分子克隆技术第三章
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。
构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。
亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。
PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。
但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。
第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。
限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。
甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。
并且能够保证自身的DNA不被降解。
使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。
如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。
II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。
其限制反应与甲基化反应是分开的反应。
不需要ATP的参与。
限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。
回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
但他们的切割位点有可能不同。
分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。
分子克隆技术实验操作手册
分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。
Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
《分子生物学检验技术》课程标准
《分子生物学检验技术》课程标准课程编号：17050021总学时数：72学时（理论40课时，实验32）学分：4.5分一、课程性质、目的与要求分子生物学检验技术是医学检验的专业课之一。
本大纲为本科医学检验专业学生教学的指导性纲要，通过对该课程的学习，掌握分子生物学检验技术的基本内容（概念、术语、原理）、基本方法（PCR、核酸杂交、DNA重组、芯片技术等）以及在临床实验诊断中的应用。
对分子诊断学的发展动态有所了解。
二、本课程的基本内容第一章绪论2课时（一）教学目的与要求1、熟悉分子生物学检验技术的历史、发展趋势2、掌握基因、单基因遗传病和多基因遗传病的概念3、掌握分子生物学检验技术在临床实验诊断中的五个应用领域（二）教学的重点与难点1、重点：基因、单基因遗传病和多基因遗传病的概念2、难点：分子生物学检验技术在临床实验诊断中的应用（三）课时安排：2学时（四）主要内容第一节分子诊断学的概念、任务和特点（0.4）课时第二节分子诊断学的发展简史（0.3）课时第三节分子诊断的基本策略及其在医学中的应用（1）课时第四节展望（0.3）课时第二章基因与基因组 6课时(一）教学目的与要求1、掌握基因与基因组的概念2、熟悉基因组的结构特征3、掌握质粒的概念类型及一般性质4、掌握转位因子的概念、类型及转位的遗传效应5、熟悉DNA病毒基因组的总体特征6、掌握真核生物基因组的特点，包括细胞核基因组和细胞质基因组结构和功能，单顺反子、短列基因、多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类7、掌握基因结构异常的概念、类型；掌握端粒的概念、结构特点及主要作用，端粒酶组成、特点和作用，端粒酶活性测定及其临床意义（二）教学的重点与难点1、重点：（1）生物基因组的结构特征；基因与基因组的概念（2）质粒的概念、类型及一般性质；单顺反子、短列基因、多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类（3）基因结构异常的概念、类型；2、难点：转位因子的概念、类型及转位的遗传效应；多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节基因与基因组概论（1）课时1、基因的概念及其发展2、基因组与C值矛盾3、基因组学及其意义第二节真核生物基因组（2）课时1、真核生物基因组的结构与功能特点2、人类基因组计划3、人类基因组多样性第三节原核生物基因组（2）课时1、原核生物基因组的一般特点2、质粒3、转座基因第四节病毒基因组（1）课时1、病毒基因组的核酸类型2、病毒基因组的大小及碱基组成3、病毒基因组的结构与功能特点第三章分子克隆 6课时（一）教学目的与要求1、掌握常用的工具酶，熟悉DNA常用的重组载体2、了解DNA重组与鉴定，了解外源基因的蛋白表达3、掌握DNA序列测定的原理（二）教学的重点与难点1、重点：（1）常用的工具酶的用途（2）DNA序列测定的原理2、难点：（1）DNA序列测定的原理（2）DNA重组与鉴定，外源基因的蛋白表达（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节工具酶（2）课时1、限制性核酸内切酶2、DNA聚合酶3、DNA连接酶4、碱性磷酸酶5、T4多核苷酸激酶6、核酸酶S1第二节载体（1）课时1、克隆载体2、表达载体3、穿梭载体第三节分子克隆的基本步骤（2）课时1、目的基因的获取2、载体的选择3、目的基因和载体的连接4、将重组DNA导入受体细胞5、重组体的筛选和鉴定第四节克隆基因的表达（1）课时1、原核生物基因表达的特点2、真核生物基因表达的特点3、提高克隆基因表达效率的途径第四章核酸分子杂交技术 4课时（一）教学目的与要求1、掌握核酸分子杂交的基本原理2、掌握核酸杂交中的基本概念：探针、变性、复性、融解温度3、掌握核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素4、了解核酸分子杂交的方法学评价及其应用（二）教学的重点与难点1、重点：（1）核酸分子杂交的基本原理（2）核酸杂交中的基本概念：探针、变性、复性、融解温度（3）核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素2、难点：核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节核酸分子杂交的基本原理（1）课时1、核酸变性2、核酸复性第二节核酸探针（2课时）1、核酸探针的种类2、核酸探针的标记3、核酸探针的纯化4、核酸探针的检测第三节核酸分子杂交的影响因素（1）课时第四节核酸分子杂交的类型1、固相核酸分子杂交类型2、液相核酸分子杂交第五章核酸扩增技术 