, PANG Da1(1.Department of Breast Surgery, the Tumor Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, China; 2.Department of Reconstruction Surgery, the Fourth Clinical Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China) [Abstract] Objective: To construct eukaryotic expression vector of hVEGF165 to lay the foundation for the study of the treatment of ischemic rat skin flaps. Methods: Two specific primers P1 and P2 were designed, restriction enzyme cutting site of BamHⅠand XhoⅠwere introduced into the two ends of each primer. We isolated mononuclear cells from human venous blood and got out the total RNA and then the hVEGF165 cDNA was cloned by using RT-PCR. We cloned the cDNA into pMD19-T vector, named pMD19-T-hVEGF165. The positive clone was sent for DNA sequencing after blue-white selection and identification by double enzymes digestion. To construct the eukaryotic expression vector of hVEGF165, we subcloned the cDNA into the eukaryotic expression vector pcDNA6/His A. The PCR and identification by double enzymes digestion were performed and the positive clone was sequenced as before. Results: The result of DNA sequencing of pMD19-T-hVEGF165 showed that we successfully cloned the hVEGF165 cDNA from the human venous blood. The cDNA of hVEGF165 was directed cloned into pcDNA6/His A. The positive clone was sent to sequence after PCR and identification by double enzymes. The result of DNA sequencing showed that the cDNA was cloned into pcDNA6/His A in the right direction and the sequence was right. Conclusion: We construct an eukaryotic expression vector of hVEGF165. His tag is fused with the upstream of target gene.[Key words] VEGF165; Skin flaps; Construction of vector; Fusion gene血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)又称血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF),是一组功能强大且能产生多种效应的细胞因子[1]。

