酿酒酵母性别转换的过程和模型
真核生物的基因表达调控
转录因子得结构
绝大多数转录因子至少具有以下三种不同得结构域得 一种: (1)DNA结合结构域,直接与顺式作用元件结合得转录因子 都具有此结构域。转录因子通常使用此结构域之中得 特殊α-螺旋与顺式作用元件内得大沟接触,通过螺旋上 得特殊氨基酸残基得侧链基团与大沟中得特殊碱基对 之间得次级健(主要就是氢键)相互识别而产生特异性。 许多转录因子在此结构域上富含碱性氨基酸,这可能有 利于她和DNA骨架上带负电荷得磷酸根发生作用; (2)效应器结构域,这就是转录因子调节转录效率(激活或阻 遏)、产生效应得结构域; (3)多聚化结构域,此结构域得存在使得转录因子之间能够 组装成二聚体或多聚体(同源或异源)。下面将集中介绍 前两种结构域,特别就是DNA结合结构域。
在转录水平上得基因表达调控
真核生物得蛋白质基因得转录除了启动子、RNA聚合酶II和基础 转录因子以外,还需要其她顺式作用元件和反式作用因子得参与。 参与基因表达调控得主要顺式作用元件有:增强子、沉默子、绝缘 子和各种反应元件;参与基因表达调控得反式作用因子也称为转录 因子,她们包括激活蛋白、辅激活蛋白、阻遏蛋白和辅阻遏蛋白。 激活蛋白与增强子结合激活基因得表达,而阻遏蛋白与沉默子结合, 抑制基因得表达,某些转录因子既可以作为激活蛋白也可以作为阻 遏蛋白其作用,究竟就是起何种作用取决于被调节得基因。辅激活 蛋白缺乏DNA结合位点,但她们能够通过蛋白质与蛋白质得相互作 用而行使功能,作用方式包括:招募其她转录因子和携带修饰酶(如 激酶或乙酰基转移酶)到转录复合物而刺激激活蛋白得活性;辅阻 遏蛋白也缺乏DNA结合位点,但同样通过蛋白质与蛋白质得相互作 用而起作用,作用机理包括:掩盖激活蛋白得激活位点、作为负别构 效应物和携带去修饰酶去中和修饰酶(如磷酸酶或组蛋白去乙酰基 酶)得活性。
酿酒酵母的遗传学和分子生物学
酿酒酵母的遗传学和分子生物学酿酒酵母，即啤酒酵母，是一种用于酿制啤酒、葡萄酒、烈酒等酒类的微生物。
其细胞大小约为 5-10 微米，单细胞体积大约是压缩奶油的十倍。
在酒类的制作过程中，酿酒酵母会通过发酵将糖类转化成酒精，还能产生引人入胜的风味和气味。
因此，酿酒酵母是和酿造工艺一样重要的组成部分，对于制作高品质的酒类有着至关重要的作用。
酿酒酵母的遗传学和分子生物学是研究酵母发育、代谢、遗传变异等方面的学科。
在这个领域的研究者们潜心探索着酿酒酵母的生物学机制，以更好地了解酿酒酵母的种类和特征，并进一步改良酵母，提升其性能，以生产更加出色的葡萄酒、啤酒及其他酒精饮品。
酿酒酵母的基因组酿酒酵母的基因组大小为 12 Mb，共有 16 条染色体。
在 1980年代初期，基因测序技术得到急速的发展，使得研究者们可以通过快速、高效的方式获得酿酒酵母的整个基因组序列信息。
自此，遗传学和分子生物学领域的研究在酿酒酵母上得到了广泛开展。
酿酒酵母分子遗传酿酒酵母不同于动植物，其细胞有两种状态：有性和无性。
酿酒酵母有两个性别，分别为雄性和雌性，它的有性生殖主要通过雌雄交配进行，其无性繁殖则通过分裂方式实现。
酿酒酵母的基因体系也与其它真菌不同，首先，虽然酿酒酵母的基因数并不多，但其负责基因转录的RNA聚合酶数量却有之多。
其次，酿酒酵母基因编码中90%以上的编码区宁静3个核苷酸呈现出非常强的保守性，这就意味着不同的进化压力会引起基因启动子、基因间区域以及非编码RNA区域的巨大差异。
鉴于此，基因调控和基因结构研究成为分子遗传学的重要部分。
酿酒酵母基因的复制和表达DNA复制及细胞周期相关基因是其中一个研究的方向。
酿酒酵母基于调节因子的复制信号，在复制起始点启动复制，然后发生双链断裂，而后在起始点就地造成新的复制部分，在复制起始点分裂后继续对整个基因组进行复制。
酿酒酵母还可以调节经典试验中典型的细胞周期。
非常引人注目的是，细胞周期的控制区域Cdc28本身是一种酵母菌蛋白激酶，调节G1期到S期进程中需要大量的因子。
酿酒酵母不对称遗传分析(设计)
酿酒酵母不对称遗传分析生物科学10300700042 周博言周五下午108 注：这个实验设计我上传了百度文库，老师如果在百度发现和我这个一模一样的设计不要误会，那个就是我设计的，不是我抄袭。
原理在酵母细胞出芽过程中，细胞衰老造成的损伤在母细胞和子细胞之间的分配是不对称的，绝大部分损伤被母细胞所保留。
然而，这种不对称遗传也不总是这样，在母细胞衰老到达一定程度时，它所产生的子细胞将不可避免地带有母细胞的部分衰老物质。
酿酒酵母很早就被当做研究衰老的模式生物，早在1989年，Egilmez和Jazwinski就提出了“细胞质衰老因子”假说。
1997年，Sinclair等人提出了酵母复制衰老的ERC积累学说，认为染色体外rDNA环——ERC可能就是“细胞质衰老因子”。
酿酒酵母rDNA座占整个基因组的10%，由编码rRNA的9.1kb重复单元串联重复100~200个拷贝组成，定位于染色体ⅩⅡ。
ERC可以通过胞内DNA加工系统的作用，由串联重复的rDNA经同源重组从基因组中切出。
