01-申建波-田间作物根际过程定量化

（Alvey et al., 2003 ）
酸性磷酸酶 30℃ pH5.2
根部原位磷酸酶荧光定位
采用具有蓝色荧光的底物ELF-97探针，该底物在磷酸酶的作用下，发生水解 反应，形成附着于磷酸酶上的绿色荧光沉淀，从而原位检测磷酸酶。
用相应pH的缓冲液（过0.22μm滤膜）稀释ELF-97底物溶液20倍, 漩涡混合几 秒后，通过0.22μm水系滤器。太高的浓度会导致标记过量，太低的浓度由于 延长的反应时间，从而导致过量的背景染液标记。 切取0.5-1.0cm长的根段，冲洗3次，放 入已稀释好的底物溶液中标记1min，取 出，用清洗缓冲液（pH8.0 30mM Tris， 1.5M NaCl，0.05% w/v Triton X-100） 冲洗3次，放于载玻片上，加载装载介质 （ELF-97 Endogenous Phosphatase Detection Kit提供）放样品于载玻片上， 盖上盖玻片，用荧光显微镜观察拍照， 最大激发波长设在345 nm，最大发射波 长设在530 nm。 （Tang et al., 2013, J. Plant Phyiol.）
可将生物体内所有 20中α氨基酸进行分 离。
根际磷酸酶活性测定
磷酸酶可以将对硝基苯磷酸二钠（pNPP）的磷酸基团脱去，生成对硝基酚（ PNP），此物在碱性环境中显黄色，在酸性环境不显色，而pNPP在酸碱性环 境中均不显色。可将反应后的溶液在405nm波长下显色，通过定义反应生成 PNP的量从而定义酸性磷酸酶的相对活性。 试验过程是将0.5 mL涮根法收集的土壤悬浊液加入2mL的离心管中，加入0.4 mL pH=5.2醋酸钠缓冲液和0.1 mL 150mM pNPP溶液，放入30℃的恒温箱内 培养60min。反应结束时用0.5mL 0.5M的NaOH终止反应。离心后在405nm的 波长下比色。 将缓冲液换成pH 7.8的 0.1 M Trizma（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液可测定碱 性磷酸酶的活性
根 根际
(Hinsinger et al., 2009; Shen, unpublished)
根际（Rhizosphere）是指受植物 根系生长影响，在物理、化学和生 物特性上不同于原土体的土壤微域， 是植物-土壤-微生物三者相互作用 的场所，也是各种养分、水分和有 益或有害物质进入根系参与食物链 物质循环的门户，是一个特殊的生 态系统。
根际强度 根际互作
间套作
根系特性、根系长度 菌根菌 分泌物种类、浓度 养分组成与数量
土壤
APase
H+
H+ R-COOH H+ 水分、养分
关键根际过程:
•根系生长 •酸碱反应 •氧化还原反应 •养分的富集与亏缺 •根分泌物 •固氮菌、解磷钾菌 •菌根（VAM、EMA） •病原微生物 •促生菌(PGPR) •根际微生物分泌物
田间测定根际pH的演示
(Jing et al., 2010, 2012)
质外体pH荧光定位显色
利用共聚焦显微镜与荧光指示剂原位定位指示根际的质外体pH值 将需要测定的处理好的根系放入含有0.05mM Cl-NERF-dextran 和 0.04 mM Texas Red-dextran的固定液中，固定染色30s后，用载玻片装载后在 共聚焦显微镜下观察。 Cl-NERF和TexasRed 分别在488 nm和568 nm 的krypton-argonlaser lines （氪氩激光）下激发，散射光在525 nm (Cl-NERF) 和585 nm (Texas Red) 在采集。 (Yu et al., 2001; Tang in preparation)
Oxygen pattern structured porous media (mg/l)
第一届全国高产高效现代农业理论与技术培训班
田间作物根际过程定量化
申建波 (jbshen@)
中国农业大学资源环境与粮食安全中心
2013年7月15日
主要内容
根际的意义及作用 根际过程的类型
根际过程定量化方法
因素
研究方法依赖于目的 研究的尺度/因素/问题
确定最重要因素，田块 尺度以2-3个为宜，不超 过3个因素；否则需筛选 试验。 尺度越小，问题就越需 要Sharp and Focus, 最好 把一个因素的不同水平 效应和作用机制揭示出 来。
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天（灌水）
(Carminati et al., 2010)
根际氧气浓度原位监测
利用根盒进行原位监测
监测方法是能与O2发生反应的荧光染料和Neutron radiography（中子射线照 射术）结合给根盒拍照 荧光染料要附着在一层塑料的半透膜上厚度一般为10 μm，制作方法是将20 mg 的 platinum(II) 5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)porphyrin （一种铂的朴琳化合物）与1.98g的聚苯乙烯用18 g甲苯溶解，过夜后倒板定 型 t1 t2 t3 t4 10 t -t 随着反应时 1 2 间延长氧气减少 的量和区域扩大 t2-t4 随着土壤水 分的散失，到第 三天呼吸作用减 弱，消耗氧气量 减少 0
