胶原矿化机理

胶原、磷灰石自装配以及模拟ECF

我们建立模型：透析过程伴随持续的胶原注入模拟细胞分泌胶原纤维生成过程。低浓度胶原酸溶液（1mg/ml）注入组织I型胶原分子的透析袋，反向透析使用浓缩的高分子PEG（300mg/ml）设置为胶原基质的最终高浓度。因为在骨组织中，钙、磷、碳酸根离子来源于ECF并且持续渗透到生物组织中，矿化过程是持续的注入碳酸磷灰石离子前体以及胶原分子来实现的。由于这个原因，最初的酸化胶原溶液和PEG聚合物溶液补充钙、磷、碳酸根离子。体外组成Ca/P摩尔比为3.3，同时碳酸根浓度为3.33mM 更倾向于骨组织中B型CHA。碳酸根替代用变换红外光谱进行检测。在整个的过程中保持接近生理状态的离子浓度。中和:用氨蒸汽中和使得胶原分子沉积到纤维和碳酸羟基磷灰石之间。在酶对照组，通过化学方法控制Ph值获得胶原纤维的三螺旋结构，但是不能获得高浓度的纤维。胶原分子和磷酸钙盐的共沉淀可以使得基质有较低的矿化程度。为增加矿化程度，基质被保存在生理温度并且在模拟体液中进行搅拌并且不断补充。这样的条件下，我们称之为“动态”。在纤维生成的过程之中和之前，介质中的矿物离子模仿骨组织中的循环体液。虽然这样的ECF仍然对于多种生理功能和生化反应是有争议的，但到现在为止在文献被提及还是获得了应有的关注。

骨内胶原的基本特征

对Coll/CHA 基质进行TEM观察。在高浓度的胶原溶液中获得的

基质可以观察到染色的细段嵌在基质中，纤维以螺旋状的结构进行装配，这主要是由于胶原纤维持续的扭转导致，这类似于人脱钙的致密骨中骨单位的超微结构。相反，从稀释的胶原溶液（5mg/ml）提取的基质表现出随机的胶原纤维的导向。调整胶原分子的注入率，控制溶液的粘弹性和胶原分子的自装配动力学。这个参数形成致密的同源单径分散纤维的基质，有或者没有矿物质，这是生物组织的主要特征，和之前的关于逐渐递增的胶原浓度基质的研究相比较也是显著的结构特征。横纹纤维的出现也表明在COLL/CHA基质中体外纤维生成可以被成功的诱导，但是由于染色沉淀和可能的低矿物成分，晶体很难观察到。在TEM 观察的基础上，我们展示了骨、低浓度、高浓度胶原基质的纤维网状结构的图解，这使得从3D角度看胶原纤维的组成和致密度更加形象。在过程中，对易溶的胶原溶液不进行压缩和提取，提示最终的各向异性主要取决于实验条件下高浓度蛋白介导的固有的胶原特性，使得整个过程容易被复制。最终的胶原浓度由脯氨酸滴定定量检测。高胶原浓度最终结果是半个胆固醇高度约2-3um，与成年人股骨致密骨接近。可以设想骨组织中胶原的粘弹性更接近于高浓度基质而不是低浓度基质。

骨内矿化物的基本特征

广角X线衍射：研究2年龄绵羊水化骨以及水化Coll/CHA、Coll/CHA/SBF 基质。合成的胶原基质中缺乏Ca2+,PO43- CO32- ，表现出经典的沉淀胶原衍射图像。两种矿化基质表现出HA衍射特