6课时（一）教学目的与要求1、掌握PCR、RT-PCR的基本原理，及PCR的反应体系和条件2、了解以PCR为基础的相关技术3、熟悉PCR产物的检测4、熟悉PCR技术在临床基因诊断中的应用（二）教学的重点与难点1、重点：（1）PCR、RT-PCR的基本原理，及PCR的反应体系和条件（2）PCR技术在临床基因诊断中的应用2、难点：PCR的反应体系和条件选择与控制（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节聚合酶链反应技术（2）课时1、PCR技术原理2、PCR反应体系及其优化3、扩增产物检测及分析4、常见问题原因分析与处理5、PCR衍生技术第二节荧光定量PCR技术（2）课时1、荧光定量PCR技术基本原理2、荧光定量PCR技术3、荧光定量PCR测定的数据处理4、实时荧光定量PCR技术的应用第三节其他扩增技术（1）课时1、基于转录扩增技术2、探针扩增技术3、信号扩增技术第四节临床基因扩增检验实验室的管理与质量控制（1）课时1、临床基因扩增实验室的管理与质量控制2、操作人员培训3、临床基因扩增实验室的规范化设置第六章 DNA序列测定 3课时（一）教学目的与要求1、掌握Sanger双脱氧链末端终止法的基本原理及反应条件2、熟悉化学降解法的基本原理3、了解其他测序方法（二）教学的重点与难点1、重点：（1）Sanger双脱氧链末端终止法基本原理（2）化学降解法的基本原理2、难点：Sanger双脱氧链末端终止法基本原理（三）课时安排：3课时（四）主要内容第一节Sanger双脱氧链末端终止法（2）课时1、测序原理2、测序体系3、方法特点第二节 Maxam-Gilbert化学降解法（1）课时1、测序原理2、测序体系3、方法特点第三节其他测序技术（自学）第四节自动化测序（自学）第八章生物芯片技术与应用 2课时（一）教学目的与要求1、掌握生物芯片的概念、分类2、熟悉DNA芯片的制备过程及应用3、了解蛋白质芯片和缩微芯片技术（二）教学的重点与难点1、重点：（1）生物芯片的概念、分类（2）DNA芯片的杂交与检测应用2、难点：DNA芯片的制备过程及检测原理（三）课时安排：2课时（四）主要内容第一节基因芯片（1）课时1、芯片微阵列制备2、样品的制备及标记3、样品与基因芯片的杂交4、杂交结果的检测及分析第二节蛋白质芯片（0.3）课时1、蛋白质芯片的原理2、蛋白质芯片的分类3、蛋白质芯片的制备及分析4、蛋白质芯片的应用第三节组织芯片（0.0.4）课时1、组织芯片的分类2、组织芯片的制备3、组织芯片的应用第四节液相芯片（0.3）课时1、液相芯片检测技术的原理及特点2、液相芯片检测技术的应用第章蛋白质组学技术3学时（一）教学目的与要求1、熟悉蛋白质组学研究基本技术2、熟悉蛋白质问相互作用的研究技术3、了解蛋白质组学的生物信息学分析（二）教学的重点与难点1、重点：（1）双向凝胶电泳技术、蛋白质芯片技术（2）酵母双杂交技术2、难点：酵母双杂交技术（三）课时安排：3课时（四）主要内容第一节蛋白质组学研究基本技术（1.5）课时1、双向凝胶电泳技术2、生物质谱技术3、蛋白质芯片技术4、蛋白质印迹法第二节蛋白质问相互作用的研究技术（1.0）课时1、酵母双杂交技术2、免疫共沉淀技术第三节蛋白质组学的生物信息学分析（0.5）课时1、蛋白质定性鉴定2、蛋白质翻译后修饰分析第三章核酸的分离与纯化 4课时（一）教学目的与要求1、掌握核酸的分离与纯化的设计、原则和保持核酸完整性的方法2、熟悉核酸分离与纯化的技术路线，核酸浓度、纯度和完整性的鉴定的原理与方法3、掌握DNA提取和纯化的方法原理及其应用4、熟悉质粒DNA抽提的方法及应用5、掌握总RNA的分离与纯化的方法原理及应用，mRNA的分离与纯化的方法原理（二）教学的重点与难点1、重点：（1）核酸的分离与纯化的设计、原则和保持核酸完整性的方法（2）核酸浓度、纯度和完整性鉴定的原理与方法（3）真核生物基因组DNA和mRNA的分离与纯化的方法原理2、难点：（1）保持核酸完整性的方法（2）质粒DNA的提取和RNA的分离与纯化（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节核酸的分离与纯化的设计、原则（1）课时第二节 DNA提取和纯化的方法原理及其应用（1）课时第三节质粒DNA抽提的方法及应用（1）课时第四节总RNA及mRNA的分离与纯化的方法原理（1）课时第十章感染性疾病的分子诊断 4课时（一）教学目的与要求1、掌握病毒的基因检测、细菌的基因检测、衣原体的基因检测、支原体的基因检测2、熟悉梅毒螺旋体的基因检测、真菌的基因检测（二）教学的重点与难点1、重点：（1）病毒的基因检测（2）细菌的基因检测（3）衣原体的基因检测、支原体的基因检测（4）梅毒螺旋体的基因检测2、难点：（1）病毒的基因检测与应用（2）细菌的基因检测与应用（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节病毒的基因检测（1）课时1、乙型肝炎病毒2、单纯疱疹病毒3、风疹病毒4、巨细胞病毒5、人类免疫缺陷病毒第二节细菌的基因检测（1）课时1、结核分支杆菌2、淋病奈瑟菌3、O157型大肠埃希菌4、幽门螺旋杆菌5、细菌耐药基因的检测第三节衣原体的基因检测（0.5）课时第四节支原体的基因检测（0.5）课时第五节梅毒螺旋体的基因检测（1）课时第六节原虫的基因检测（自学）第七节真菌的基因检测（自学）三、教学方法以教师讲授为主，辅以多媒体教学手段，并结合学生的练习与实验。
分子克隆实验操作
第一章目录第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第二章DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章RNA的提取和cDNA合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA的提取第七章RFLP和RAPD技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第二章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
核酸凝胶电泳
凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色
的凝胶成像，图像可以直接输出到 计算机观察。
凝胶中DNA的回收
现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA
2
不能有效回收少量DNA
一、DNA 琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
• 电泳原理： • DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成 反比。
10ul，RNA 样品4.5ul,混匀。
② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 ③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。
④ 上样。 ⑤ 电泳：电泳槽内加入1X MOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压
下电泳。
⑥ 电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。
（二） 凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的
样品相混合的一种缓冲液。
（一）凝胶的制备及电泳
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10
0.9
1.2 1.5 12.0
分子生物学 第三章 DNA的复制PPT课件
复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链