根际低分子量有机酸测定
酒石酸
将涮根法中的浸提液过0.45μm滤膜 或微量溶液提取器取到的溶液使用 液相色谱仪进行测定（Shen et al., 2003; Wang et al., 2007; Li et al., 2010; Tang et al., 2013）。 测定的体系条件是250 mm×4.6 mm C18反相柱（Alltima C-18 5 µ ）， 流动相为25 mmol/L KH2PO4（pH 2.25），流速为1 ml/min，温度为 31℃，测定波长为214 nm，进样量 为20 µL
根/土界面动态
根际过程的类型
水分变化
物理过程
团粒大小 气体变化（根系呼吸） pH（酸碱变化）
化学过程
Eh（氧化还原状况） 配合反应（螯合作用） 根系的形态学变化
生物学过程
根系的生理学过程 （根系分泌物） （根系分泌物） 根际共生生物 （固氮菌、菌根、微生物）
(Hinsinger et al., 2005)
自然生态系统中根系/根际过程对植物生长和养分吸收
的贡献达100%
热 带 雨 林
落 叶 阔 叶
针 叶 林
荒 漠
草地
高投入
3.环境健康 2.粮食安全
生态效应
1.资源利用
根际
养分和污染物
地下水
主要内容
根际的意义和作用 根际过程的类型
根际过程定量化方法
根际过程
根际调控 根际范围
根系形态－吸收面积 根际化学－分泌物 pH 根际生物－菌根菌
根际样品采集——根际溶液的收集方法（Micro-suction Cups）
密封胶
微量提取探头
取样点 微量提取探头（Micro-suction Cups）是一种直径很小（最小可到1 mm）的 带微孔的陶瓷探头。 可以利用微量提取探头结合根箱，根据作物根系生长的情况，将微量提取 探头直接插入到根际土壤附近，通过负压直接提取根际土壤溶液。 (Shen and Hoffland, 2007)
主要内容
根际的意义及作用 根际过程的类型
根际过程定量化方法
（Shangzhuang station, 2013）
根土界面
如何进行根际取样：同一发育阶段和部位
可获得参数：
1、侧根密度 2、侧根长度 3、根直径 4、根毛长度和密度 5、根际土测定
根际样品采集——根际土的收集方法
根际土的收集方法： 1、刷根法：用柔软的毛刷将根际土轻轻 的刷下来，收集后储存。 这种收集方法优点是保持的土壤物 理性质，特别是土壤中的养分浓度；缺 点是收集时间过长，土壤与根系长时间 暴露在空气中，土壤中有机物质变化较 大。 2、涮根法：将整个根系装入事先装有一 定体积的0.2 mmol L-1 CaCl2溶液的烧杯中 浸提，在浸提过程中轻轻将根系浸入溶 液并摇动，使尽可能多的根际土溶入浸 提液中。 这种收集方法的优点是收集时间短， 然后将土壤迅速保存在适宜的储存环境， 保持土壤中有机物质的量与活性；缺点 是如果根系损伤较严重，则受根系组织 液的影响较大。
方法
根际是什么？
根际（Rhizosphere）一词最先由德国科 学家Lorenz Hiltner在1904年提出， 用以 描述受豆科植物根系影响的土壤微域，在 这个微域内微生物的数量远远高于土体 （Hiltner, On new experiences and problems in the field of soil bacteriology with special reference to green manure and fallow, 1904）。
根分泌酸性磷酸酶的原位显色
把根系置于含有 p-NPP底物的琼 脂板中培养显色， 图像转为假彩色 (pseudo-colour).
（Tang et al., 2013, J. Plant Phyiol.）
根际水分原位监测
利用根盒进行原位监测
监测方法是用Neutron radiography（中子射线照射术）给根盒拍照 由于射线投射技术要求，根盒内土壤的厚度要小于1.5cm，土壤介质中的有 机质含量要尽量低，土壤的膨胀系数要在干与湿变化时极低。
根际氨基酸测定
利用抽取的根际溶液（反应也需要至少20μL）进行反应测定。 AccQ•Tag 法是Waters公司开发的一种氨基酸分类测定方法，使用 Waters AccQ•Tag Fluor 衍生剂（AQC ,即6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀 酰亚氨基酸基甲酸酯）能与所有含氨基的化合物发生快速、定量反应， 过量的AQC可在1 min内水解为不干扰测定的AMQ ，生成稳定的衍生 物，可在HPLC上使用AccQ•Tag 专用柱或其它性能较好的C18柱分离， 用萤光检测器或紫外检测器检测（Waters，1997）。