征峰和融合峰。骨和Coll/CHA/SBF 基质的X线衍射表现出相似的模式，宽峰的属性是小晶粒或者磷酸盐的碳酸盐结构替代物。数据。

致密度的差别和矿化程度的相对差别是一致的。尽管基质中的有机无机物比很低（5%），矿物成分的量接近于浸泡于SBF中成熟骨组织。

为了支持X线衍射的结果，对基质中嵌合的细段进行进一步TEM 观察。对骨组织中的晶体组成进行TEM观察是受到限制的由于细段预备的困难以及染色的伪影。对未染色的样本进行TEM观察，由于染色颗粒和磷灰石有时难以区别。不染色也是能观察到磷灰石晶体的，因为磷灰石晶体是有电子密度的。低矿物成分的基质的TEM图像表现出相对于纤维主轴，小磷灰石晶体的侧向以及轴向排列。侧向装配的晶体径向穿过胶原纤维，类似于纤维内矿化的早期阶段；连续的磷灰石晶体沉积于胶原分子的分子间间隙以及胶原纤维的纤维间间隙阐明了钙化的后期阶段。在体外的纤维内矿物的形成可能是胶原内部或者外部或者胶原表面的成核位点。Coll/CHA/SBF的整个的超微结构表明由于高浓度的矿物成分，使得能够观察到纤维内以及纤维间间隙内的矿物。纤维是以多种模式进行排列的,表现为平行排列非定向结构。在纤维形成前，前体酸溶液表现出胆固醇局部排列以及胶原分子的各向同性区域。这些区域同样存在于基质中，与天然的骨组织的异质形态类似。考虑到胶原与磷灰石间的结构关系，晶体似乎与纤维

胶原网络相匹配排列。例如在圆弧模式中，从胶原与截面平行排列的区域获得的电子衍射图像显示磷灰石晶体优先与胶原纤维主轴相匹配沿主轴排列，这种模式与成熟绵羊骨观察到的结果类似，尽管是新形成的矿物相。在Coll/CHA/SBF基质中的胶原纤维的矿化的异质性已经被低温透射电镜观察所证实。虽然没有染色但是带的模式仍然很容易被观察到，提示出晶体主要位于胶原的缺口区域。然而在某些部分，很难看到带状结构。单纤维可以表现出这种异质性。纤维带状模式的消失反映出纤维矿化的程度的低、中、高。像之前所描述的，因为在图片3e中没有观察到横纹结构，可能矿物质占据了整个胶原纤维。然而我们的模型中不需要溶液中存在能与钙结合的聚合物（聚天冬氨酸）去达到纤维内矿化以及产生胶原/磷灰石共排列。由于在介质中没有有机添加物，胶原调节晶体生长的程度。低温透射电镜观察表明磷灰石晶体与胶原基质分离，这可能是样品预备的结果。CHA颗粒边缘不规则似乎更小一些比起那些缺乏致密胶原网络。总之，相关结果表明纤维胶原网络的3D结构控制磷灰石晶体的空间分布。胶原的致密度和3D组成，包括分子水平和纤维水平，是体外形成合适的骨磷灰石矿化的关键参数。

磷灰石的水化以及局部环境：

为了支持X线衍射数据，对基质中细纹的进行进一步的TEM观察。为了防止羟基磷灰石和染色颗粒难以分辨，观察未染色样本。为了回答胶原是否在替换物以及晶粒上影响矿化结构，采用

1H ，31P的魔角旋转固体核磁共振技术( MAS NMR)。图四显示水化的Coll/CHA/SBF基质、新鲜绵羊骨、以及过程相同但是缺乏有机基质的CHA沉淀的大量的31P MAS NMR光谱。对新鲜骨的核磁共振的研究在提取后的2小时内进行，不作任何处理，以防止由于化学预处理造成的样品改变。单不对称谐振大约3ppm，每个样本中检测到羟基磷灰石中磷酸根离子的特征。就化学位移以及线宽度来讲，混合基质和新鲜骨的31P MAS光谱相似，然而同等条件下的纯CHA沉淀物的31P MAS光谱表现出2.28PPM的共振轻度遮蔽，与锐利的线宽相关。线宽的不同与化学位移的宽分布造成的，要么由于高度的原子异常，要么由于磷灰石相中高度的离子替换。这个结果更加强调了矿物相中致密有机基质的影响。

为检测矿物相，采用2D核磁共振波谱技术检测Coll/CHA/SBF基质以及新鲜骨，记录到1H和31P核仁通过异相核双极相互作用呈现空间相关性。我们也证明了两个样本的相似的光谱特征。尤其，我们可以从羟基磷灰石和羟基阴离子中分辨出磷酸根位点的相关峰。与XRD观察的结果一致，我们没有观察到描述为HA的过渡前体相以及污染相。而且，观察到两份样本的在4.85ppm的磷酸根共振以及质子共振呈现紧密关联峰，根据它的化学位移是与水对应的。由于HetCor实验基于交互极化实验，后面的信号不能与游离水对应，而与刚性分子如在晶体表面的结合水。之前的研究表明部分脱水而呈现低强度特征峰的牛科动物皮质骨中