而ERC具有自身ARS（autonomously replicating sequence），能在每一次S期复制1次，而在母细胞内呈指数型增长。
同时由于酵母细胞出芽分裂的不对称遗传，ERC在分裂时保留在母细胞中而不进入子细胞，从而使母细胞中大量积累ERCs。
但随着母细胞持续地衰老，这种不对称遗传将无法维持下去，最终极度衰老的母细胞产生的子细胞中也将不可避免地带有ERCs。
本实验将通过培养酿酒酵母，分离检测ERCs，对比不同代数母细胞产生的子细胞及衰老母细胞中ERCs的含量，验证酿酒酵母的不对称遗传。
注：关于ERCs的不对称遗传的机制，Shcheprova等人提出了一种氯苄乙胺依赖的细胞核扩散屏障，它阻碍了母细胞核孔通向子细胞的通道。
而环形DNA分子，比如ERCs，缺乏一种着丝粒序列而无法通过该屏障，最终被留在了母细胞中。
尽管ERCs如何造成酵母细胞衰老的机制尚未明确，但很多假说已被提出。
酵母菌表面展示实验培养步骤
酵母菌表面展示实验培养步骤酵母菌表面展示实验是一种常见的生物学实验方法，用于研究酵母菌表面展示蛋白质的特性和功能。
通过表面展示，研究人员可以更好地理解蛋白质的结构、功能和相互作用，从而为疾病治疗和药物开发提供重要的信息。
以下是酵母菌表面展示实验的一般步骤：1.选择合适的酵母菌株：通常选择适合表面展示的酵母菌株，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或毕赤酵母（Pichia pastoris）。
对于不同的研究目的，可能会选择不同的酵母菌株。
2.构建表面展示载体：将目标蛋白质的编码基因插入表面展示载体中。
表面展示载体通常包括信号肽序列、连接子和表面展示结构域。
信号肽序列负责将蛋白质定向送达到酵母细胞内质网，连接子用于连接信号肽和表面展示结构域。
3.转化酵母细胞：将构建好的表面展示载体导入酵母细胞中。
常用的转化方法包括电击转化、化学转化或冷冻转化等。
转化后的细胞需要在含有合适选择性培养基的条件下进行筛选和培养。
4.诱导表面展示：在培养酵母细胞的过程中，通过添加适当的诱导剂或调整培养条件，使目标蛋白质表面展示。
这一步骤通常需要根据具体实验要求进行优化和调整。
5.采集表面展示蛋白质：培养一定时间后，通过离心等方法采集含有表面展示蛋白质的酵母细胞。
采集后的酵母细胞需要进行后续处理，如洗涤、裂解等。
6.分离和纯化表面展示蛋白质：通过适当的分离和纯化方法，将采集的酵母细胞中的表面展示蛋白质从其他细胞组分中分离出来。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
7.鉴定和分析表面展示蛋白质：使用适当的技术手段，如免疫印迹、质谱分析等，对纯化的表面展示蛋白质进行鉴定和分析。
这些方法可以确定蛋白质的分子量、结构和相互作用等特性。
需要注意的是，酵母菌表面展示实验是一个复杂的过程，每个步骤都需要仔细优化和调整。
实验者需要具备一定的实验技巧和相关知识，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，实验过程中也要注意实验室的安全操作规范，保证个人和实验室的安全。
酵母双杂交系统及其应用
酵母双杂交系统及其应用Yeast Two-hybrid System and Its Application1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性（1）单细胞真核生物尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。
（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；1996年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。
大约有6000个基因。
目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。
其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。
（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。
（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。
单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。
有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。
在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。
在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。
但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。
