酶工程-第七-酶的非水相催化
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第7章 酶的非水相催化
4、（正）胶束体系
胶束也称为正胶束或正胶团，是在大量水 溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂， 加入表面活性剂后形成的水包油（O/W）的 微小液滴。 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲 油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子，既能溶解水溶性物质又能增溶疏水性 物质。
正胶束是通过表面活性剂的极性端朝外， 与水结合，非极性端朝内，有机溶剂包在 液滴内部，形成一个非极性的核心形成。 正胶束水相是连续相，有机相是分散相。 酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶液中， 疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在 胶束的两相界面中进行。
6、pH“记忆”与pH“忘记”
在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶 的冻干或吸附到载体之前所使用的pH值相 同，这种现象称为pH“印记”或pH“记忆”。
第四节 反胶束体系的酶学研究
反胶束酶催化体系是指在非极性有机溶剂 中，酶分子溶解在由表面活性剂形成的含 水反向胶团内催化底物的转化。
一、反胶束的形成和酶的包覆
4、导电有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如
丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生 成聚苯胺。 聚苯胺-导电装置 塑料电池, 新型飞机上的电子器件,发光二极管、 太阳能电池以及移动电话和迷你电视的显示屏,导 电塑料制作分子大小的道路
5、发光有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯
当体系中水和有机溶剂同时存在时，两性 表面活性剂分子溶解于有机溶剂，并能够 增溶一定量的水，随水/表面活性剂/有机 溶剂三相浓度不同，会形成球状或椭球状 的胶束，形成所谓的“油包水”的结构， 即反胶束。
二、反胶束体系的制备方法
（1）注入法：将含有酶的水相注入到含有表 面活性剂的有机相中。 （2）液体萃取法：将含酶的水相与含表面活 性剂的有机相直接接触。 （3）固体萃取相：将酶的固体粉末与含水的 反胶束有机溶剂一起搅拌。
酶非水相催化的名词解释
酶非水相催化的名词解释酶非水相催化是一种特殊的生物化学反应过程，其特点是在无水环境中，通过酶作用催化生物分子的转化。
在酶非水相催化中，不同于传统的酶催化过程，水分子并不直接参与反应，而是由其他非水相溶剂来替代。
这种非水相催化的特性赋予了酶非常高的催化活性和选择性。
酶非水相催化的概念源于生物体内一些特殊的蛋白质，即金属蛋白和脱水酶。
这些蛋白质具有能够在缺水环境下活跃的特性。
在生物体内，金属离子可以起到酶的活性中心的作用，而脱水酶则可以在非常干燥的环境下，通过形成氢键网络来稳定酶的结构，并促进催化反应的进行。
酶非水相催化的研究对于认识生物体内酶催化反应的本质以及开发新型催化剂具有重要的意义。
通过研究酶非水相催化过程，科学家们可以揭示酶活性中心的结构和功能，以及介观生物学的规律。
此外，酶非水相催化还可以为合成有机化合物提供新思路和新方法，通过模拟生物体内的催化反应，可以设计和合成出高效、高选择性的催化剂。
在研究酶非水相催化的过程中，科学家们不仅仅关注酶本身，还对非水相溶剂的选择和影响进行了深入研究。
非水相溶剂可以影响酶非水相催化的活性和选择性，不同的溶剂性质会对酶的构象和催化效果产生直接的影响。
同时，科学家们还研究了不同非水相催化体系之间的相互作用，以及非水相溶剂的理论模拟和定量描述。
酶非水相催化的应用范围非常广泛。
在传统的酶催化反应中，水分子的存在常常会引起反应的副反应，限制了反应的效率和产率。
而在非水相催化反应中，由于水分子的排除，反应体系更为干燥，酶的活性得到了有效提升。
酶非水相催化可以应用于生物医学、制药、有机合成等领域，用于合成生物活性物质、开发新药物和催化有机反应等。
总结起来，酶非水相催化是一种在无水环境中利用酶催化生物分子转化的特殊过程。
通过研究酶非水相催化，我们可以认识酶的活性中心结构和功能，揭示生物催化的规律，为合成有机化合物提供新的思路和方法。
此外，酶非水相催化还有广泛的应用前景，可以应用于医学、制药和有机合成等领域。
第七章_酶的非水相催化
第七章 酶的非水相催化
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
拒接翻版
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1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
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1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
酶工程-07-酶非水相催化2
（2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性。
（3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或 在酶催化的最适温度附近。 （4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用。
（5）容易获得，价格要便宜。
4
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
二 、
根据所用非水介质的不同，分为四种：
酶
非
水 相 催 化 的 主 要 内 容
中（ 的四 酶） 催离 化子
液 介 质
概念：是指酶在离子液介质中进行 的催化作用。
5
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
三
1、酶的热稳定性提高。
、
2、酶的催化活性有所降低。
酶
非
3、水解酶可以在非水介质中催化水解反应的逆反应。
水
相
4、非极性底物或者产物的溶解度增加。
