第三章 分子克隆的载体
生物工艺学第三章 基因克隆载体
与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lac Z`基因）替 换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆 命名p UC——University of California的科学家首先构建。 图3-3。
pUC包括四个组成部分：
（1）pBR322的复制起点(ori) （2）Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内 切识别位点 （3）lacZ`基因 （4）在lacZ`基因 内部靠近5`端有一段MCS连杆
（3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中
Байду номын сангаас
“穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源
DNA 能直接克隆入p UC载体
（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建 大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 构建穿梭质粒 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒
即：大肠杆菌源质粒复制起始点 + 蓝藻源质粒复制起始点。
pPbs（1511bp） ClaⅠ 重组 pPbs pPRS-1 多次亚克隆 pPKE-2 ↑ pBR322 组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Kmr基因 （图3-5）
λ噬菌体基因组的结构
在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸 组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末 端。 注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地 通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。 随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭 起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区 段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即 粘性末端位点之意）
3、 限制性核酸内切酶位点: 56种
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
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ccc-DNA l-DNA oc-DNA
2. 质粒DNA分子大小
3. 质粒的复制
——严紧型质粒：1个寄主内仅含1-3拷贝 ——松弛型质粒：1个寄主内含10-60拷贝
• 质粒DNA复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统 双重控制，不会无限制复制。
Ori
•质粒控制： 序列
拷贝数：细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
5.ion）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或 重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。
• 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的 过程。
• 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过 程。
2. 就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制 区： 含有复制起点）；（选择标记： 主要是抗性基因）；（克隆位点： 便于外 源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。
3. 载体的功能是（ d ）
（a）外源基因进入受体的搭载工具
（b）不能为外源基因提供整合能力
cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点
线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。 注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分 子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5'—P和3'—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种 由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
分子克隆之载体构建完整步骤
分子克隆之载体构建完整步骤一、目的片段的扩增和酶切PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
准备：A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落B.引物配制：a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。
b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul工作液。
终浓度200-400nM。
1. PCR反应体系(50ul)Taq酶体系：Thermo10x buffer （无Mg2+）5ulMgCl2（25mM）5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulTaq DNA聚合酶0.5ulddH2O 补充至50 ul注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。
2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。
PCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30-35：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4-10℃ 保温高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo10x buffer 5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulpfu DNA聚合酶1ulddH2O 补充至50 ulPCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4℃ 保温2. 琼脂糖凝胶电泳验证取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。
3分子克隆载体
顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
第3章 分子克隆载体3
一、M13噬菌体的生物学特性 噬菌体的生物学特性
1．结 构 ．
• 6407bp • 90% 编码蛋白 • 11个编码基因：I、II、III、、、 个编码基因： 、 、 、、、 个编码基因 • 复制蛋白：gII、V、X 复制蛋白： 、 、 • 形态发生蛋白：gI、IV、XI 形态发生蛋白： 、 、 • 结构蛋白：gIII、VI、VII、VIII、IX 结构蛋白： 、 、 、 、 • 基因间排列紧凑、非编码的间隔区往往只有几个碱基、 基因间排列紧凑、非编码的间隔区往往只有几个碱基、 最大的508bp位于 和IV间，含有很多的调控元件。 位于II和 间 含有很多的调控元件。 最大的 位于
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λ噬菌体载体的类型 两种类型： 两种类型： 可被外源 置换λ噬菌体非必需区的 置换 ①置换型 可被外源DNA置换 噬菌体非必需区的
replacement
载体。 载体。 两侧有一对限制性酶切位点的载体。 两侧有一对限制性酶切位点的载体。
②插入型 insertion
含一个限制性位点可供插入外源DNA的载 的载 含一个限制性位点可供插入外源 这类λ噬菌体载体称插入型载体 噬菌体载体称插入型载体。 体，这类 噬菌体载体称插入型载体。 非必需区已经去除。 非必需区已经去除。
7
溶原化和裂解平衡关键是CI和 之间的对抗： 溶原化和裂解平衡关键是 和Cro之间的对抗： 之间的对抗 发生转换的关键是CⅡ 发生转换的关键是 Ⅱ。 若CⅡ是有活性的，通过 启动子有效地合成阻遏 Ⅱ是有活性的，通过Pre启动子有效地合成阻遏 结果CI占据操纵基因 占据操纵基因OL和 启动溶原。 物CI ，结果 占据操纵基因 和OR ，启动溶原。 不能合成， 若CⅡ无活性，阻遏物 不能合成，Cro就结合于操 Ⅱ无活性，阻遏物CI不能合成 就结合于操 纵基因OR 上，启动裂解。 启动裂解。 纵基因
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
第三章 分子克隆的载体
3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 有合适的选择标记，易于筛选。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
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一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
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✓ 筛选标记基因 主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外
源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通 过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重 组质粒。
α-互补 插入失活
