第二章 培养基
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生化工程第二章-培养基灭菌(1)
培
养
基
灭
菌
生
化 工
N0 40 10 6 2 105 81012
程 N 10 3; K 1.8 min 1
第
二 章
t 2.303 lg N0
KN
培 养
2.303 lg(81015 ) 20.34 min
基
1.8
灭
菌
生 化 工 实际上，培养基在加热升温时(即升温阶 程 段)就有部分菌被杀灭，特别是当培养基 第 加热至 100 ℃ 以上，这个作用较为显著。 二 因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的 章 时间要短。严格地讲，在降温阶段也有杀
基 灭
灭菌的依据。
菌
生
化 工
微生物热死灭动力学方程
程 微生物热致死是指微生物受热失活直到
第 死亡,微生物受热死亡主要是由于微生物
二 章 培 养 基
细胞内酶蛋白受热凝固,丧失活力所致。
在一定温度下,微生物受热后,其死活细胞 个数的变化如化学反应的浓度变化一样, 遵循单分子反应速率理论。
灭
菌
生
化
工 程 第 二 章
章 表明：ln K 与 1/T 之间呈直线关系，其斜率
培 为 –ΔE/R，在不同 T 时做灭菌试验，求得
养 相应的 K 值，即可求出ΔE。 基
灭
菌
生 化 工 程
第 二 章
培 养 基 灭 菌
生 化 工 以上可以看出：ΔE 同 T 一起决定 K 值，即： 程
第 二
K KE,T
章 培 养
将ln K E ln A两边对T求导 RT
基 灭
d ln K dT E RT 2
菌
生
第二章 双碟制备.
目前已使用的各种培养基都是前人经过反 复实践，比较设计的成果。
自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等 为氮素营养
异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮 有机物为氮源
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需 要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元 素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中 常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、 NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因 子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，
培养基Ⅱ号 胨 牛肉浸出粉 酵母粉 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
6g 1.5g
6g 1g 15~20g 1000ml
中国药典2005年版二部附录的抗生素微生 物检定法中收载了13种不同处方的培养基
及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，
使用方便。临用时按照使用说明进行配制， 但应注意核对培养基的PH，必要时需调节 PH，使其符合规定。另外，市售干燥培养
基的质量也存在差异，注意选择合适的产 品。
第二章 双碟的制备
配好的培养基，根据需要趁热分装至试管 或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘
在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的 1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～ 1/4，先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞 既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、 大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。 最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶 颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉 塞或脱落。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用 麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称 琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。 市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多
聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分 解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃， 凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度 下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生 物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等 为氮素营养
异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮 有机物为氮源
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需 要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元 素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中 常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、 NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因 子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，
培养基Ⅱ号 胨 牛肉浸出粉 酵母粉 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
6g 1.5g
6g 1g 15~20g 1000ml
中国药典2005年版二部附录的抗生素微生 物检定法中收载了13种不同处方的培养基
及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，
使用方便。临用时按照使用说明进行配制， 但应注意核对培养基的PH，必要时需调节 PH，使其符合规定。另外，市售干燥培养
基的质量也存在差异，注意选择合适的产 品。
第二章 双碟的制备
配好的培养基，根据需要趁热分装至试管 或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘
在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的 1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～ 1/4，先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞 既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、 大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。 最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶 颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉 塞或脱落。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用 麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称 琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。 市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多
聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分 解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃， 凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度 下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生 物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
【安徽】中职农业生物技术(主编曹春英、丁雪珍第二版 高教版)教案：第二章 植物组织培养技术04
第三节植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节植物组织培养操作技术（2）。
二、学时安排2学时。
三、教学目标1．掌握培养基的作用。
2．掌握培养基中生长调控物质的作用。
3．了解培养基的类型。
四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。
难点：培养基中生长调节物质的作用。
五、教具电化教学设备。
六、教学方法讲授法，演示法。
七、教学过程Ⅰ.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。
II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。
配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。
没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。
（二）培养基的种类1.培养基的种类划分2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