酶催
催化 化反 反应 应都 的要 体在 系一 主定 要的 有反
非
水 有机介质反应体系
介 质 反
（研究最多，应用 最广泛）
应
体 超临界流体介质反
系 应体系
与水溶性有机溶剂组 成的均一体系
与水溶性有机溶剂组成 的两相或多相体系
（正）胶束体系
：
应 体
离子液介质反应体系
反胶束体系
7
第七章 酶非水相催化
第二节 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 （一）微水介质体系
KLD L
D
Km Kcat
立体选择系数 L-型异构体 D-型异构体 米氏常数 酶的转换数
酶在有机介质与在水溶液中催化比较,
影
由于介质的特性发生改变,使酶的对映体选
第七章 非水相酶催化
1、低水体系
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3
4
5
6
时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
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时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
Chapter7_酶的非水相催化
14
与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系
这种体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的 两相或多相反应体系。游离酶、亲水性底物或产 物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶 剂相。 如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界 面。 催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底 物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催 化反应。 应用较少。
18
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。在催化反 应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。最适水含量与有 机溶剂种类、固定化载体特性、修饰剂的种类有关，要根据实 际情况，通过实验确定最适水含量。 在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结 合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。研究表明， 在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。 结合水也是影响酶催化活性的关键因素。 研究表明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而 增加。最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活 度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。
20
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶 分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而 降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应 选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或 者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在 有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影 响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。有 机容剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。 一般选用2≤lg P≤5这样极性适中的有机溶剂作为有机 介质。
不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中 都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著 的影响。
《酶非水相催化》PPT课件
溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的 浓度。
①有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物 难于进入必需水层；
②有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底 物在有机溶剂中的溶解度低。
故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为 宜。
医学PPT
22
第三节 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精 细平衡,从而影响到酶的结合部位。
与在水相中明显不同。
医学PPT
5
三、超临界流体介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。 超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界 点的流体。
医学PPT
6
要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良 好化学稳定性；温度不可太高太低；压 力不可太高；易获得等。
常用的超临界流体有：CO2, SO2 C2H4, C2H6 C3H8 C4H10 等。
2. 有机溶剂对酶活性的影响
（1）有机溶剂对结合水的影响
一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶 表面的必需水而导致酶失活。
