液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展

液相色谱和质谱联用技术结合化学计量学应用于代谢组学的研究进展林艳萍1,2 司端运2 刘昌孝*21(天津大学化工学院制药工程系,天津300072)2(天津药物研究院,天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室,天津300193)摘 要 代谢组学作为系统生物学的重要组成部分,已经成为继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点。

准确全面的检测生物体液中浓度较低的代谢物变化是进行代谢组学研究的基础。

液相色谱和质谱联用(LC /M S)技术结合化学计量学很好地实现了对大量样品和微量代谢物的快速定性、定量分析,极大地推动了代谢组学的相关研究。

本文综述了LC /M S 与化学计量学相结合用于代谢组学研究的现状,并对后续的研究进行了展望。

关键词 液相色谱和质谱联用技术,化学计量学,代谢组学,评述2006-11-15收稿;2007-02-28接受本文系国家自然科学基金(N o .20675056,30630075)资助项目*E-m ai:l li u changx i ao @163.co m1 引 言代谢组学(m e tabono m ics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点,是系统生物学的重要组成部分[1~3]。

N icholson 等[4]在1999年提出代谢组学的概念:对病理生理刺激或基因改变时生物体系的动态代谢响应所进行的多参数定量分析(the quantitati v e m easure m ent of the dyna m ic m ultipara m etric m etabo lic responses o f li v i n g syste m s to pathophysi o log ica l sti m u li or genetic m od if-i ca ti o n)。

体液中的代谢物与细胞、组织中的代谢物处于动态的平衡当中。

当机体由于外界刺激或毒性反应导致组织细胞出现异常的时候,正常的代谢过程出现障碍,生物的体液组成就会产生变化。

代谢组学的研究目的就是从尿液、血浆、血清、唾液和胆汁等生物体终端样本中检测代谢物,或跟踪代谢水平整体的动态变化,提取/组学0信息,以此来反映生物体在外源刺激作用下的体内生物学过程变化情况。

其中的一个基础研究过程就是全面准确的对生物体的终端代谢产物进行定性和定量分析。

由于生物体内的各种代谢物往往以较低的浓度存在于复杂的生物介质中,使得有关代谢组学的研究工作进展缓慢。

随着分析技术的发展,近年来对大量样品和微量代谢物的分析技术取得长足进步,为代谢组学研究的具体实施提供了技术支持。

代谢组学研究,主要使用的分析方法有核磁共振波谱(NMR )、质谱(M S)、色谱(GC 或H PLC)、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射及发射性检测和光散射等[5],其中最为常用的方法是核磁共振分析和质谱分析。

上述分析手段的机制、特点等各不相同,但都会在较短的时间内产生海量的多元性数据,需要对其进行统计和归类分析,从中提取特征代谢物或代谢量的整体变化规律。

传统的人工提取信息的方法已经远远不能满足要求。

近年来,研究者们多借助化学计量学原理编辑软件在计算机上实现该过程。

因此,代谢组学研究就与高通量、高灵敏度的分析手段以及准确、迅速的信息提取方法实现了紧密地结合。

许多基因组学、转录组学、蛋白质组学等研究无法察觉的变化,可以通过分析代谢组体现出来,再加上代谢组学研究还具有无损伤、可量化的特点以及高通量、低成本的优势[6],近年来代谢组学研究在药物研发、药物安全性评价[7,8],环境外源物毒性检测[9]、营养分析[10]、疾病诊断[11~13]及植物代谢组学[14]等领域都彰显出巨大的科学潜力。

2 LC /M S 技术的特点液相色谱和质谱联用技术在有关代谢物的分析研究中发挥着越来越重要的作用。

色谱是最常用的第35卷2007年10月 分析化学(FENX I HUAXUE) 评述与进展Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry 第10期1535~1540分离分析工具,与质谱联用则可以更高效、快速的完成从分离到分析的一整套操作。

气相色谱与质谱联用(GC /M S)技术和LC /M S 技术可以同时检测出数百种化合物,包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量植物的次级代谢产物[15]。

GC /M S 技术需要先对样品进行衍生化预处理。

这一步骤耗时而且容易引起样品的变化。

受此限制,GC /M S 技术不能分析热不稳定物质和一些大分子的代谢产物。

而LC /M S 技术不受此限制,又经济实用,适用于那些热不稳定,不易挥发、不易衍生化和分子量较大的物质[16]。

质谱多通道监测的功能和色谱卓越的分离能力使LC /M S 技术对检测样品的浓度和纯度要求与NMR 技术相比明显降低,甚至对含量极低的物质也能通过优化质谱的扫描模式给出可视化响应。

同时,LC /M S 技术又有较好的选择性和较高的灵敏度,得到了越来越广泛的应用。

LC /M S 技术产生的数据信息有其自身的特点,所产生的数据由H PLC 或NMR 的二维数据,上升为保留时间、质荷比和信号强度组成的三维数据。

应用LC /M S 技术分析代谢产物时,要求必须同时采用保留时间和质荷比二个参数才能准确地标识一个化学成分,无疑增加了LC /M S 谱图解析工作的难度。

3 基于化学计量学的信息挖掘化学计量学(che m o m etrics)是化学科学的一个分支,能够设计、研究多种数学模型(高通量模型、统计模型、分析模型等),特别适用于处理大量的复杂数据[17]。