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α-互补
α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变
体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体 之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
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38
2）pUC18/19质粒载体
• 来自pBR322 • 拷贝数 2000 - 3000 / cell • 装有多克隆位点（MCS）
第三章 分子克隆载体(Molecular cloning vectors)
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）［本章摘要］将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI 基因失活以及Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有：λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell 载体等。
常见的置换型载体有：EMBL3/4 及其类似载体，λgem-11 载体。
粘粒是带有cos 序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有：pJB8、pcos1EMBL 以及卡隆9 载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难，注意用对应的方法解决。
M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA 。
常见的M13 噬菌体载体有M13mp18/19 ，其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07 辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
Y AC 是基于酵母染色体生物学性质构建的载体，BAC 是基于 F 质粒的生物学性质构建的载体，PAC 是基于P1 噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合位点等。
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穿梭载体
E.coli
E.coli
酵母细胞 哺乳类
细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环精状品课件
≈300 kb 100 - 2000 kb 100 - 2000 kb
＞1000 kb
举例 pUC18/19 , T-载体
pGEM- 3z等 EMBL系列，
λ gt系列 M13mp系列
在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现 象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功 能之间的相互干扰造成的。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存 于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时， 在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异 最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
精品课件
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✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
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质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（（open circular DNA,
ocDNA） L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA）
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
PCYPAC1
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV,
Ti质粒
9
第一节 质粒（plasmid）载体
精品课件
10
一、质粒的基本特征
1.质粒的基本概念
质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复 制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）
作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator） 选择性记号 克隆位点
精品课件
14
L OC
SC
精品课件
15
2.质粒的基本特征
1）质粒的自主复制性
• 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制
• 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应 关系
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
第三章 分子克隆的载体
• 载体的功能及特征 • 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
精品课件
1
➢载体的功能及特征
载体的定义
将外源DNA或基因携带入宿主细胞的 工具称为载体(vector)
精品课件
2
载体的功能
• 运送外源基因高效转入受体细胞 • 为外源基因提供复制能力或整合能力 • 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlently closed circle DNA, cccDNA) ,少数 为大线小性为1-200kb，也有更大 常见于原核细菌和真菌中
精品课件
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一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
组成的特含有基因组DNA（即某一生物的全部 DNA序列）的不同课件
6
载体的分类
功能
克隆载体:克隆一个基因或DNA片段 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体 组中
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid
• 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
精品课件
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2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般 具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不 相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。
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A
B
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3）质粒的可转移性transferring
在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合 （conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。
E.coli
环状
35- 45kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
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载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
有合适的选择标记，易于筛选。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
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基因克隆
利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因 克隆(gene clone)
克隆(clone)
动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体
或细胞群体的过程。
名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群
体所
遗传上同一的DNA分子、细胞或个
要素：移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
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4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基 因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加性 状，包括：
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来源： 质粒载体plasmid 噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid 真核细胞克隆载体
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载体的种类和特征
载体种类 质粒* λ噬菌体
丝状噬菌体及噬菌粒
受体细胞 E.coli E.coli E.coli
结构 环状 线状 环状
插入片断 ＜8*
9 - 24kb
＜10 kb
粘粒载体