由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适 含水量与酶的用量及底物浓度有关。
提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有 机溶剂中的脱水作用。
医学PPT
21
３、溶剂对底物和产物分配的影响
溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。
对酶催化反应的影响
医学PPT
9
一、有机介质反应体系
1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。
医学PPT
10
1、微水介质体系
是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系。 微量的水主要是酶分子的结合水,对维持酶
①有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物 难于进入必需水层；
②有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底 物在有机溶剂中的溶解度低。
故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为 宜。
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第三节 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精 细平衡,从而影响到酶的结合部位。
与在水相中明显不同。
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三、超临界流体介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。 超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界 点的流体。
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要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良 好化学稳定性；温度不可太高太低；压 力不可太高；易获得等。
常用的超临界流体有：CO2, SO2 C2H4, C2H6 C3H8 C4H10 等。
2. 有机溶剂对酶活性的影响
（1）有机溶剂对结合水的影响
一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶 表面的必需水而导致酶失活。
由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适 含水量与酶的用量及底物浓度有关。
提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有 机溶剂中的脱水作用。
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３、溶剂对底物和产物分配的影响
溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。
对酶催化反应的影响
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一、有机介质反应体系
1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。
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1、微水介质体系
是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系。 微量的水主要是酶分子的结合水,对维持酶
2015春 第七章 酶的非水相催化 to students
枯草杆菌蛋白酶
核糖核酸酶 酸性磷酸酶 腺苷三磷酸酶 ( F1-ATPase) 限制性核酸内切酶 （Hind Ⅲ） β-葡萄糖苷酶 溶菌酶
正辛烷，110℃
壬烷，110℃，6 h 水，pH 8.0, 90℃ 正十六烷，80℃ 水，70℃ 甲苯，70℃ 水， 60℃ 正庚烷，55℃，30d 2-丙醇，50℃，30 h 环己烷，110℃ 水
water)。
水对有机介质中酶催化反应的影响
2 . 水含量对酶催化反应速度的影响
有机介质中水含量与反应速率的 关系 最适水含量随着溶剂极性的增加 而增加 反应体系的最适水含量与酶的种 类、有机溶剂的种类等变化而有 所差别。
猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚 醇转酯反应速率与水浓度的关系
必需水对酶活的影响：
T1/2 = 80 min
活力剩余95％ T1/2 < 10 min T1/2 = 8 min T1/2 = 1 min T1/2 > 24 h T1/2 < 10 min 活力不降低 活力剩余80％ T1/2 =140 min T = 10 min
2. 酶在有机介质中的底物特异性与选择性
2.1 底物专一性 在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位 与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的 底物特异性会发生改变。
是否存在非水介质能保证酶催化？？
长期的观点认为:
有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思
想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几 乎毫无进展。 • 20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。
• 1984年， A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic
Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生
酶的非水相催化
