第三章植物基因克隆的载体
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基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
第三章 克隆载体的特征及类型
质粒
质粒DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA RNAs ocDNA L-DNA proteins
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z： 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达
ori Apr
pGEM-3E 2743 bp lacZ’
PT7
MCS
PSP6
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II
3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop
（+） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒
质粒DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法
质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
沸水浴法
质粒DNA纯度底、快速、操作简便
碱溶法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
基因工程-载体
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
基因克隆的载体系统
4.1.2.4 影响质粒DNA产量的因素 （1）寄主菌株的遗传背景 （2）质粒的拷贝数及分子大小 （3）实验操作误差
4.1.3 质粒载体的构建及类型 4.1.3.1 天然质粒的局限性 天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分子 量、拷贝数等等很多方面不能满足基因克隆的要求，所以绝 大部分质粒载体是在天然质粒的基础上根据基因工程的需要 而改造而来的。 4.1.3.2 质粒载体必备的条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因（理想情况下2种抗性基因） 3、具有若干个限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数
① 来自pBR322的复制起点；
② 无限制位点的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）；
③ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码 α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；
④ 位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段MCS位点（并不 破坏lacZ′基因的功能）
pUC18 及 pUC19 质粒载体的多克隆位点（MCS）
pSC101应 用实例1： 金黄色葡 萄球菌的 Ampr 基 因插入 pSC101 质粒
pSC101应用实例2：
应用pSC101质粒作载体在大肠杆菌细胞中 克隆非洲爪蟾的rDNA基因片段
4.1.4.2 pBR322 pBR322 质粒由3个不同来源的部分组成：第一部分来源 于pSF2124质粒易位与Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）； 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第 三部分来源于CoLEI的派生质粒pMB1的DNA复制起点。
§4 基因克隆的载体系统
4.1 质粒（plasmid）载体
大肠杆菌主要的天然质粒类型： ① F 质粒：致育因子或性因子 ② R 质粒：抗药性因子 ③ Col 质粒：产生大肠杆菌素因子 基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人 工改造而成的。质粒载体是重组DNA研究中最常用的也是最 重要的基因克隆载体。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
第三章 基因克隆载体
第三章 基因克隆载体
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
基因克隆载体
克隆载体的DNA分子必须具备的条 件
作为载体应该具备以下基本条件： 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点，较高的遗传稳定性; 3.具有较小的分子量，易于操作，具有较高的外源 DNA的载装能力 4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点； 5.外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自 我复制;
低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有1-3份拷 贝
松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid
高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-60 份拷贝
质粒复制控制的分子模型
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制 机理的分子模型有两种：
其一是抑制蛋白质稀释模型(inhibitor dilutionmodel)。
(2)自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外 一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋 白质模型,这个模型对质粒DNA复制控制机 理的一种解释是，质粒DNA的复制是由一 种叫做起始蛋白质Rep引发的。这种蛋白 质是质粒DNA复制启动作用的限速因子， 它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒 分子的最终复制总数。
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合 型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带 有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一 套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。
从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗 透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低， 以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类 的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞 的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼 接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机 率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级.
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
基因工程第三章克隆载体
7/31
*
λ 噬菌体的侵染
8/31
*
（1）切去λDNA的中央片段
BamHI sites
Left arm
Right arm
COS
COS
BamHI
COS
COS
L
R
COS
COS
L
R
回收
9/31
*
1.2、λ噬菌体载体的构建
10/31
插入标记基因（marker gene） 例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色.
添加标题
01
GFP gene
添加标题
02
Multiple cloning sites
添加标题
03
AMP
添加标题
04
r
添加标题
05
26/31
添加标题
06
*
二、诱导型表达载体：
启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。 外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。 优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。
*
1/31
第二节 病毒载体 virus vector
噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期
2/31
天然的转基因过程
*
1. λ噬菌体克隆载体
λ 噬菌体（Bacteriophage lambda） 头部 尾部 尾丝 3/31
*
1.1、λ 噬菌体的性质
线状，双链DNA， 48502bp
cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。
1
定位整合效率
2
19/31
3
*
第四节 YAC克隆载体
*
λ 噬菌体的侵染
8/31
*
（1）切去λDNA的中央片段
BamHI sites
Left arm
Right arm
COS
COS
BamHI
COS
COS
L
R
COS
COS
L
R
回收
9/31
*
1.2、λ噬菌体载体的构建
10/31
插入标记基因（marker gene） 例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色.