解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互
补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合
成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条
链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA
分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个
子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则
是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个
37
(三)DNA复制的终止
❖ 过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该 DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。 但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制 终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终 止，并不一定等全部DNA合成完毕。
Meselson等证明DNA的半保留复制
6
复制起点和复制子
❖ DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定
位置开始。这个特定的位置就称为复制起点
(Origin of replication)，用ori表示。DNA复制 从起点开始双向进行直到终点为止，每一个 这样的DNA单位称为复制子或复制单元 (replicon)。
12
Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki
3‘ （semi-discontinuous replication ! ）
5‘
3‘
5‘
DNA replication in Okazaki fragment 1kb At least one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kb13
26
❖ 为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢? 这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。 DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差 错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也 要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的 准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ 催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加 在RNA引物3&#点
第三章 分子克隆的载体
3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 有合适的选择标记，易于筛选。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
11
一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
25
✓ 筛选标记基因 主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外
源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通 过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重 组质粒。
α-互补 插入失活
26
α-互补
α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变
体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体 之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
37
38
2）pUC18/19质粒载体
• 来自pBR322 • 拷贝数 2000 - 3000 / cell • 装有多克隆位点（MCS）
分子生物学分子克隆技术
克隆示意图
克隆技术流程
分 切 连 转 筛
分
分离 来自生物组织 、扩增 设计引物,PCR扩增 mRNA-------DNA------扩增
引物设计与订购
酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液,
引物订购
保护碱基
1.用限制性酶消化 DNA 样品
单酶切
双酶切
选择合适的双酶切缓冲液
提取正确的克隆菌中的质粒,转入表达型的菌株,如BL21等,诱导表 达蛋白
鉴定方法
鉴 定
PCR
原 位 杂 交
免疫学方法 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
蛋白质的纯化
谢谢
多利诞生的过程
为什么震惊和惊呼,我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和 体细胞克隆的区别这两个基本问题,对我们学习后面内容或许有所帮助和 启发,
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应 PCR 技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 包括感受态细胞制备
聚合酶链反应 PCR 技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
目的基因高效表达规律
1. 目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 2. 对于翻译后需要修饰蛋白质结构,能够进行目的蛋白结构修饰的
表达方式 3. 能够将目的蛋白分泌到细胞（ZHOU）质、特别是分泌到细胞外
的分泌型表达方式 4. 降低不含目的基因细胞的比例,保持目的基因的稳定性,使目的基
因在宿主细胞内长时间超持和表达 5. 通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞,提高细胞
1 真核基因组庞大而复杂,不易制得基因图谱,
分子克隆
3. 简并序列（degenerate ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ）又称“松弛”特异识别， 即识别位点中某些核苷酸可以被其他 核苷酸替换。 ↓
如：ＡｖａⅡ：5，—Ｇ ＧＡ／ＴＣＣ—3， 3，—ＣＣＴ／ＡＧ Ｇ—5， ↑ ４.非回文结构： ↓ 如：ＭｂｏⅡ：5，—ＧＡＡＧＡＮ８—3， 3，—ＣＴＴＣＴＮ７—5， ↑
Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++， ATP为辅助因子；切割位点靠近识别 序列但较难预测。一般在25~27bp范 围内切割。现已报道4种。
I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修 饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP， 切割DNA链的位置远离识别序列，因 此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都 不常用。
５.在酶反应缓冲体系中均添加有 二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳 定酶活性防止氧化。 ６.在具体试验操作时应在低温或 冰浴条件下完成。
二、DNA聚合酶 DNA polymerase
分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。 Klenow片段。 T4噬菌体DNA聚合酶。 T7噬菌体DNA聚合酶。 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序 酶） 耐热DNA聚合酶。 依赖RNA 的DNA聚合酶。（逆转录酶）
4.切割后产生平头或粘性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的 对称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列 为5’-GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序 列的两个对称点切开DNA双链，产生末端 带有单链尾巴的切口。粘性末端又可分为 两种：从DNA分子5’端切割产生5’端突出 的粘性末端称为5’粘性末端．如EcoRI； 从3’端切割产生3’端突出的粘性末端称为3’ 粘性末端，如Pst I。
《分子克隆》PPT课件
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。
由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。
质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。
目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。
根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。
由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。
质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。
通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。
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2017/2/21第三章载体第一节基因克隆技术概述一、基因克隆技术基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
二、目的基因的取得1、直接2、反转录酶3、化学合成4、基因文库5、PCR♦首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。
将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。
可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。
由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。
三、重组体的构建1、载体要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。
（1）质粒（plasmid)（2）噬菌体λ的衍生物（3）科斯质粒（cosmid）（4）单链DNA噬菌体M13（5）病毒♦面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。
只有引入了该基因的细菌才能生长。
进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。
2、载体的性质1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。
2）载体DNA的分子量应该较小。
3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。
4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。
3、酶系的选用四、转化及重组子筛选鉴定1、转化（transformation)获得重组DNA以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformation）感受态（competence)、电击2、重组子3、重组子的筛选方法（1）载体上的报告基因（reporter gene)抗药性基因、lacZ基因的显色反应、发光基因（lux)（2）单菌落扩增（3）菌落杂交一、质粒的概念附加体（整合质粒，intergrative plasmid)二、质粒的一般生物学特性1、质粒DNA（1）SC构型：共价闭合环形DNA(closed circle DNA, ccDNA)（2）OC构型开环DNA(opencircle DNA, ocDNA)（3）L型线性DNA(linker DNA, lDNA)2017/2/21第二节质粒载体（Plasmid Vector)质粒名称质粒来源核苷酸长度（kb ）分子量(MD)2、质粒的复制与遗传根据质粒与宿主菌的相关程度pTiAch5 土壤农杆菌213 142 某种质粒在一个细菌细胞内的数目就称为这种质To L 假单胞菌117 78 粒的拷贝数（copy number）F 大肠杆菌95 63严密型质粒（stringent plasmid)RP4 假单胞菌54 36Col E1 大肠杆菌 6.36 4.2 松弛型质粒 (relaxed plasmid)pBR322 大肠杆菌 4.362 2.9 根据质粒是否带有转移基因（tra基因）pBR345 大肠杆菌0.7 0.46 接合型质粒（传递性质粒）非接合型质粒22017/2/21严密型质粒（stringent plasmid)严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止松弛型质粒 (relaxed plasmid)松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。
♦所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象♦只有在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒♦质粒不亲和的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