常用的培养基配方：表1 常用培养基配方只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。
常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物来提供。
第二章植物组织培养基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第二节 植物的脱分化
一、愈伤组织的形成
1、形成条件： ① 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 ② 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作
用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体 的不同生育期等条件也很重要。
诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（α-萘乙酸），IBA（吲
第二章 植物组织培养的基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。
第二章植物组织培养基本原理
分裂期
第二章植物组织培养基本原理
(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的 区域。
第二章植物组织培养基本原理
5、 愈伤组织的生长过程的特点：
1）体积、重量： 2）生理生化特性：
诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量 减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。 即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
第二章植物组织培养基本原理
二、细胞分化：
分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化
是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方 式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑 制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。
第二节 植物的脱分化
一、愈伤组织的形成
1、形成条件： ① 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 ② 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作
用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体 的不同生育期等条件也很重要。
诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（α-萘乙酸），IBA（吲
第二章 植物组织培养的基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。
第二章植物组织培养基本原理
分裂期
第二章植物组织培养基本原理
(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的 区域。
第二章植物组织培养基本原理
5、 愈伤组织的生长过程的特点：
1）体积、重量： 2）生理生化特性：
诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量 减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。 即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
第二章植物组织培养基本原理
二、细胞分化：
分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化
是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方 式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑 制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。
第二章 培养基的组成和配制法
培养基配制方法
移母液 确定配方 称取蔗糖、琼脂 定容 培养基熬制 调pH值
二次定容
接
种
灭
菌
扎口
分装
培养基配制室 Medium-making room
• 不同植物材料常需要改变配方，如维持生 长和诱导细胞分裂和分化的培养基配方就 不同。 • 配方的种类很多，目前以MS（Murashige and Skoog）培养基配方作为最常用的一 种基本培养基，它利于一般植物组织和细 胞的快速生长。
在进行组织培养研究时应根据研究目的和培养植物的种类 来确定培养基的组成，除营养、诱导作用外还应当注意离 子平衡和毒性问题，如水一般都采用重蒸馏水，无机盐类 一般都需用分析纯的药品， pH值可用1mol· L-1KOH（或 NaOH）溶液和2mol ·L-1HCI调整。 有时可以用普通药品代替，但须注意这些药品不仅应有营 养价值，还须无毒。如果在工业上使用大缸深层培养细胞 或组织生产有效成分和生物制品、应用培养基的量将要以 吨位计量时，则采用什么代用品较为经济实用更应慎重考 虑。
（4）当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。最 好用酸度计。如无条件也可用精密PH试纸， pH值 可用1mol·L-1KOH（或NaOH）溶液和2mol ·L1HCI调整。
（5）配制好的培养基要趁热分装，分装时可采用烧 杯漏斗直接分注。一般以占试管或三角瓶等培养容 器的1/4—1/3为宜。
（6）由于未经灭菌处理的培养基既可能带有各种杂 菌，同时又是各种杂菌良好的生长繁殖场所，因此 培养基分装后应立即置于灭菌锅内进行灭菌 （7）高压灭菌后的培养基凝固后，宜将培养基放倒 培养室中预培养2—3天若没有杂菌污染才可放心使 用。
第一节 培养基成分
（1）无机营养物 （2）糖类 （3）维生素类 （4）氨基酸及有机附加物 （5）植物生长调节物质 此外，培养基中如加入0.5～1.0％的琼脂即 为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养 的液体培养基。
第二章_培养基灭菌1
不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A e 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
例：
嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 和 维 生 素 B1 的 热 处 理 数 据 （一定 T 下， ln(N/N0 ) = - K t ），就不同的 T，求 得前者的比热死亡速率常数 KBS 和后者的比破坏速率常 数 KVB， 按 lnK——1/T 标 会 ， 得图，由图算出： • △EBS=67000×4.184 J/mol • △EVB=22000×4.184 J/mol • ln K = - △E /RT + ln A
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度 T 对 K 的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度 和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A e
E / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol· K T：绝对温度
进行培养基灭菌的操作方式 • 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌
植物组织培养的培养条件
肌醇
100mg/L
KI
0.83 mg/L
H3BO3
6.2 mg/L
MnSO4.4H2O 22.3 mg/L
ZnSO4.7H20 8.6 mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
CoCl2.6H2O 0.025 mg/L
Na2.EDTA
37.3 g/L
FeSO4.7H2O 27.8 mg/L
• 铁盐的配法:
Fe2+在培养基中不稳定，故要用螯合剂 Na2－EDTA来配制配制方法如下：
在装有400 ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛 性钠，溶解后加入3.73g Na2 –EDTA, 加 热使其全部溶解，然后边搅拌，边慢慢 加入2.78g FeSO4·7H2O直至全部溶解,冷 却后定容至1000 ml（浓度10 ml/L)，倒入 棕色试剂瓶中，置于冰箱中冷藏，保存 备用
１L培养基中用量 称取量（g） 定容体积 (mg)
1900
19
分别溶解
1650
16.5
后混合定 容至1000
370
3.70 ml。
170
1.70
440
4.40
• 注意：为避免发生沉淀，应注意各种化合物的组合以 及加入的先后顺序。
• 母液的浓度可用a ml/L表示，其意义为：配制1升培养 基吸取该母液a毫升。
✓水解酪蛋白：浓度100－200mg/L，应用在微茎尖培 养
Auxins——生长素
溶于95%乙醇或 1mol/LNaOH
诱导细胞的分裂和根的分化
培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响
No NAA
NAA reduced to 0.1 mg. l-1
5.第二章 细菌的生物学特性,第五节细菌的人工培养
病原菌的人工培养一般采用35~37℃，培养时间多数为18-24小时。
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
第二章培养基制备练习题
一、锤式粉碎机粉碎原理及适合粉碎的物料的粒度（中碎/细碎）。
二、辊式粉碎机粉碎的机理（剪切力、挤压力）。
三、喷射式加热器
四、高温维持设备有柱式、管式、锅式。
衡量高温维持设备好坏主要看其物料的先进先出性，培养基灭菌主张采用高温短时间（为什么）。
五、糖化锅的的锅底形状选用哪种好（球形好，哪几个方面好）。
六、柱式高温维持设备的计算（记住流程一般柱个数4~5个，柱高6~8m,视厂房
高度而定，柱直径450~550mm).