结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达

结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达【摘要】目的：应用分子生物学技术，构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒，并在真核细胞中表达. 方法：以结核分枝杆菌H37Rv 株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因，同时从质粒pORF hGM CSF中扩增出基因佐剂hGM CSF，分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A（MCSA）和B（MCSB）中，构建pIHsp65GM真核表达质粒，并转染HepG2细胞中表达和检测. 结果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb，测序分析表明克隆的Hsp65和hGM CSF序列与GenBank上公布序列完全一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA 方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论：成功构建和表达了pIHsp65GM质粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白65；人粒巨噬细胞集落刺激因子；双顺反子；基因佐剂0引言卡介苗（bacille calmette guerin, BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis, TB）的减毒活疫苗. 由于结核DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一［1］. 结核杆菌热休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD, Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应［2］.粒细胞吞噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor, GM CSF)作为良好的基因佐剂,可以利用其上调机体免疫水平的作用增强DNA疫苗的效能［3-4］. 虽然Hsp65抗原和GM CSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GM CSF协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚［5］. 我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和基因佐剂hGM CSF的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核DNA疫苗的免疫效果奠定基础.1材料和方法1.1材料结核分枝杆菌H37Rv株基因组，大肠杆菌DH5α，载体pIRES 和质粒pORF hGM CSF(暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室提供)；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶Nhe I，EcoR I, Xba I和Not I，DL 1 kb marker，质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒(大连宝生物公司)；两对PCR引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成；Transmaster转染试剂（广州博理生物科技公司）；即用型免疫组化Biotin SPHRP试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白单克隆抗体和人hGM CSF蛋白ELISA检测试剂盒（深圳市晶美生物科技公司）.1.2方法1.2.1目的基因Hsp65和hGM CSF的PCR扩增参照GenBank上结核分枝杆菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陆号：M15467）分别设计引物进行PCR扩增.1.2.2pIHsp65真核载体的构建与鉴定将Hsp65的PCR产物经过回收纯化后与载体pIRES，同时用Nhe I和EcoR I双酶切，酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h.转化用低温CaCl2制备的E.coli DH5α感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150 r/min振荡培养过夜.先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落PCR检测是否有Hsp65的存在，将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Nhe I和EcoR I双酶切，进行电泳检测，以DL1 kb marker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定. 测序采用Sanger双脱氧链终止法，对插入序列的两端进行测定，测序工作由上海生物工程公司完成.1.2.3pIHsp65GM真核表达质粒的构建与鉴定同构建pIHsp65载体方法一样，将hGM CSF的PCR产物经过回收纯化后与载体pIHsp65同时用Xba I 和Not I 双酶切，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h,然后转化感受态细菌E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB 培养液中，37℃下150 r/min振荡培养过夜.将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Xba I 和Not I双酶切，进行电泳检测，以DL 1 kb marker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定.1.2.4细胞转染取对数生长期的HepG2细胞接种在12孔板内，待细胞生长至70%～80 %时，加入阳离子多聚体转染试剂Transmaster和质粒pIHsp65GM的混合物.饥饿培养1 h,加入含100 mL/L小牛血清的完全培养基，培养24 h后，检测Hsp65和hGM CSF蛋白的表达.1.2.5Hsp65蛋白表达的免疫组化检测采用未转染细胞为空白对照和转染了空质粒pIRES的细胞为阴性对照，将空质粒pIRES和重组质粒pIHsp65GM转染HepG2细胞48 h,去除培养液,用磷酸盐缓冲盐水PBS冲洗.经40 g/L的多聚甲醛固定后,依次滴加过氧化酶阻断剂,正常动物非免疫血清,1∶1000鼠抗人Hsp65蛋白抗体,生物素标记二抗和链霉素抗生物素蛋白.最后加入新鲜配制的DAB工作液染色,显微镜下观察结果，Hsp65蛋白的表达以细胞质染呈棕黄色者为阳性.1.2.6ELISA法检测hGM CSF蛋白表达水平分别收集pIRES和质粒pIHsp65GM转染24 h和48 h的HepG2细胞的细胞培养的上清液，采用ELISA双抗体夹心法检测hGM CSF蛋白的表达量，按照试剂盒说明进行操作.用酶标仪在吸光度A450 nm下测定样品和试剂盒提供的标准品的A值.根据标准品所测A值绘制的蛋白浓度与A值相关标准曲线计算各样品中hGMCSF蛋白的含量(以空白孔调零).统计学处理：实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件包进行分析,组间比较采用两样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1Hsp65和hGM CSF基因PCR扩增产物电泳分析琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物分别为1.64 kb和0.47 kb 的特异性片段，与预期Hsp65和hGM CSF基因大小相符(图1).2.2重组质粒限制性内切酶消化鉴定质粒pIHsp65经Nhe I和EcoR I双酶切后,电泳可见大小约6.1 kb与1.64 kb两片段,与载体pIRES经Nhe I和EcoR I双酶切产物和Hsp65基因PCR产物的2条特异性条带对比,大小相符（图2A）.重组质粒pIHsp65GM经Xba I 和Not I双酶切后,电泳可见大小约为7.74 kb 与0.47 kb两片段,与质粒pIHsp65经Xba I和Not I双酶切产物和hGM CSF基因PCR产物的2条特异性条带对比,大小相符（图2B）.2.3序列分析鉴定对质粒pIHsp65上的多克隆位点A(multiple cloning sites A,MCSA)内的DNA序列进行序列分析鉴定，结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp 65的基因序列完全相同.对质粒pIHsp65GM上的多克隆位点B(multiple cloning sites B, MCSB)内的DNA序列进行序列分析鉴定, 结果与hGM CSF的基因序列完全相同.2.4Hsp65蛋白在HepG2细胞中的表达显微镜下观察，与未转染细胞的空白对照和转染空质粒pIRES细胞的阴性对照对比，pIHsp65GM转染的部分HepG2细胞中胞质染呈棕黄色，表明Hsp65表达呈阳性（图3）.2.5ELISA检测pIRES对照组在转染24和48 h时细胞上清液hGM CSF的表达量分别为（1.371±0.083）pg/mL和（1.782 ±0.127）pg/mL （n=3），而pIHsp65GM在转染24和48 h时细胞上清液hGM CSF 的表达量分别为（271.103 ±4.731）pg/mL和（253.124±3.943）pg/mL；pIHsp65GM转染组在转染24和48 h时hGM CSF的表达量与pIRES对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）.3讨论近年来，对结核研究最多的抗原主要有Hsp65,Ag85B, ESAT6和MPT64等［6-7］.其中Hsp65具有免疫优势抗原的特性，能诱导和增强机体的体液免疫和细胞免疫的发生，并可激活γδT细胞,分泌高水平的IFNγ和杀伤感染的细胞，是人体感染结核杆菌以后免疫系统的主要靶抗原，是T细胞攻击的主要对象［8］. 由于仅含有单抗原基因的DNA疫苗并不足以引发良好的免疫效果，还需要结合其他的手段如基因佐剂，特别是将细胞因子与DNA疫苗共表达才能产生更强的免疫保护力. GM CSF作为DNA疫苗的免疫佐剂,能够调节树突状细胞的分化和成熟,以及MHC和共刺激分子的表达水平,并且通过调节抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的数量和功能来调节免疫应答的强度.有研究认为将GM CSF作为佐剂与基因疫苗共同免疫小鼠结果比单独应用基因疫苗产生更强烈的细胞免疫应答并可提供更强的免疫保护力［3-5］.本实验采用载体pIRES为双顺反子真核表达质粒，在上下游克隆位点之间的序列为内部核糖体进入位点, 此段序列在转录后能够自动断裂, 使上下游克隆位点插入的基因能够独立高效的表达，从而避免了融合表达蛋白活性低下问题, 为两种蛋白表达、动物实验和结核疫苗研制提供较大方便.与以往结核DNA疫苗的研究比较，本实验具有以下特点：①实现了目的基因与细胞因子基因在同一载体上共同表达.如果将DNA疫苗与编码GM CSF的质粒混合注射会对DNA疫苗的免疫效果产生干扰作用；若将GM CSF与目的基因共同克隆到一个载体中，由于两个基因具有相同的局部微环境，往往可以获得较好的免疫效果［9］.②本研究使用双顺反子真核表达载体pIRES，将两个基因分别克隆到两个多克隆位点，两者各自表达，不相互影响蛋白表达的空间结构.因为表达为融合产物的DNA疫苗可能破坏抗原的三维结构，对抗体的生成产生负面影响［10］.【参考文献】［1］Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis ［J］. Mol Immunol, 2002,39:113-119.［2］Baek KM, Ko SY, Lee M, et al. Comparative analysis of effects of cytokine gene adjuvants on DNA vaccination against mycobacterium tuberculosis heat shock protein 65［J］. Vaccine, 2003,21(2526):3684-3689.［3］Zhang XZ, Maziar D, Patricia N, et al. Intramuscular immunization with a monogenic plasmid DNA tuberculosis vaccine: Enhanced immunogenicity by electroporation and coexpression of GM CSF transgene［J］. Vaccine,2007,25(7): 1342-1352.［4］Qiu JT, Chang TC, Lin CT, et al. Novel codon optimized GM CSF gene as an adjuvant to enhance the immunity of a DNA vaccine against HIV 1 Gag［J］. Vaccine, 2007,25(2): 253-263.［5］Hongxun S, Vladimir MP, Corey M, et al. Regional, but not systemic recruitment/ expansion of dendritic cells by a pluronic formulated Flt3ligand plasmid with vaccine adjuvant activity［J］. Vaccine, 2003,21(26):3019-3020.［6］师长宏，范雄林，柏银兰，等. 结核分枝杆菌Ag85B ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力［J］.第四军医大学学报,2004,25(18):1633- 1636.［7］师长宏，安家泽，唐小凤，等. 结核分枝杆菌MPT64 ESAT6融合蛋白在小鼠内诱导的免疫应答及其保护力［J］.第四军医大学学报,2006,27(9):769-771.［8］Lima KM, Santos SA, Lima AM, et al. Single dose of a vaccine based on DNA encoding mycobacterial hsp65 protein plus TDM loaded PLGA microspheres protects mice against a virulent strain of mycobacterium tuberculosis［J］. Gene Ther,2003,10(8):678-685.［9］李忠明.当代新疫苗［M］.北京:高等教育出版社,2001:163-164.［10］Hildegund CJE. DNA Vaccine ［M］.Translated by Li QH, Liu LD, Che YC, Beijing: Chemistry Industry Press,2005:387-389.。

