米糠多糖脱蛋白方法及条件的优化

米糠多糖脱蛋白方法及条件的优化作者：肖云张迎庆来源：《湖北农业科学》2013年第20期摘要：木瓜蛋白酶结合三氯乙酸（TCA）法对米糠粗多糖进行脱蛋白，研究不同的酶添加量、酶解温度、酶解pH、酶解时间、TCA用量、TCA处理次数、TCA处理时间对米糠粗多糖脱除蛋白效果和多糖损失的影响。

结果表明，米糠粗多糖脱蛋白最佳工艺条件为酶添加量140 U/mL，酶解最适温度55 ℃，最适pH 6.0，时间60 min；再用6% TCA作用30 min，3次重复，蛋白质脱除率为85.52%，多糖损失率为11.20%。

关键词：米糠多糖；脱蛋白；三氯乙酸（TCA）法；蛋白质脱除率；多糖损失率中图分类号：TS210.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5014-04Removing Protein and Optimizing Condition from Rice Bran PolysaccharideXUN Yun1，ZHANG Ying-qing2（1.Biological Engineering Institute，Wuhan Institue of Technology， Wuhan 430072，China；2.Bioengineering College， Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）Abstract： The technology of protein removing from rice bran polysaccharide was studied by the combination of papain and trichloroacetic acid（TCA）.The results showed that the best technological conditions were as the follows enzyme dosage 140 U/mL，hydrolysis temperature55 ℃， pH 6.0， 60 min. Then the polysaccharides were treated with 6% TCA three times for 30 min， the rate of protein-removing was 85.52% and the rate of polysaccharide-losing was 11.20%.Key words： rice bran polysaccharide； protein removing； trichloroacetic acid（TCA）method； the rate of protein-removing； the rate of polysaccharide-losing多糖是与人类生活紧密相关的一类生物高分子物质，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、降血脂、抗凝血等多种生物活性。

米糠是稻谷加工过程中的农副产物，通常米糠含油脂14%～24%、蛋白质12%～18%、无氮浸出物33%～35%、水分7%～14%、灰分8%～12%，此外还含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷维素、二十八碳烷醇、？琢-硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺等多种天然抗氧化剂和生理功能卓越的生物活性物质。

米糠中无氮浸出物主要为淀粉、纤维素和半纤维素，一部分半纤维素构成了水溶性米糠多糖（Rice bran polysaccharide，RBS），它是一种结构复杂的杂聚糖，由木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等组成[1-4]。

米糠多糖的提取方法有多种，包括传统热水浸提法、超声波辅助提取法、高压脉冲辅助提取法、微波辅助提取法等[5]。

这些方法提取得到的米糠粗多糖都含有一定量的蛋白质。

这些杂蛋白影响了米糠多糖的结构和功效。

故脱除米糠粗多糖中的杂蛋白并保留米糠多糖十分重要[6]。

传统Sevag法和三氯乙酸（TCA）法去除蛋白质通常需要重复10次，费时，样品损失很大，而且需要处理废液[7]。

而酶法是利用蛋白酶将粗多糖中的蛋白质水解，条件温和，效率高[8]，但此法往往会引入新的蛋白质杂质。

所以与TCA法相结合可取得较好的效果。

试验以脱蛋白质率和多糖损失率为指标，采用木瓜蛋白酶法结合TCA法研究米糠粗多糖脱蛋白工艺，通过对各工艺参数进行优化，确定最佳工艺条件，以期为米糠粗多糖的纯化提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 米糠米糠购自湖北百信食品有限公司研发中心。

1.1.2 试剂α-淀粉酶、木瓜蛋白酶购自广州利源化工有限公司；葡萄糖、三氯乙酸、98%浓硫酸、75%乙醇、氯化钠、氯化氢、氢氧化钠、牛血清蛋白、考马斯亮蓝均为分析纯1.1.3 仪器 UV-3000紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；GLI66高速离心机，上海申胜生物技术有限公司；DFY恒温水浴锅，武汉金宝华科技有限公司，RE-52C旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；PL精密电子天平，梅特勒有限公司；LGJ-10D真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器有限公司；SHB循环水式多用真空泵，上海贝仑仪器设备有限公司。

1.2 方法1.2.1 米糠粗多糖干粉的制备[9] 制备流程见图1。

1.2.2 脱蛋白试验1）木瓜蛋白酶法。

取米糠粗多糖，配制成2 mg/mL粗多糖溶液，研究木瓜蛋白酶酶解时不同的酶添加量、温度、pH、酶解时间对蛋白质脱除率的影响。

2）三氯乙酸（TCA）法。

经酶解处理后的多糖样品溶液40 mL，加入TCA。

研究TCA的用量、作用次数、作用时间对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响。

1.2.3 测定方法样品蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝G-250法[10]，以牛血清蛋白作标准曲线；多糖含量测定采用苯酚-硫酸比色法[11]，以葡萄糖作标准曲线。

1.2.4 计算方法[12]1）蛋白质脱除率=（C1-C2）/C1×100%式中，C1为脱色前的蛋白质浓度（μg/mL），C2为脱色后的蛋白质浓度（μg/mL）。

