发酵2项目二：培养基灭菌

三、 影响培养基灭菌的因素 泡 沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死 其中的杂菌。 颗 粒
颗粒小，容易灭菌，颗粒大，则难灭菌。
四、灭菌操作
分批灭菌
将培养基置于反应器中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一定 时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵
连续灭菌
将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却然后进入空消后的发酵 罐的杀菌方法就是连续灭菌。
超声波消毒
利用频率在20～200kHz的声波作用下，使细菌细胞 机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。如超声洗手 器，用于手的消毒。超声洗涤机，用于注射器的清洁和初 步的消毒处理。
微波波消毒
微波消毒利用微波的就是一种高频电磁波，其杀菌的作用原 理，一为热效应，所及之处产生分子内部剧烈运动，使物体 里外湿度迅速升高；一为综合效应，诸如化学效应、电磁共 振效应和场致力效应。 目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械 包、微生物实验室用品等亦有报告。
化学灭菌
化学物质名称 新洁尔灭(苯扎溴铵 新洁尔灭 苯扎溴铵) 苯扎溴铵 杜灭芬 高锰酸钾 漂白粉 酒精 煤酚皂（来苏尔） 煤酚皂（来苏尔） 有效浓度 0.25% 0.25% 0.1%-0.25% 5% 75% 1%—5% 化学物质名称 甲醛 戊二醛 苯酚 过氧乙酸 焦碳酸二乙酯 有效浓度 37% 2% 0.1%-0.15% 0.02%-0.2% 0.01%-0.1%
一、微生物的热死动力学
将方程积分后得：t =2.303/K lgN0/Ns N0=开始灭菌(t=0) 时原有活菌数 Ns=经时间t后残存活菌数 反应速度常数k值是微生物耐热性的一种特征，它随微生 物的种类和灭菌温类不同、不同的生理状态、不同的外 界环境，差别很大，实质上，K值是微生物热阻的一种表示 形式，热阻是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热 方式）下的致死时间。微生物的热阻越大，K值也越大。 例如：芽孢在121℃时，K=60/s；营养体，在121℃， k=60～6*1010/s。
单元知识二 培养基灭菌 概 述
是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。 工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。 达到要求的无菌程度（N=10-3）即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了 一个活菌体。要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此 在工程设计中常取N=10-3。这是工业上对培养基要求达到无菌程度标准。
一、微生物的热死动力学 理论灭菌时间的确定
对数残留定律：在灭菌过程中，微生物在高温高湿的环境中的热 对数残留定律 死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。 热死动力学方程 - dN/dt = KN N--残存的活菌数（个） t--灭菌时间（min） K--杀菌速率常数（min-1）或叫死亡速率常数。 K是判断微生 物受热死亡难易程度的基本依据。 dN/dt--菌的瞬时变化率，即死亡速率。
干热法
火焰灼烧灭菌。火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如 镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 热空气灭菌。利用高温干燥空气（160－170 ℃ ）加热灭菌1 －2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性， 与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。
湿热法
原理：蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透 力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失 活，微生物因代谢障碍而死亡。 效果比同温度下干热好。
空罐灭菌
分批灭菌
分批灭菌包括升温、保温、 分批灭菌包括升温、保温、降温三个过程
分批灭菌
分批灭菌操作要点
打开所有的排气阀门，三路进蒸汽 当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求 与反应器相连的所有管道处于两个状态：进汽或出汽，目的是对 管道进行灭菌。 保温期间，要求罐压：0.09-0.10MPa，温度：118—121℃， 时间：30min。 灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却， 目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。
分批灭菌的优缺点 优点 分批灭菌不需其他设备，操作简单易行。省去了连消设 备和操作，节省了动力。 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点 升温慢、降温也慢，增加了发酵前的准备时间，延长了 发酵周期，设备利用低，而且无法采用高温短时灭菌。
化学灭菌
原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能杀菌剂如重金属离 子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。 注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微 生物所处的环境有关。 常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸福尔马林、升汞、 高锰酸钾、新洁尔灭等
化学灭菌
0.%~0.25%KMnO4溶液、0.5%~1%漂白粉溶液、 75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、苯酚溶液、 来苏尔
杂菌可引起的后果