借助化学计量学可以帮助代谢组学解决两 图1 理想的数据分析过程F i g .1 Ideal system o f da ta ana l ys i s 个棘手问题:在不丢失关键信息的前提下把化学问题抽象成合理的数学模型;选用合理有效的数理统计方法对数学模型进行计算,给出分析结果。

希望借助化学计量学实现的理想的数据处理模式如图1所示。

3.1 解析谱图建立数学模型要把LC /M S 分析产生的谱图转变为合理的数学模型须对原始谱图进行预处理,其中包括两个关键步骤:过滤噪音和峰匹配。

取平均过滤法(m edian filteri n g)是目前经常采用的一种过滤噪音方法。

它属于非线性滤过法,采用某一相应数值点周围几个点的平均值来替代该点,从而达到滤噪的目的[18]。

另一种是匹配滤噪(m atched filtration),借助高斯函数建立一个标准峰模型,模型中的峰宽度与高斯函数相对应[19]。

在原始数据中,峰宽小于该函数的,一律被视为噪音而剔除。

在此方法的基础上,Andreev 等[20]又发展了实验确定噪音的匹配滤噪法(m atched filtration w ith experi m ental noise deter m inati o n ,MEND)。

该方法可以更好得识别出强度较弱的色谱峰,自然可以提供更多的信息。

噪音过滤主要根据色谱的保留时间进行,不会影响质谱给出的任何质荷比数据。

在峰匹配方面容易想到的方法是在待测的样品中加入内标,根据内标在同一检测条件下保留时间相同的原理,来校正色谱峰保留时间的漂移。

例如W aters 公司的软件M ar ker Lynx 就是通过内部计算选用一个/内标0完成该步骤,但是该软件只适用于W aters 公司仪器系统,其它型号的质谱仪产生的谱图受到限制。

事实上,借助内标进行峰匹配有两大缺陷[21]:(1)该方法首先假设色谱保留时间的漂移是线性的假设与实际不相符;(2)需要首先找到既稳定又不与目标化合物相互干扰的新化合物作为内标,增加了工作量。

为了避免这些缺陷,同时实现非线性滤噪,N ie lsen 等提出了相关性优化偏移(correlation opti m ized w ar p i n g ,CO W )的方法[22]。

该方法综合考虑全谱的每个峰宽,使用两个估计参数模拟峰偏移,建立一个去除峰偏移后的对应模型,然后把该模型与每张色谱图对照就得到峰偏移系数矩阵。

之后也可以借助质谱图中包含的信息,进一步优化该系数矩阵[23]。

CO W 方法以及与它相关的优化方法都是1536 分析化学第35卷建立在峰偏移的大小不超过两个相邻峰间隔的基础上。

另一种进行峰匹配的方法就是直接建立描述峰偏移的函数,使其系数的方差最小,从而使两张谱图里相同色谱峰的保留时间偏差最小[24]。

经过上述两个步骤后,还需要把LC /M S 技术给出的三维信息转变成二维数据矩阵,为后续的统计学处理做好准备。

目前有两种思路实现数据降维:将图谱按照时间分段然后建立矩阵,在每个特定的时间段内,矩阵的每一行代表不同的样品,每一列代表该时间段内扫描检测到的质荷比[25];或借助M ark -erl y nx 软件,将保留时间和质荷比联合作为矩阵每一列的标识,不同的样品作为行,建立数据阵[26]。

3.2 数理统计方法已经建立的数据矩阵中还是隐含有大量的信息,需要借助数理统计方法才能给出化学意义明确的结果。

常用于代谢组学研究的统计方法分为两大类:有监督式(super v ised)模式识别和无监督式(unsu -perv i s ed)模式识别[27]。

有监督式模式识别利用大量的样本,作为训练数据建立数学模型,并利用后续的检测数据优化模型,从而提高样本类别判断和生物标志物识别的准确性和可靠性。

使用该类分析方法的前提是对样本的分类已有初步判断。

所用到的具体方法包括软独立建模分类法(soft i n dependen tm ode ling of class a -nalogy ,S I M CA )[28]、偏最小二乘法判别式分析法(partial l e ast squares discri m inant analysis ,PLS-DA )[29]、k 最近邻法(k nearest ne i g hbors ,kNN )[30]和人工神经网络(artificia l neura l net w o r k ,ANN )[31]方法等。

无监督式模式识别应用于不具备任何相关知识背景的情况下,对生物样本进行类别归属和生物标志物(bio m arker)识别,也是目前代谢组学研究中较普遍采用的一类研究方法,常用的有主成分分析(pri n c-ipal components ana lysis ,PC A )[32]和簇类分析(h ierarchical cluster analysis ,H C A )[33]等。

一般先采用PC A 等无监督模式识别方法,将未知样品进行分类,同时找出异常点,即可能的生物标志物。