水介质酶催化体系中，水 分的影响是至关重要的，要使酶能够表现出最 大的催化活力，确定适宜的水活度就显得十分 重要。不同种类的酶因为其分子结构的不同， 维持酶具有活性构象的必需水量也就不同，即 使是同一种类的酶，由于酶的来源不同，所需 的水量也会有显著不同。 最适水含量：催化反应速度达到最大时的 水含量。最适水含量随溶剂极性的增加而增加。 最佳水活度与溶剂极性大小没有关系，可以确 切研究非水介质酶催化作用，一般控制在0.50.6之间。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
第七章 酶的非水相催化
russellrussell将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于44种有机溶剂种有机溶剂二甲基二甲基甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮中密封振荡中密封振荡5h5h20h20h和和36h36h离心离心除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底物测其酶活力物测其酶活力44种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活图图772碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用burkeburke用固态核磁共振方法研究了用固态核磁共振方法研究了胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏4242的活性中心的活性中心冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂如蔗糖如蔗糖会不同程度地稳定酶的活会不同程度地稳定酶的活性中心结构
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
第七讲 酶的非水相催化
反胶束体系
①溶剂：
非极性有机溶剂，常用的是六碳以上的直链及支链烷 烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二 乙醚），其中正辛烷或异辛烷用得最多
②表面活性剂：
阳离子型(CTAB：溴化十六烷基三甲基胺) 阴离子型(AOT：2-乙基己基-琥珀酸酯磺酸钠) 非离子型（Tween系列） 两性型（卵磷脂）
国内外研究进展：
用酶催化转酯反应拆分外消旋体得高光学纯度对应体 在酶促反应体系中添加ß -糊精可提高对映体的纯度 枯草溶菌素有效催化合成氨基酸及肽的转酯等 杨波等提出了有机溶剂中在脂肪酶的催化作用下含手 性中心碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则 李志远等用胰脂酶在有机介质中催化反应得到高光学 纯度的2-氨基丙醇（R-）和（S+）对映体 宗敏华等探讨了超声辐射对有机相中脂肪酶催化有机 硅醇与脂肪酸反应的促进作用 刘平等研究了有机溶剂中酶催化合成五肽前体的反应
近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是肽的合成 和脂肪酶的催化反应： Xing等研究了AOT／正辛烷的反胶束体系中α-胰凝乳蛋白酶催 化合成肽衍生物的反应得到56％～88％的产率，而且还对反应 体系的Wo值、反应时间和酶浓度等条件进行了讨论； Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽； Tsai等研究了AOT／异辛烷／磷酸盐缓冲液中脂肪酶催化油脂 水解反应时表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响； 李干佐等研究了AOT／异辛烷／水体系中解脂假丝酵母脂肪酶 催化庚酸和庚醇的酯化反应动力学； Rees等研究了阳离子表面活性剂CTAB的反胶束体系中有色黏 性细菌脂肪酶催化癸酸辛酯的合成； 马成松等还研究了辣根过氧化物酶在AOT／水／异辛烷中多底 物酶促反应等。
分析反胶束体系应用较广的原因？
酶工程第七章 酶非水相催化
2、酶在手性化合物拆分方面的应用
(1)普萘洛尔的酶法拆分 Berinakatti在有机溶剂中用PSL(假单胞菌脂肪 酶）对外消旋萘氧氯丙醇酯水解,得到®-酯的ee值 （对映体过量值）大于95%
PSL对外消旋萘氧氯丙醇酯水解反应路线图
(2) 2,3-环氧丙醇衍生物的拆分 2,3-环氧丙醇单一对映体的衍生物是很重要的 手性中间体,可以用于合成β－受体阻断剂、HIV蛋 白酶抑制剂、抗病毒药物等。 Vantol对2,3-环氧丙醇丁酸酯在有机介质体系中用 PPL(猪胰脂肪酶)进行酶促拆分，得到单一的对映 体。
如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体
例
6、氧化还原反应
（1）单加氧
（2）双加氧
（3）催化醛类或酮类还原成醇类
（1）单加氧
（2）双加氧
（3）催化醛类或酮类还原成醇类
7、裂合反应
如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应
二、酶的选择
1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、 处理法不同特性亦有差别； 2、酶反应速度与酶浓度成正比； 3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择 性、区域选择性、键选择性等
①有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物 难于进入必需水层； ②有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底 物在有机溶剂中的溶解度低。
故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为 宜。
第三节 酶在有机介质中的催化特性
酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的 极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心
*
脂肪酶水解反应拆分2,3-环氧丙醇丁酸酯，*手性碳位臵
（3）2-芳基丙酸(CH3CHArCOOH)的衍生物的拆分
2-芳基丙酸(CH3CHArCOOH)是手性化合物，其单一对映体 的衍生物是治疗关节炎、风湿病等的消炎镇痛药物，如萘普 生、布洛芬等。台湾的Tsai证实在80%异辛烷与20%甲苯中酶 反应获得较高ee值光学活性物。