一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.[植]囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。
n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长酿酒酵母生活周期2 酵母双杂交系统的原理蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。
酵母菌表面展示操作步骤概述
酵母菌表面展示操作步骤概述酵母菌表面展示是一种生物学研究和应用领域常用的技术，它通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，使其易于高效地表达、分离和纯化。
本文将对酵母菌表面展示的操作步骤进行概述，以帮助读者了解和掌握该技术。
步骤一：构建目标蛋白质基因的表达载体首先，需要将目标蛋白质的基因克隆到适当的酵母菌表达载体中。
常用的载体包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在构建载体时，应确保目标蛋白质的基因序列正确无误，并与载体正确连接。
步骤二：转化酵母菌将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化可以使用电穿孔法、乙醇法、锂酸法等多种方法进行。
转化后的酵母菌需要在适当的培养基上进行培养，以确保其正常生长和表达目标蛋白质。
步骤三：筛选表达蛋白质的阳性克隆经过一段时间的培养后，可以进行表达蛋白质阳性克隆的筛选。
一种常用的筛选方法是通过使用特定抗体或其他与目标蛋白质的结合能力相关的探针进行免疫检测或筛选。
步骤四：表达蛋白质的定性和定量分析对阳性克隆进行表达蛋白质的定性和定量分析，以确定其表达水平和活性。
常用的方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术等。
步骤五：优化表达条件根据定性和定量分析的结果，可以进行表达条件的优化。
优化表达条件包括培养基成分的调整、温度、pH值、诱导剂的浓度和诱导时间等因素的优化，以提高目标蛋白的表达效率和活性。
步骤六：表达蛋白质的分离和纯化经过优化的表达条件后，可以进行目标蛋白质的分离和纯化。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、为基础的层析等。
根据目标蛋白质的特性和需求，选择合适的纯化方法进行分离和纯化。
步骤七：确认目标蛋白质的展示效果经过分离和纯化后，需要确认目标蛋白质在酵母菌表面的展示效果。
常用的方法包括免疫荧光染色、流式细胞术等。
通过这些方法可以确定目标蛋白质是否成功地在酵母菌表面进行了展示。
总结：酵母菌表面展示是一种常用的生物学研究和应用技术，通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，以方便其高效表达、分离和纯化。
第八章微生物遗传变异与菌种选育习题及答案
第八章微生物遗传变异与菌种选育习题及答案第八章《微生物遗传与菌种选育》习题及参考答案一、名词解释1．点突变：DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变，称为点突变。
2．感受态：受体菌最易接受到外源DNA片段并实现转化的生理状态。
3．基因工程：又称重组DNA技术，它是根据人们的需要在体外将供体生物控制某种遗传性状的一段生物大分子-----DNA切割后，同载体连接，然后导入受体生物细胞中进行复制、表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
4．接合：遗传物质通过细胞间的直接接触从一个细胞转入到另一细胞而表达的过程称为接合。
5．F'菌株：当Hfr菌株内的F因子不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，含有这种F因子的菌株称为F'菌株。
6．诱变育种：使用各种物理或化学因子处理微生物细胞，提高突变率，从中挑选出少数符合育种目的的突变株。
7．营养缺陷型：由于基因突变引起菌株在一些营养物质（如氨基酸、维生素和碱基）的合成能力上出现缺陷，而必须在基本培养基中添加相应的物质才能正常生长的突变型。
野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。
原养型：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。
9．重组DNA技术：是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物或新物种的一种崭新的育种技术。
10．基因重组：或称遗传重组，两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。
