分子克隆实验

分子克隆技术实验报告姓名：班级：学号：指导老师：pUC19外源1.5kbDNA片段亚克隆于pUC1301摘要：分别从大肠杆菌菌液中提取质粒pUC19和pUC1301，两种质粒都使用Bam HI+Kpn I两种限制性内切酶进行切割。

回收pUC1301质粒中1.5kb片段，使用连接酶将它与切开的pUC19连接，转化感受态大肠杆菌，利用标记基因amp r、kan r和α—互补筛选阳性克隆。

实验获得了很好的酶切效果，但最后没有筛选出阳性克隆。

关键词：pUC19、pUC1301、亚克隆、限制性内切酶、感受态1前言初始克隆中的外源DNA片段往往较大，含有许多目的基因以外的片段，在诸如表达、序列标签和突变等操作中不变进行，因此必须将目的基因所对应的小片段DNA找出来，这个过程叫做亚克隆。

本实验是将pU1301中一段来自水稻1.5kb的片段亚克隆到pUC19上。

首先需要提取所需的质粒。

在大肠杆菌中质粒又大又小、拷贝数又多又要少，因此分离的方法也多种多样。

在实践中最常见的是通过将裂解法提取高拷贝的小质粒以及基于此方法的纯化技术，其他方法还有试剂盒分离纯化等，本实验通过试剂盒分离纯化E.coil质粒DNA。

将质粒提取出来后需要检测所获质粒的质量，方法有吸光值检测、凝胶电泳检测等。

要获得目的片段然后亚克隆与其他载体上，需使用两种工具酶：限制性内切酶、连接酶。

限制性酶切酶主要有三类，目前使用最多的是Ⅱ型。

限制性内切酶的使用需要在合适的条件下，当条件不合适时往往会出现星星活性。

限制性内切酶产生的黏性末端将导致载体自连，为了防止其自连，可以使用双酶切、去磷酸化、末端补平等方法。

连接酶是将两段核酸连接起来的酶，常用的有T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T4RNA连接酶。

目的片段和载体在连接酶作用下连接成一个整体，需借助一定方法导入受体细胞，首先需要制备感受态细胞，这类细胞处在易吸收外源DNA 条件下，然后通过电转化、CaCl2转化法将外源DNA导入受体细胞。

外源DNA 是否导入受体细胞，常用的做法是通过标记基因来筛选，而载体是否与目的片段连接使用α—互补筛选重组子。

LacZ编码β—半乳糖苷酶，在IPTG诱导下催化X-gal生成蓝色物质，当目的片段插入其中时，将导致β—半乳糖苷酶不能催化X-gal生成蓝色物质而是菌落显示白斑。

通过本实验可以掌握质粒的提取、感受态细胞的制备、酶切酶联反应、提取质粒质量检测等操作，对提高实验技能、科研素养有很大帮助，做完完整的实验可基本学会亚克隆的一般过程。

2材料与方法：2.1材料携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液、携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液2.2试剂Solution I:Tris.HCl（pH 7.5）50 mMEDTA10 mMRNase A100 µg/mlSolution II: NaOH0.2 MSDS 1 %Solution III:Final concentrationKAC 1.32 MUsing HAC to adjust pH to 4.8TE (pH 8.0)：Tris.HCl（pH 8.0）10 mMEDTA（pH 8.0） 1 mM苯酚/氯仿无水乙醇、异丙醇琼脂糖、0.5×TBE0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）上样缓冲液2.3方法：2.3.1质粒的提取取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养。

用无菌牙签或接种环挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于摇床（37℃、250 r/min）培养过夜。

吸取1.5 ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉上清；再次吸取1.5 ml菌液收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；12000 g离心10分钟，吸取800μl上清液（不要吸取到飘浮的杂质）至另一个1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；12000 g常温离心10分钟；弃上清，加500μl 75％乙醇，浸洗片刻后离心5分钟（注意离心管的放置方向），弃上清；加40μl灭菌超纯水或TE 溶解；质粒的质量检测，-20℃保存。