添加标题
01
GFP gene
添加标题
02
Multiple cloning sites
添加标题
03
AMP
添加标题
04
r
添加标题
05
26/31
添加标题
06
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二、诱导型表达载体：
启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。 外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。 优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。
*
1/31
第二节 病毒载体 virus vector
噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期
2/31
天然的转基因过程
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1. λ噬菌体克隆载体
λ 噬菌体（Bacteriophage lambda） 头部 尾部 尾丝 3/31
*
1.1、λ 噬菌体的性质
线状，双链DNA， 48502bp
cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。
1
定位整合效率
2
19/31
3
*
第四节 YAC克隆载体
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第三章植物基因克隆的载体
命名举例
• pBR322是最早构建的质粒之一 • “p”表明它是一个质粒 • “BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：
Bolivar和Rodriguez • “322”区别于该实验室构建的其他质粒，如
pBR325、pBR327等
第三章植物基因克隆的载体
三、质粒的基本特性
第三章植物基因克隆的载体
（二）质粒的命名原则
➢质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转 移性或亲和性差异划分为不同的类型。 ➢最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特 征自行命名，如F因子(fertility factor，致育因子)、 R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒 (colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。
第三章 基因克隆载体 Vectors
第三章植物基因克隆的载体
一、载体的概念
载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或 DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA 分子。 作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内 进行复制和表达的核酸分子。
第三章植物基因克隆的载体
二、载体的功能
1、 运送外源基因高效转入受体细胞； 2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
第三章植物基因克隆的载体
三、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克 隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
第三章植物基因克隆的载体
四、分类
按载体性质分
质粒载体、噬菌体载体和人工染色体
目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大 类：
一是病毒载体系统 二是质粒载体系统
➢随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质 粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏 统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。
第三章植物基因克隆的载体
（二）质粒的命名原则
➢直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者 普遍接受和遵循的命名原则。
➢其规则是： ➢质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第 一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可 以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他 特征的英文缩写。 ➢编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不 同质粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。
3、质粒的存在形式
• 生理条件下：以共价闭合环状DNA分子(Covalent close circular, ccc-DNA)形式存在
体外理化因子作用下可形成下列形式 开环DNA分子(oc-DNA) • 线性DNA分子(l-DNA) • 超螺旋DNA分子(scDNA)
• 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子 （ss-DNA）。
第三章植物基因克隆的载体
二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒， 且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的 范围。 ➢70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己 被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很 多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能 分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。
第三章植物基因克隆的载体
（4）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子 量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。
第三章植物基因克隆的载体
三、质粒的基本特性
（5）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
一、质粒(plasmid)
独立于细菌染色体外的 能独立复制的双链闭合 环状DNA分子
• 细菌中发现，偶见于 链霉菌和酵母
• 比病毒还简单的亚细 胞结构，一旦离开寄 主细胞则无法繁殖第三。章植物基因克隆的载体
大肠杆菌的质粒
第三章植物基因克隆的载体
二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢1946年，第一个被发现的细菌质粒是大肠杆菌 的F因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深 远的影响。 ➢1957年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中 质粒介导抗生素抗性的转移现象。
第三章植物基因克隆的载体
（6）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相 容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（7）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制 严谨型复制
第三章植物基因克隆的载体
（8）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过细菌 接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一 种宿主内。
第三章植物基因克隆的载体
五、基因工程载体必须具备的条件
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
第三章植物基因克隆的载体
第一节 质粒载体
（1）质粒分子较小
一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜 蓿根瘤菌质粒pRm141a)。
（2）编码特性——表型多样化如抗生素的抗性、产生抗Fra bibliotek素、降解复杂有机
化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、
合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫
等。
第三章植物基因克隆的载体
三、 质粒的基本特性
非结合细菌可通过人工方法进行转化
第三章植物基因克隆的载体
四、质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居” 在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，
宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。
命名举例
• pBR322是最早构建的质粒之一 • “p”表明它是一个质粒 • “BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：
Bolivar和Rodriguez • “322”区别于该实验室构建的其他质粒，如
pBR325、pBR327等
第三章植物基因克隆的载体
三、质粒的基本特性
第三章植物基因克隆的载体
（二）质粒的命名原则
➢质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转 移性或亲和性差异划分为不同的类型。 ➢最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特 征自行命名，如F因子(fertility factor，致育因子)、 R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒 (colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。
第三章 基因克隆载体 Vectors
第三章植物基因克隆的载体
一、载体的概念
载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或 DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA 分子。 作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内 进行复制和表达的核酸分子。
第三章植物基因克隆的载体
二、载体的功能
1、 运送外源基因高效转入受体细胞； 2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
第三章植物基因克隆的载体
三、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克 隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
第三章植物基因克隆的载体
四、分类
按载体性质分
质粒载体、噬菌体载体和人工染色体
目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大 类：
一是病毒载体系统 二是质粒载体系统
➢随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质 粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏 统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。
第三章植物基因克隆的载体
（二）质粒的命名原则
➢直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者 普遍接受和遵循的命名原则。
➢其规则是： ➢质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第 一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可 以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他 特征的英文缩写。 ➢编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不 同质粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。
3、质粒的存在形式
• 生理条件下：以共价闭合环状DNA分子(Covalent close circular, ccc-DNA)形式存在
体外理化因子作用下可形成下列形式 开环DNA分子(oc-DNA) • 线性DNA分子(l-DNA) • 超螺旋DNA分子(scDNA)
• 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子 （ss-DNA）。
第三章植物基因克隆的载体
二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒， 且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的 范围。 ➢70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己 被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很 多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能 分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。
第三章植物基因克隆的载体
（4）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子 量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。
第三章植物基因克隆的载体
三、质粒的基本特性
（5）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
一、质粒(plasmid)
独立于细菌染色体外的 能独立复制的双链闭合 环状DNA分子
• 细菌中发现，偶见于 链霉菌和酵母
• 比病毒还简单的亚细 胞结构，一旦离开寄 主细胞则无法繁殖第三。章植物基因克隆的载体
大肠杆菌的质粒
第三章植物基因克隆的载体
二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢1946年，第一个被发现的细菌质粒是大肠杆菌 的F因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深 远的影响。 ➢1957年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中 质粒介导抗生素抗性的转移现象。
第三章植物基因克隆的载体
（6）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相 容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（7）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制 严谨型复制
第三章植物基因克隆的载体
（8）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过细菌 接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一 种宿主内。
第三章植物基因克隆的载体
五、基因工程载体必须具备的条件
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
第三章植物基因克隆的载体
第一节 质粒载体
（1）质粒分子较小
一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜 蓿根瘤菌质粒pRm141a)。
（2）编码特性——表型多样化如抗生素的抗性、产生抗Fra bibliotek素、降解复杂有机
化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、
合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫
等。
第三章植物基因克隆的载体
三、 质粒的基本特性
非结合细菌可通过人工方法进行转化
第三章植物基因克隆的载体
四、质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居” 在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，
宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。