11．基因突变（genemutation）和移码突变：基因突变（genemutation）：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，而导致的遗传变化就称基因突变。
移码突变：指诱变剂会使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
几种酵母转化方法
几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。
每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm 离心5min）约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
酵母电转化
在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。
为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。
如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。
转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。
在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
酵母菌表面展示操作步骤准备工作
酵母菌表面展示操作步骤准备工作酵母菌表面展示是一种常见的生物技术方法，在生物学研究、药物开发和工业生产等领域具有广泛应用。
本文将为您介绍酵母菌表面展示的操作步骤准备工作。
1. 提取酵母菌膜蛋白首先，需要从酵母菌中提取表面展示所需的膜蛋白。
一般来说，可以选择常见的酵母菌株，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者普通酵母菌实现展示目标蛋白或多肽。
首先，培养酵母菌至对数生长期，并使用适当的方法（如温度变化、离心等）收集细胞。
接着，通过膜蛋白溶解、离心、洗涤等步骤，提取酵母菌中的膜蛋白。
2. 构建表达载体为了实现酵母菌表面展示目标蛋白或多肽，需要构建相应的表达载体。
一般而言，表达载体需要包括浓缩表达、膜蛋白定向、融合表达等元件。
首先，选择合适的质粒载体，并进行酵母菌可复制的序列扩增，这可以确保表达载体在酵母菌中稳定复制。
接着，引入表达目标蛋白的DNA序列，并选择适当的启动子、转录终止子和选择性标记基因等构建一个完整的表达载体。
3. 转化酵母菌为了将构建好的表达载体导入酵母菌中，需要进行转化实验。
首先，将构建好的表达载体导入酵母菌细胞中，这可以通过激素介导、电穿孔或者化学共沉淀等方法实现。
接着，选择适当的培养基和培养条件培养转化的酵母菌，使其在培养基中稳定生长。
4. 筛选与验证转化后，为了确认酵母菌表面是否成功展示目标蛋白或多肽，需要进行筛选和验证工作。
可以利用荧光染料、抗体标记或者流式细胞术等方式对重组蛋白进行检测。
同时，也需要进行筛选实验，如抗性筛选、功能筛选等，来验证重组蛋白的酵母表面展示效果。
5. 扩大培养和纯化如果酵母菌表面展示效果满足要求，可以选择将其进行扩大培养。
根据需要，可以选择适当的培养条件，如温度、培养基成分和培养时间等优化培养过程。
此外，为了纯化重组蛋白，可以采用离心、过滤、亲和层析、凝胶过滤等技术手段。
总结酵母菌表面展示是一种重要的生物技术方法，可以广泛应用于生物学研究和工业生产中。
酿酒酵母的形态
酿酒酵母的形态
酿酒酵母：一般呈球形、卵圆形、椭圆形，有的呈圆柱状、柠檬形等。
酿酒酵母细胞有两种生活形态：单倍体和二倍体。
酵母单倍体的繁殖比较简单，一般是出芽生殖，当环境生存压力较大时会死亡。
二倍体细胞主要进行有丝分裂繁殖，但在环境条件比较恶劣时能够以减数分裂方式繁殖，生成单倍体孢子。
单倍体可以交配融合重新形成二倍体细胞，继续进行有丝分裂繁殖状态，酿酒的最适生长温度为28℃，但也可以在适当的高温下生长。
酿酒酵母转化方法的新探索
酿酒酵母转化方法的新探索
房志家;陈婷;郝贺龙;张兴群;黄志伟
【期刊名称】《实验室研究与探索》
【年(卷),期】2012(031)004
【摘要】在现有电转化和聚乙二醇、醋酸锂( PEG/LiAc)诱导的化学转化的基础上,进一步研究和探索了酿酒酵母感受态细胞不同预处理及相应的转化条件对转化效率的影响.结果表明:处于对数生长早期(0D600=0.6)的酵母细胞的转化效果最佳；电转化中分别以120 mmol/L的DTT和300 mmol/L的LiAc预处理感受态酵母菌10 min,可以得到较高的转化效果；联合使用120 mmol/L DTT和300 mmol/L LiAc能大幅提升酵母转化效率,达到7.15×105 cfu/μg,PEG/LiAc诱导的化学转化中使用300 mmol/L LiAc能大幅提升酵母转化效率,达到2.75×105 cfu/μg,远高于文献报道的水平.同时证明了改进后的转化方法同样能够提高外源DNA同源重组转化效率.