2）多糖损失率=（A1-A2）/A1×100%式中，A1为去除蛋白质前原液中多糖含量，A2为去除蛋白质后原液中多糖含量。

2 结果与分析2.1 木瓜蛋白酶法脱蛋白影响因素试验结果2.1.1 酶用量对米糠多糖蛋白质脱除率的影响酶添加量分别为80、100、120、140、160、180 U/mL，pH为6，温度为55 ℃，酶解时间为60 min。

高温灭酶活，离心，取上清测蛋白质含量，计算蛋白质脱除率，试验结果如图2所示。

由图2可知，在酶的添加量为80～140U/mL时，随着酶添加量的增加，蛋白质脱除率明显增加；当酶的添加量为140 U/mL时，蛋白质脱除率达到71.13%；当酶的添加量超过140 U/mL时，酶量的增加对蛋白质脱除率影响很小。

因此，确定140 U/mL为最适酶添加量。

2.1.2 酶解温度对米糠多糖蛋白质脱除率的影响酶解温度分别为25、35、45、55、65、75 ℃，pH为6，酶添加量为140 U/mL，酶解时间为60 min。

高温灭酶活，离心，取上清测蛋白质含量，计算蛋白质脱除率，试验结果如图3所示。

由图3可知，在25～55 ℃范围内，随着温度的升高，酶解速度加快，蛋白质脱除率明显提高，当酶解温度达到55 ℃时，蛋白质脱除率达到最大，为70.90%；当酶解温度高于55 ℃时蛋白质脱除率下降，可能是因为超过了酶作用的最适温度后影响酶的活力。

因此，选择55 ℃为酶解最适温度。

2.1.3 pH对米糠多糖蛋白质脱除率的影响 pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，酶添加量为140 U/mL，酶解温度为55 ℃，酶解时间为60 min。

高温灭酶活，离心，取上清测蛋白质含量，计算蛋白质脱除率，试验结果如图4所示。

由图4可知，当pH小于6.0时，蛋白质脱除率随pH的增大而增大；当pH达到6.0时，蛋白质脱除率达到最大，为72.08%；当pH大于6.0时，蛋白质脱除率随pH的增大呈递减的趋势。

这可能是pH影响了酶的活性。

因此，选择pH 6.0为最适酶解pH。

2.1.4 酶解时间对米糠多糖蛋白质脱除率的影响酶添加量为140 U/mL，酶解温度为55 ℃，pH 6.0，分别酶解30、40、50、60、70、80 min。

高温灭酶活，离心，取上清测蛋白质含量，计算蛋白质脱除率，试验结果如图5所示。

由图5可知，当酶解时间小于60 min时，随着酶解时间的增加，蛋白质脱除率明显增加；当酶解时间达到60 min后，蛋白质脱除率达到71.68%，当酶解时间超过60 min，酶解时间对蛋白质脱除率影响不大。

酶解反应时间和酶解进行程度有密切关系，反应时间太短酶解不充分；而当酶添加量达到一定量时，酶解反应时间的延长并不能使蛋白质脱除率明显提高。

因此，选择60 min为最佳酶解时间。

2.2 三氯乙酸法脱蛋白影响因素试验结果2.2.1 TCA用量对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响取酶解处理后的多糖样品溶液50 mL，分别加入4%、5%、6%、7%、8%、9%（与多糖样品溶液的体积比，下同）的浓度为1.5 mol/L的TCA，混匀后60 ℃静置30 min，3次重复，离心收集滤液，测定蛋白质脱除率和多糖损失率，试验结果如图6所示。

由图6可知，TCA用量的影响表现在两个方面：增加TCA 用量可以提高蛋白质的脱除率，但多糖的损失率也在增加。

当TCA用量小于6%时，随着TCA用量的增加蛋白质脱除率增加；当TCA用量为6%时，蛋白质脱除率为85.64%，多糖损失率为12.31%，当TCA用量大于6%时，蛋白质脱除率增加缓慢，而多糖损失率快速增加。

当TCA用量为9%时，蛋白质脱除率为88.42%，多糖损失率为21.60%。

因此，选择6%的TCA用量能对米糠多糖中蛋白质达到较好的沉淀效果且多糖损失率较低。

2.2.2 TCA作用次数对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响取酶解处理后的多糖样品溶液50 mL，加入用量为6%的浓度为1.5 mol/L的TCA，混匀后60 ℃静置30 min，作用5次，测量每次处理完后蛋白质脱除率和多糖损失率，试验结果如图7所示。

由图7可知，TCA处理次数对蛋白质脱除率和多糖损失率影响不尽相同。

TCA作用1次时，蛋白质脱除率只有42.13%，多糖损失率为4.32%；作用两次时，蛋白质脱除率达到59.28%，多糖损失率为8.78%；作用3次时，蛋白质脱除率达到85.62%，多糖损失率为11.14%；作用4～5次，蛋白质脱除率增加不明显，而多糖损失率仍增加。

因此，TCA作用3次是脱除蛋白质最佳处理次数。

2.2.3 TCA处理时间对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响取酶解处理后的多糖样品溶液50 mL，加入用量为6%的浓度为1.5 mol/L的TCA，3次重复，处理时间分别设定为10、20、30、40、50、60 min，测量每次处理完后蛋白质脱除率和多糖损失率，试验结果如图8所示。