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定袁媛;何金生;张梅;宋蔚;李栋梁;虞结梅;杨兵【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2006(22)3【摘要】目的克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,HRSV)F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/F,并进行表达和鉴定。

方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。

结果测序证实得到HRSV F基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。

转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。

结论成功克隆HRSV F基因,并在真核细胞中获得表达。

【总页数】4页(P330-333)【关键词】人呼吸道合胞病毒;F基因;真核表达【作者】袁媛;何金生;张梅;宋蔚;李栋梁;虞结梅;杨兵【作者单位】安徽医科大学免疫学教研室【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化 [J], 付远辉;魏薇;何金生;郑娴娴;王小波;唐倩;张梅;屈建国;洪涛2.人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达 [J], 肖玮;梁米芳;钱渊;邓洁;李川3.A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达 [J], 李栋梁;宋蔚;汪红俊;李群;黄保军;胡春松;罗畅民;何金生4.真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法 [J], 陆燕燕;何金生;张梅;虞结梅;谢灿;袁媛;薛绍礼;宋蔚;郑娴娴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因表达载体构建-PPT课件

（三）将目的基因导入微生物细胞
目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是： 1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能够吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基因——质粒重组DNA分子。
3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重组DNA分子，完成转化过程。
3 基因表达载体之基本组成是什么？
（1）结构基因——即提取的目的基因核苷酸序列，负责编码目标蛋白质。
（2）启动子——位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结构的DNA片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。（3）终止子——位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。
进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你
应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗？
（一）基因表达载体的构建
1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的是什么？确保目的基因在受体细胞中稳定存在、复制、遗传和表达，使其发挥作用。 2 请你定义：基因表达载体构建之含义？将目的基因、启动子和终止子科学按装在经修饰和改造完备的载体之上。
（4）复制原点——能够自我复制保证目的基因在受体细胞中复制遗传和表达。
（5）遗传标记基因——检测受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图
插入目的基因启动子终止子
基因表达载体基因表达载体
复制原点遗传标记基因
4 建构基因表达载体方法
（1）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插入位点切割质粒，使质粒出现一个切口，露出两个黏性末端。（2）用同种限制酶切割目标DNA分子，截取目的基因，使其产生与质粒相同的末端。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

基因的克隆、表达载体构建及功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备※基本流程提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。

1）实验前准备预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。

2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。

（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。