【总页数】5页(P5-8,78)
【作者】房志家;陈婷;郝贺龙;张兴群;黄志伟
【作者单位】东华大学生物科学与技术研究所,上海201620;东华大学生物科学与技术研究所,上海201620;东华大学生物科学与技术研究所,上海201620;东华大学生物科学与技术研究所,上海201620;东华大学生物科学与技术研究所,上海201620
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母实验-学生版
酵母实验-学⽣版酵母系列⼤实验设计PCR介导的酿酒酵母基因敲除1、实验⽬的学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因⼀步敲除法的原理，掌握酵母的转化⽅法，了解酵母⽣长及遗传学特性。
2、实验原理酵母菌作为最简单的真核⽣物，能以单倍体和⼆倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以⾃由的在单倍体和⼆倍体之间进⾏转换，在⽣物学研究中有着得天独厚的优势。
⾸先酵母菌⽣长速度很快。
对数期⽣长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂⼀代，在合成培养基中140分钟分裂⼀代。
其次，酵母的基因组很⼩，遗传背景相对简单，是⼀种很容易进⾏遗传操作的模式⽣物。
酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含⼦，其中有约5700个蛋⽩编码基因，分散在16条染⾊体上。
上世纪90年代末，由数个实验室联合进⾏的酿酒酵母基因组敲除项⽬的完成是酵母遗传学研究的⾥程碑事件。
在这个项⽬中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合⼦⼆倍体菌株库以及⾮必需基因的纯合⼦⼆倍体菌株库。
这个项⽬⼏乎完成了全部ORF的敲除，为⽣物学研究，特别是组学研究，提供了⼗分强⼤的系统性研究⼯具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。
此外，酵母作为真核⽣物，与⾼等⽣物在很多代谢通路和蛋⽩表达调节等⽅⾯是⾼度保守的，为⾼等⽣物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。
⽬前，酿酒酵母已经具有⼀套⼗分灵活快速的遗传操作体系。
酵母允许外源质粒以独⽴复制⼦游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。
但跟其他⽣物相⽐，酵母⽐较独特且强⼤的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。
之前提到的基因组敲除项⽬的完成就是依赖于⾼效率的同源重组，如图-1所⽰。
⼈们利⽤PCR的⽅法，在筛选标记基因两侧引⼊待敲除基因（YFG，your favorite gene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源重组的作⽤下，⼀些细胞的对应基因位点的内源性序列被含有同源臂的外源序列直接取代，并通过选择培养基筛选出来。
酵母菌的基因工程
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。
a 型启动子
a1-a2阻遏a细胞特征表达
编码a2因子的基因突变型 hmla2-102能产生a2变体，
hmla2-102
MATa
a 型启动子
它能灭活a1，同时阻遏a型
a1
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
酿酒酵母 的半乳糖 利用酶系
由GAL1 GAL7和 GAL10 基因编码 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达
转录水平
羧肽酶Y 转录水平
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平
酵母遗传
140
4 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
4 2 0 0 0 4 0 0 0 0 2 1 0 0 0
ⅩⅤ
XⅥ
1，091
948
566
461
20
17 0
0
2 2 0 0 0
4 0 0 1 0
总数
染色体 长度(kb) 基因数 (编码蛋白质) tRNA基因数 rRNA基因 Ty1 Ty2 Ty3 Ty4 Ty5
染色体 长度(kb) 基因数 (编码蛋白质) tRNA基因数 rRNA基因 Ty1 Ty2 Ty3 Ty4 Ty5 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 230 813 315 107 392 160 2 13 10 0 0 0 1 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 1 0 0 1
Ⅳ
Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ Ⅻ ⅩⅢ ⅩⅣ
从酵母基因组全序列来看，其基因密度较高，平均每个可 读框(open reading frame, ORF) 约为1.4 kb，而基因间的平均间 隔为600 bp，即大约70%的区域由ORF组成。其中一半是已知 的基因或与已知基因有关的基因，其余是新基因。
表 酵母基因组中染色体DNA的长度及一些因子在染色体上的分布情况
图 第III染色体上200kb的染色体片段(从染色体左臂端粒到 接合性基因MAT)上的ARS起始复制示意图
第三节 酵母中的质粒