♦接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。
接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒DNA转移的基因。
这一过程是由接合型质粒上的转移基因（tra genes）控制的。
♦非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。
根据质粒上带有特殊用途的基因♦ 1）生殖性质粒（fertility plasmid）这类质粒简称“F质粒”，它有tra基因，主要用于细胞间的接合生殖（F因子）♦ 2）抗性质粒（resistance plasmid）抗性质粒简称R质粒，它携带有赋予宿主细胞一种或多种抗生素抗性的基因，这些抗生素包括土霉素，氨苄霉素等。
（R因子）3）Col质粒Col质粒可以编码一种可杀死其他细菌的蛋白colicin。
♦4）降解质粒（degradative plasmid）降解质粒主要是使宿主细菌消化一些非“正常”的分子，如水杨酸等。
♦5）致病质粒（virulence plasmid）致病质粒赋予宿主细菌细胞以病原菌侵染性，例如土壤农杆菌中的Ti质粒（诱导肿瘤质粒，Tumor inducing plasmid）可以在大多数双子叶植物和少数单子叶植物上诱导形成冠瘿病。
♦ 3、构建质粒克隆载体的基本策略1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。
分子量越小越能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源性DNA就越长。
分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。
2）缺失tra基因，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌，所以是非接合型质粒。
3）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。
4）具有一个或几个报告基因，而且引入的基因应在限制性内切酶的单切点之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。
3♦4、质粒的改造♦“天然质粒”:它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体 外修饰改造的质粒。
♦在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColEI、RSF2124和pSC101 。
♦第一个用于基因克隆的是天然质粒pSC101，它对于Eco RI限制酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源DNA既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性选择记号（Tet r）。
2017/2/21三、常用的质粒载体♦（一）pBR322质粒载体♦万能质粒之称♦1、标准的质粒载体命名法则“p”表示它是一种质粒“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bolivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母“322”系指实验编号“BR”恰好与“细菌抗药性”（bacterial resistance）两个词的第一个英语字母等同2、pBR322质粒载体的物理图谱3、pBR322质粒载体的构建♦ pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒。
复制子的来源。
♦ pBR322质粒上的氨苄青霉素抗性基因（Amp r）是取自于pSF2124质粒♦来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（Tet r）;♦在pBR322质粒载体的构建过程中的一个重要目标是缩小基因组的体积，这就需要从质粒DNA上移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，同时也伴随着消除掉若干个对DNA克隆无用的限制酶识别位点。
还要设法使质粒内存在的任何易位子统统失去功能。
4、pBR322质粒载体的优点♦具有较小的分子量。
统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从Eco RⅠ限制酶的识别位点开始，并公认该序列--GAATTC--中的第一个T为核苷酸1。
♦克隆载体的分子大小最好不要超过10kb（6kb）。
♦具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
Amp s Tet s，Amp r Tet s， Amp s Tet r♦具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
42017/2/21（二）pUC质粒载体♦1、概述♦在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）的lacZ’基因而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
♦pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学（University of California）的科学家J．Messing 和J．Vieria于1987年首先构建的。
2、pUC质粒载体的结构（i）来自 pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（Amp r），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的 DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；（iv）位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。
3、pUC质粒载体的优点♦1、具有更小的分子量和更高的拷贝数在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多♦2、适用于组织化学方法检测重组体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。
因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定♦3、具有多克隆位点MCS区段（三）TA克隆载体♦ Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性活性，这种活性可以在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A）。
根据这一特点研制出了一种线性质粒，其5’端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。