噬菌体抗体库技术演示课件
合集下载
噬菌体展示技术和其应用ppt课件
2024/3/30
25
应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
26
一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
17
M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
2024/3/30
18
T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
抗体噬菌体展示技术ppt课件
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
▪ Affibodies ▪ Anticalins ▪ DARPins ▪ Avimers ▪ Affimers ▪ Monobodies
Antibody Formats
10
▪ Multivalent fragments ✓ Miniantibodies are scFvs or Fabs connected via a flexible linker
▪ A number of starting material: proteins, peptides, haptens, cell
lines, tissue slides, or virus particles
Antibody Formats
7
▪ The most commonly used format: single-chain variable
exposed to an antigen.
✓ Useful in analyzing natural humoral responses, for
example, in patients with autoimmune disease, viral infection, neoplastic diseases, etc.
members) of functional antibodies to generate a larger repertoire of antibodies than those available through conventional hybridoma technology.
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
▪ Affibodies ▪ Anticalins ▪ DARPins ▪ Avimers ▪ Affimers ▪ Monobodies
Antibody Formats
10
▪ Multivalent fragments ✓ Miniantibodies are scFvs or Fabs connected via a flexible linker
▪ A number of starting material: proteins, peptides, haptens, cell
lines, tissue slides, or virus particles
Antibody Formats
7
▪ The most commonly used format: single-chain variable
exposed to an antigen.
✓ Useful in analyzing natural humoral responses, for
example, in patients with autoimmune disease, viral infection, neoplastic diseases, etc.
members) of functional antibodies to generate a larger repertoire of antibodies than those available through conventional hybridoma technology.
演示版抗体噬菌体展示技术.ppt
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介 ppt课件
35
融合蛋白的表达是低价的，只有不到10％的噬菌体可以表 达融合基因，其余噬菌体展示的均是野生型噬菌体的p3蛋PPT课件
36
淘筛—亲和淘筛
1.噬菌体肽库与靶分子相互作用
2.洗涤去未结合的或是非特异性结合 的噬菌体
3.将特异性结合的噬菌体洗脱下来
M13噬菌体遗传图谱和结构示意图
PPT课件
17
3.6.2次要衣壳蛋白PⅢ展示系统
次要衣壳蛋白PⅢ
PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位 于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染 大肠杆菌所必须的。每个病毒颗粒 都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结 构上可分为N1、N2和CT 3个功能区 域，这3个功能区域由两段富含甘氨 酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1 和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及 穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体 外壳蛋白结构的一部分，并将整个 PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体 的一端。
PPT课件
18
PⅢ展示系统，PⅢ有2个位点可供外源序列插入， 当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ) 和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体 仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的 CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌 体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。 PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌 体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融 合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
PPT课件
12
3.3 噬菌体侵染大肠杆菌
PPT课件
13
3.4 λ噬菌体展示系统
（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有
两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或 替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白 质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表 明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变 型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况 下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源 多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融 合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于 展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
《噬菌体展示技术》课件
《噬菌体展示技术》
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互作用
• 洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱下来，并扩增， 用扩增产物进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
《噬菌体展示技术》
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
《噬菌体展示技术》
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，没有其他噬菌体
基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有 蛋白和酶。
《噬菌体展示技术》
噬菌体展示系统
Phage on display
《噬菌体展示技术》
1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
《噬菌体展示技术》
2
什么是噬菌体表面展示技术
抗体噬菌体展示技术ppt课件
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
DNA recombination and gene manipulation; multiple cloning sites (MCS)
▪ Coat protein: PIII (larger protein, less than 5 copies,)
PVIII (more than 5 copies, decreased length)
Introduction of Phage Display Technology
The Ff bacteriophage structure
Introduction of Phage Display Technology
The scheme of phagemid vector
▪ IG region: intergenic region, usually contains the
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
DNA recombination and gene manipulation; multiple cloning sites (MCS)
▪ Coat protein: PIII (larger protein, less than 5 copies,)
PVIII (more than 5 copies, decreased length)
Introduction of Phage Display Technology
The Ff bacteriophage structure
Introduction of Phage Display Technology
The scheme of phagemid vector
▪ IG region: intergenic region, usually contains the
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
噬菌体展示技术的原理及应用ppt课件
完整版ppt课件
32
5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等
完整版ppt课件
33
6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
完整版ppt课件
34
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，
如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与
2
噬菌体展示技术是将
各种多肽或蛋白质以融合
蛋白的形式表达并展示在
噬菌体表面，同时将其遗
传密码包含于噬菌体内部，
这使得蛋白质的功能与其
基因密码有机的连结在一
起。
完整版ppt课件
3
选择方法： 淘选（Panning)
而不是 筛选（Screening)
完整版ppt课件
4
非展示系统
展示系统
完整版ppt课件
应用前景:
单克隆抗体 杂交瘤技术
杂交瘤 ~103 几个月 繁杂
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简
必须
高 有限 再克隆
完整版ppt课件
有限
可避免
+ 低 无限 直接
28
不可估
二、噬菌体展示技术的应用现状
1. 抗体：
2.
抗狂犬病毒的单链抗体，
抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，
此抗体可专一性杀死被HIV-1感染
完整版ppt课件
13
•
•
• 毒）
• 表面展示系统 • • •
抗体噬菌体展示技术(课堂PPT)
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
抗体噬菌体展示技术PPT
often used for phage display, primarily the M13 and Fd strains.
▪ Proteins to be selected are infused to all
five coat proteins, with pIII and pVIII most commonly used.
1
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Proteins to be selected are infused to all
five coat proteins, with pIII and pVIII most commonly used.
1
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.