2.3.2质粒提取质量检测将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；配制0.8%的琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂糖于30ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子.将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，打开电泳仪，将电压调至不高于5V/cm，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。

2.3.3质粒酶切和效果检测将两种质粒分别使用酶切，在1.5ml的离心管中构建50μl反应体系（30μl 质粒DNA，1μlBamHI (10u/µl)，1μl Kpn I (10u/µl)，5μl10×buffer，13μl ddH2O），所有操作在冰上进行，分别取5μl酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果。

2.3.4酶连之前的处理将装有pUC1301的离心管放于65°C 10分钟，使酶终止反应。

将pUC19酶切产物纯化：加入ddH2O 150μl（扩大体积），加入200µl氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min；吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000 rpm 4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10μl ddH2O，之后进行琼脂糖凝胶电泳。

在紫外灯下切下1.5kb的片段，称取凝胶重量，按3ml/g胶加入BufferDE-A，温浴75°C熔化凝胶加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，转移混合液到2ml离心管中，12000g 离心1min，弃滤液。

加500μlBufferW1，12000g离心30s,弃滤液，加700μlBufferW2，12000g离心30s,弃滤液加700μlBuffer W2，将制备管置于干净的1.5ml离心管中，在制备中央加入10μlEluent或去离子水，静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。

2.3.5去磷酸化与酶连将1.5kb的片段和pUC19去磷酸化。

构建40μl的体系（20μl DNA，0.5μl CIAP （TaKaRa），4.0μl 10⨯ buffer，15.5μl ddH2O），37℃或50℃反应30 min以上。

之后外源取4μDNAl、4μl目的载体DNA、1μl 10⨯ buffer、1μl T4 ligase (1U/μl)，16 ºC水浴保温过夜，使1.5kb的片段与pUC19连接。

2.3.6感受态细胞的制备及质粒的转化前夜接种受体菌（DH5α），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作，吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml 离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下4000 rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入100μl 预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中250μl Amp，250μl X-gal，25μl IPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；管感受态细胞分别加DNA连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；每管加400μl SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏。

取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）。

3结果与分析图1质粒提取质量检测本人的结果为第一个泳道和第二个泳道，样品分别是pUC19、pUC1301。

pUC19两条带非常清晰，从上往下依次是线性的、超螺旋质粒。

理论上应该出现三条带，可能另一条量太少了没检测出来。

pUC1301质粒的条带不是很清晰，可能是大肠杆菌液中含量少的原因，也可能是部分降解或提取效果不好。

图2提取质粒质量检测与酶切酶切效果检测从左到右各泳道分别是：marker、对照pUC19、对照pUC1301、本人pUC19Bam HI+Kpn I酶切图、pUC1301Bam HI+Kpn I酶切图。

对照pUC19只有隐隐约约的一条带，对照pUC1301的一条带较清晰。

pUC19Bam HI+Kpn I酶切图与对照相比并无多大变化、pUC1301Bam HI+Kpn I酶切图显示了两条带，最下面一条分子量大小约 1.5kb,目的片段，但是效果不是很好，可能是提取的质粒有问题，或酶切下不好，只有部分质粒发生了酶切。

图2阳性对照感受态细胞加入了标准质粒，质粒中氨苄青霉素抗性基因，因此可在含有Amp的培养基上生长。

培养基中含有X-gal、IPTG，转化子在IPTG诱导下，催化X-gal产生蓝色物质，因此显示蓝色图3阴性对照感受态细胞中任何加任何DNA,因此不能再含有抗生素的培养基上生长，表现为无菌落长出。

图4转化菌株通过观察，培养基上没有长出菌落。

分析原因如下：感受态细胞效率低，目的片段分解、目的片段与载体连接反应中酶活力不够。

由于本人是最后一个切胶回收，可能前面耽误时间太长造成DNA片段分解。