一、酵母中的2 um质粒 酵母中的2 um质粒是一个环状、周长2um的6 kb双链 DNA分子。存在于大多数啤酒酵母的菌株中，位于酵母细 胞核内，拷贝数为50-100。 它的最显著特征是质粒上有两个600 bp长的反向重复序 列 (IR)，这两个IR中间由一个2.7kb的大单一区域和2.3kb的 小单一区域所间隔。 在酵母细胞中，由于这两个IR间的相互重组，产生两种 互变异构型的混合质粒，即A型和B型。(图)。
实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
电转法设计方案一：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。
电转化：1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。
说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。
酵母转化手册译自Yeastmaker
3. 所需的附加材料 A． Clontech 的 Ready‐to‐Go Media Pouches Clontech 提供提供预先混合好的培养基，以方便使用 表 1 酵母转化实验所需要的培养基组分
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B．培养基的配法 配置好的培养基溶于 500mL ddH2O，121℃高压蒸汽灭菌 15min，在使用前要降 至常温，（液体培养基也可以过滤灭菌）。灭菌时间不能过长。
此方法提供如果要筛文就越有可能是因为该方plus液体培法可以获组分内容所需的附加材clont得3的readyto供提供预先混习交流不做其transforma方法适用于所常规转化方的转化效率是稀有的相互个特殊又重酵母细胞10转化子uogomediap混合好的培养酵母转其他用途如ationsyst所有的酵母方法更为高效是必要的条互作用此方重要的步骤
PEG/LiAc 溶液（聚乙二醇 3350/醋酸锂 溶液） 先配置母液：50% PEG 3350、10X TE Buffer 和 1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，
现配现用。
母液
工作液各组分 配置 10mL 工作液所 要求的终浓度 需各组分母液体积
50% PEG 3350
40%
8 ml
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100Байду номын сангаасng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母菌的生活史和细胞特征
1. 酵母菌的生活史和细胞特征 单倍体细胞 二倍体细胞 单倍体细胞
2. 酵母的接合型转换 a细胞 细胞 细胞 a细胞
3. 酵母细胞接合型决定因子基因结构及表达 HML, HMR, MAT, HO; 信号传递和调控基因
4. 酵母接合型转换模型---磁带模型 活动磁带盒和沉默磁带盒
5. 酵母接合型的转换过程 HO内切酶切点处的序列, 转换方向性
6. 酵母接合型转换的调节控制 HML, HMR, HO等基因的表达调控
酵 母 菌 的 生 活 周 期
接合型控制的几种活性
细胞类型
细胞型 接合 孢子形成 信息素 受体
MATa
a 是 否 a 因子 接合因子
MAT
是 否 因子 接合a因子
●近10年来，人们已在除酿酒酵母以外的许多酵 母菌中发展出了多个性能优良的表达系统，这 些酵母菌表达系统各有特点，并都在表达外源 基因的实际应用中取得了很好的效果。对推动 生物工程的发展产生了很大的影响。同时，随 着酵母分子生物学的发展，酵母表达系统已在 人类新基因功能的研究和新药研制等方面开辟 了新的应用领域，表现了巨大的生命力。
MATa/ MAT
A/ 否 是 无 无
a或 性因子/受体相互作用激发的信号传递途径
酵母的接合型转换
性别转换只发生在酵母的母细胞
酵母接合型转换模型-磁带模型
酵 母 性 别 转 换 的 磁 带 模 型
ห้องสมุดไป่ตู้ 酵母细胞接合型决定因子基因结构 及表达
HMLa/HMR/MATa/MAT位点的结构
●酵母是一类种类繁多的生物资源，已知有80个属 约600多种，数千个分离株。
●人类对酵母菌的利用已有数千年的历史，人们 对酵母菌的一般生物学和分子生物学特性已有 很好的了解。特别是1996年酿酒酵母作为第一 个真核生物已在全世界的通力合作下完成了全 基因组的测序，这为人类对酿酒酵母的更深入 研究及更广泛的利用打下了坚实的基础。
●酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是最符 合基因表达的宿主应该具备的条件的酵母菌，
因此被最早成为基因表达系统的宿主。至今已
广泛被用来表达各种各样的外源基因。用酿酒 酵母表达的乙型肝炎疫苗（Merck公司），人 胰岛素（Novo-Nordisk公司）和人粒细胞集落 刺激因子（Immunex公司）都已成为正式上市 的基因工程产品。
★ 酵母菌的背景资料 ★ 酵母菌的生活史和细胞特征 ★ 酵母的接合型转换 ★ 酵母接合型转换模型-磁带模型 ★ 酵母细胞接合型决定因子基因结构及
表达 ★ 酵母接合型的转换过程
酵母菌的背景资料
●酵母是一类单细胞的真核生物。作为一种真核生 物，它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表 达调控机制。它既能通过有丝分裂进行无性繁殖， 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。
HO内切酶在Y区的切割位点
酵母接合型的转换过程
酵 母 性 转 换 模 型 双 链 模 型
---
酵 母 性 转 换 模 型 单 链 模 型
---
Thank you!!