生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。 杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。 杂菌会污染最终产品。 杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。 杂菌降解所需要的产物。 发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。
单元知识一 灭菌方法
物理灭菌 热力灭菌（如干热灭菌、湿热灭菌、流通蒸汽灭菌）、射线灭菌、超声 波消毒和微波消毒等。 化学灭菌 液体灭菌（如75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%新洁尔灭、 2%左右的酚或煤酚皂溶液）和气体灭菌（如臭氧、环氧乙烷、甲醛、丙 二醇、甘油和过氧乙酸蒸汽等）。
概 述
灭菌：是指用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物包括营养细 胞、细菌芽孢和孢子的方法。 消毒：是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物 的措施。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 巴氏消毒法消毒牛奶加热60℃维持30min。 在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。 灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。
项目二 培养基及设备灭菌
引 言
2006年8月15日,国家食品药品监督管理局召开新闻发布会，通报了对安徽华 源生物药业有限公司生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（欣弗）引发的药品不 良事件调查结果：现已查明，安徽华源生物药业有限公司违反规定生产，是导致 这起不良事件的主要原因。经查，该公司2006年6月至7月生产的克林霉素磷酸酯 葡萄糖注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，增加灭 菌柜装载量，影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验， 结果表明，无菌检查和热源检查不符合规定。 由此可见，当前无论是食品、药品或生物产品，在生产过程都要重视灭菌和消 毒工作，确保安全。
二、高温短时灭菌法
灭菌温度、时 间和维生素B1 损失的关系
灭菌温度（˚C） 达到灭菌程度的时间（min） 维生素B1的损失（%）
100 110 120 130 140 150
843 75 7.6 0.851 0.107 0.015
99.99 89 27 10 3 1
二、高温短时灭菌法
达到相同灭菌效果，T越高，所需t 越短采用高温短时（HTST）灭菌效果 好，既能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。
射线灭菌
通常用紫外线、高能量的电磁波等 原理：紫外线波长在260nm杀菌力强。此段波长易被细胞 中核酸吸收，可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和 时间的乘积成正比。
缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。 应用：无菌室，医院。 注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用 射线灭菌：r射线，穿透力强，适用于堆积物品的灭菌。
阿累尼乌斯方程
微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，灭菌温度与菌死亡的反 应速度常数关系可用 K=Ae-E/RT K----杀菌速率常数（死亡速率常数）（min-1） A----频率因子（阿累尼乌斯常数），因菌种的不同而异。 E-----活化能（J/mol） T-----绝对温度（K）T= t +273.15 R-----气体常数 8.36J/mol.K(或1.98cal/mol.K) e=2.718
二、高温短时灭菌法
微生物死亡速度常数K是微生物耐热性的一种特征，它随着微 生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，微生物越耐热， k 值越小；微生物越不耐热，k值越大。 反之，k值越小，微生物越耐热，灭菌时间就长；k值越大， 微生物越不耐热，灭菌时间就短。例如，在121℃，细菌芽孢 的K值为1min-1，而营养细胞的K值最大1010为1min-1。
二、高温短时灭菌法
例如：还原糖与氨基酸、肽、蛋白质等发生化学反应， 形成5-羟甲基糠醛和类黑精。在对嗜热脂肪芽孢杆菌孢 子进行杀灭时，达到相同灭菌效果（N/N0=10-16）时， 不同的灭菌温度对维生素B1损失影响很大。
二、高温短时灭菌法
为什么要采用高 温短时灭菌？ 温短时灭菌？
实验表明细菌孢子热死反应的活化能E很高，营养成分破坏的 活化能较低。 随着温度上升，菌体孢子死亡速度常数增加倍数大于培养基 成分破坏速度常数增加倍数。所以当温度升高时，杂菌死亡 速度要比营养成分破坏速度快得多。 根据这一原理，培养基灭菌采用高温短时的方法能达到灭菌 的效果，又可以减少营养成分的破坏。
需注意的几个问题 N0，NS如何取值？
对于 NS，如果取NS =0，那么t=∞，这显然是与现实情况不符。 通常取NS=10-3，这个数值理解可以理解为灭菌1000次，有一次是 失败的，残留了一个活菌体。要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到 的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。这是工业上对 培养基要求达到无菌程度标准。这个数值的取值的大小，也间接反 应了该生产过程中的技术管理水平。
物理灭菌
热力灭菌 干热灭菌、湿热灭菌 射线灭菌 紫外线、阴极射线、X射线、γ射线 超声波消毒和微波消毒等
热力灭菌
干热灭菌：是指相对湿度在20％以下的高热，有火焰灼烧灭 菌和热空气灭菌。 湿热灭菌：又成为高压蒸汽灭菌。在实验室或工业生产中， 对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定 的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。