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四 酶非水相催化的反应介质--氟溶剂
➢ 高氟代烃通常具有极大的惰性、非极性、热力学稳定、 无毒,和一般的有机溶剂、水不能混溶。
➢ 具有高氟化基团的化合物会优先溶解于含氟溶剂中
*如Goto 等人发现一些脂肪酶在全氟辛烷 (perfluorooctane)中催化反应的速率超出酶在异辛烷中 催化反应的速率10倍之多。
➢ 由于酶不溶于有机溶剂中，酶的重复利用更加方便； ➢ 可以省略产物的萃取分离过程，提高了产物得率；
➢ 在有机溶剂存在的条件下，一般不存在微生物对反应 体系的污染问题。
非水相酶催化的缺点-酶催化活力下降
但与酶在水相中催化时的活性相比,酶在有机溶剂中催 化时的活性大大降低。如下因素常被认为与酶在非水 相中催化活性降低有关 1）在制备酶干粉进行冷冻干燥时酶活性中心构象会发 生变化或与有机溶剂直接接触导致的酶活性构象改变； 2）pH变化，尤其对于交联体晶体酶而言。同时在冷冻 干燥过程中使用挥发性缓冲液也可能导致酶最适pH的 改变。
* 离子液体强极性的特点使它对精细化工和医用产品起始材料的 “构建单元”(如肽、糖、核酸等极性底物)具有的较强的溶解性， 预示着离子液体可能在精细化工和医用产品生产上扮演重要角色。
（3）同时还有很多研究者认为离子液体是一种“可设计”的溶剂，可 以通过合成手段合成一系列结构和性质迥异的离子液体来满足各方 面研究和应用的需求。
（1）离子液体具有热稳定性高、蒸汽压低和对环境 友好等特点而被研究者称为“绿色”的溶剂
A 室温离子液体没有显著的蒸汽压。虽然在室温离子 液体中,阴阳离子间的库仑力较弱，但和一般分子溶 剂的分子间的作用力相比，离子液体显然要大得多， 因此即使在较高的温度下，离子液体也不易挥发， 故离子液体可用于高真空体系，而且对环境无污染， 有望为绿色工业开辟新的道路。
五 酶非水相催化的反应介质—离子液体
(一) 离子液体的结构及分类 离子液体是呈现为液态的盐 离子液体是完全由阴阳离子组成且常温下呈液态的
离子化合物,这些离子化合物结构上存在离子结构对 称性低、分子间作用力弱等特点，导致了离子液体熔 点接近室温或低于室温，使离子液体成为一种以液态 方式存在的盐。
(二)离子液体的优点
➢ 是目前研究最多的一种非水反应介质
➢ 应用较多的一种反应介质
➢ 但也是最受诟病的一种反应介质,其毒性，易燃，易 爆，容易挥发（碳排放）都引发了其它非水相介质的 研究
二 酶非水相催化的反应介质-气相
优点: ➢ 避免了有机溶剂的使用； ➢ 酶的回收较为方便； ➢ 气相中底物和产物的传质效果较好。
缺点: ➢ 反应器中的反应物浓度受到底物蒸汽压的影响 ➢ 酸与醇的酯化反应中酶还受到酸蒸汽的不可逆抑制失
非水酶学诞生的生产背景
80年代是油脂,香料行业迅猛发展时期，需要许多催化 反应生产酯类产物
非水相酶学的诞生
水是酶促反应最常用的反应介质。
但对于大多数有机化合物来说,水并不是一种适宜的溶剂。因为许 多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。
由于水的存在,往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应 的发生；同时水也使酯化反应的反应平衡不能指定移动。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
是否存在非水介质能保证酶催化？？
早期实验证明酶不能在丙酮乙醇等有机溶剂中催化
1984年,克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了 酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化 作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指 出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。
3） 酶在有机溶剂中的构象过于刚硬(rigid)导致活 性降低；
4）由于酶在有机溶剂中不能溶解,可能存在底物和 产物的扩散限制
5）底物在不同溶剂中去溶剂化能(desolvation energy)的差异；
第一节 酶非水相催化的反应介质
有机介质 气相介质 超临界介质 氟溶剂 离子液体
一 酶非水相催化的反应介质—有机溶剂
B 离子液体有较好的热稳定性、化学稳定性，可以不 必考虑其它溶剂通常具有的易燃性，大大提高了实 验室和工业应用中的安全性和可操作性。
（2）离子液体强极性的特点也拓宽了酶催化反应介质选择的范围,这 是因为强极性底物一般用强极性溶剂来溶解，但强极性有机溶剂常 常使酶失活，而在相同强极性的离子液体中，酶却表现出较好的活 性和稳定性
➢ 从理论上来讲,这种室温呈溶解状态的盐(molten salt)按阴阳离子 不同排列组合方式有1018 种之多，数量十分庞大，但根据阳离 子母体的不同可将常见的离子液体大致归纳为四类:分别是咪唑 盐类(A)；吡啶盐类(B)；季铵盐类；(C)和季鏻盐类；(D)其阳离 子的结构:
➢ 可作为离子液体的阴离子有：BF4-、PF6-、TA- (CF3COO- )、 HB - (C3F7COO- )、TfO- (CF3SO3- )、NfO-(C4F9SO3- )、 Tf2N- ( (CF3SO2) 2N- )、Beti - ( (C2F5SO2 -) 2N- )、Tf3C( (CF3SO2- ) 3C- )、SbF6-、AsF6-、NO2-等。
活作用
三 酶非水相催化的反应介质—超临界流体
优点: ➢ 超临界流体有极好的扩散性和很低的黏度,有利于底
物向酶分子扩散。底物在超临界中的溶解度还可通过 调节超临界流体的压力和温度来改变。 ➢ 由于通常用于酶催化反应的超临界流体为二氧化碳， 它在常温下是气态不会与产物混合，所以可制得高纯 度的产物。 缺点: ➢ 设备复杂，难于连续生产和进行工业放大。 ➢ 反应介质还会降低酶表面的pH 值且还可能对酶表面 进行化学修饰 ➢ 反应结束后取出产物的减压过程也容易造成酶的失活。
非水相酶催化的优点
➢ 脂溶性底物和产物在有机溶剂中的溶解性较高,有利 于提高底物和产物浓度的水平；
➢ 在适当的条件下，可以使酶促反应的热力学平衡向 合成方向(而不是水解方向)移动；同时由于有机溶剂 的存在，含水量减少，大大降低了许多水参与的副反 应；
➢ 在非水相中酶的稳定性得到显著提高。如猪胰脂肪酶 在99 %的有机溶剂中100 °C保温数十个小时仍保持 较高的酶活性。而在此温度条件下，酶在水溶液中却 迅速失活；