常用色谱与光谱分析方法与技术

常用色谱和光谱分析方法和技术

色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术，构成了药物分析学科领域中最主要和最基本的研究手段和方法，应用日趋广泛，发展十分迅速，新颖方法层出不穷。

新近常用的色谱分析方法：

一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC)又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC)，是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊（或称胶束，微胞等）浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个（一般为25～160个）表面活性剂单体分子组成，其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内，胶囊溶液的某些物理性质（如表面张力、电导等等）以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊；后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同，并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析，是一种安全、无毒、经济的优越技术。

（一）原理：胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中，分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用；同时定量地指出分离组分的容量因子k'的倒数值与胶囊浓度成正比，一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。

（二）方法特点：与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系，而常规流动相是一种均相体系。特点：

1、高度的选择性：因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用，只要通过流动相中胶囊浓度的改变，就可使分离选择性获得改善和提高。此外，通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。

2、便于梯度洗脱：由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时，溶液中仅胶囊的浓度发生改变，而表面活性剂单体分子的浓度不变，不影响流动相与固定相的平衡过程，因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间，并减少了流动相的消耗，适用于常规。

3、提高检测灵敏度：胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度，从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。

4、因分离组分不易分出，故缺点是柱效低且不适于制备分离。

（三）常用表面活性剂：常用的阳离子表面活性剂主要有：溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyl trimethyl ammonium bromide or chloride,CTMAD或CTMAC)；阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)；非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。

二、手性分离色谱(Chiral Separation Chromatography,CSC)

是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异，有必要对某些手性药物进行

对映体的纯度检查。

（一）原理和方法：对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完全相同的，因而难以分离。传统方法（分步结晶法、酶消化法等）有很大局限性，特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后，TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。

HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。

间接方法主要基于外消旋体混合物经柱前衍生化形成一对非对映异构体(Diastereoisomers)。此法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型对映体的物理性质完全相同，只能在手性固定相上才能获得拆分；如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物，其物理性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离。本法需高光学纯度的手性衍生化试剂(Chiral Derivatization Reagent,CDR)，衍生化反应往往比较繁琐费时；各对映体衍生化反应的速率有时也不相同。由于可采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测的灵敏度，以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点，柱前手性衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。

直接方法主要采用手性流动相添加剂(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可称为手性流动相(CMP)拆分法或手性洗脱法。它不必事先将样品制备成衍生物，而只须将手性剂加入流动相中。手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固，但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。常用的CMPA有：环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物）；手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等；以及配位体交换型手性流动相添加剂(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC)，其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物，再与二价金属离子形成螯合的配位化合物，以适当的浓度分布于流动相中，遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对，然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年来CSP法发展迅猛，应用日益广泛。它是不经转变成非对映体而直接拆分的方法，优点是：适用于不含活泼反应基团的化合物；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步骤简单。但迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。根据分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有：手性电荷迁移配位体固定相，如 Pirkle型HPLC-CSP；蛋白亲和配体固定相，如 Enantiopac(LKB)；内部配位化合固定相，如环糊精(Cydobond)和纤维素酯(Chiracel)等；以及配基交换固定相，如

L-脯氨酸-Cu2+共价键合于聚苯乙烯等基质上。

CSP拆分对映体的理论概念：在HPLC的CSP柱上拆分对映体是利用药物对映体和特

制的、在硅胶上键合的对映体固定相（CSP）之间所形成的非对映体复合物。由于非对映体复合物稳定性差异，可使两个对映体的保留时间不一致，与CSP形成稳定性较差的非对映体的药物对映体可先洗脱，因之实现了拆分。CSP设计是基于Dalgliesh在1952年提出的“三点手性识别模式”(Three-point chiral recognition model)，认为要实现手性识别，在手性化合物分子与CSP之间至少同时要有三个相互作用部位，其中之一必受空间影响，或是相互吸引或是相互排斥。生成的非对映体的相对强度，决定了两个对映体的分离度和洗脱次序。

（二）三类手性分离方法的比较：CDR法的优点是应用条件相对简易，只需采用普通HPLC的固定相和流动相即可而且通过衍生化有利于增加检测（紫外或荧光）灵敏度；缺点是样品中相关化合物须预先分离、衍生化手性试剂的光学纯度的高要求以及异体对的衍生化反应速率不一。

CMPA法的优点是不必作柱前手性衍生化；对固定相也无特殊要求；样品的非对映异构化络