七、糖化锅的设计计算（需记住糖化锅的填满系数自己取0.75~0.85，糖化锅几
何尺寸比例关系，选择的锅底容积计算公式，锥形或球形，球形记住曲率半径计算公式，球形锅底容积计算公式）。
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
105
荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
组织培养 植物组织培养基本操作
2020/3/24
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
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大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
2020/3/24
⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
2020/3/24
4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
2020/3/24
5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
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一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
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大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
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⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
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4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
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5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
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第二章 培养基1
• 水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分 为氨基酸，使用浓度为100-200mg／L。受 酸和酶的作用易分解，使用时要注意。
• 其他 酵母提取液(YE)(0．01％-0．05％)， 主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取 液(0．01％~0.5％)、苹果和番茄的果汁、 黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较 稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。
4．2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)
优点：诱导能力要比IAA高10-20倍，特别在促进愈伤组 织的形成上活力最强。 缺点：但它会强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。因 而其适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。 适用：一般用于细胞启动脱分化阶段，而诱导分化阶段 往往不用2,4-D，而用NAA 或IAA 、IBA等。 脱分化---是指使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特 性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的 能力的过程。 分化---是指使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组 织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构 的特化细胞。
五、糖类
糖在组培中是不可缺少的 1.作用： 一是作为离体组织赖以生长的碳源 二是使培养基维持一定的渗透压（一般在1.5-
4.1MPa）。
2.种类：蔗糖（多用），其浓度为1%-5%,也可 用砂糖、葡萄糖或果糖等。
• 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对 水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最 好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不 同植物不同组织的糖类需要量也不同，实 验时要根据配方规定按量称取，不能任意 取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制 定配方时要给予考虑。在大规模生产时， 可用食用的绵白糖代替。
1．吲哚乙酸（IAA）:是从植物中提取出来的，它 在高等植物中普遍存在，在幼嫩的生长旺盛的部 位含量更高。 优点：对器官形成的副作用较小 缺点：易受体内酶的分解，受光易氧化，在高温 高压的灭菌中热稳定性较差，并且其药剂 的活性也较低，可能是最弱的激素。 而人工合成的生长素则不会受到酶的分解，高温 高压下表现也比较稳定。所以在组织培养中通常 使用人工合成的类似物，如IBA 、NAA和2,4-D。
植物组织培养培养基及其配制
微量元素指小于0.5mmol/L的元素，Fe,B,Mn,-Zn、Cu,Mo,-Co等-铁是一些氧化酶、细胞 素氧化酶、过氧化氢酶-等的组成成分；是叶绿素形成的必要条件。对胚-的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用-供 物：鳌合铁FeSO4·7H,0+Na2一EDTA在-制做培养基时不用Fe2SO43,-和FeCl,因其在H值5.2以上，易形成FeOH田3的不溶性沉淀-B,Mn,Zn,Cu,Mo,Co等：也是植物组织培-养中不 缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、-发育异常现象
3K-作用：对碳水化合物合成、-转移、以及氮素代-谢等有密切关系。一般为1一3mg-/L为好-供应物质：K I、KNO,等盐类提供-4Mg、S和Ca-Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；-S-是含S氨基酸和蛋 质的组成成分。-Ca-是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂-保护质膜不受破坏有显著作用
二、培养基的成分-水、无机盐、有机物、天然复合物、-植物激素、培养体的支持材料、抗生素、-活性炭等。
一水-是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过-程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺-少的物质-配制培 基母液时要用蒸馏水，以保持母液及-培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质-大规模生产时可用自来水。但在少 研究上尽-量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
肌醇yo-inosltol又叫环己六醇-作用：-能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽-的形成-对组织和细胞的 殖、分化有促进作用。-对细胞壁的形成也有作用。-使用浓度：一般为1OOmg/L,
氨基酸almino acide是很好的有机氮源-可直接被细胞吸收利用-常用的氨基酸：甘氨酸，-其他的如精氨 、谷-氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸-等也常用-水解乳蛋白或水解酪蛋白：它们是牛乳用酶法-等加工 水解产物，是含有约20种氨基酸的混-合物，用量在10-1000mg/L之间。由于它们-营养丰富，极易引起污 。如在培养中无特别-需要，以不用为宜
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H H H N S O O N
CH3 CH 3 COOH
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• 青霉素合成中用玉米浆，因玉米浆中含有 苯乙胺，其被优先结合到青霉素分子中， 提高了青霉素G的产量。 • 另有半胱氨酸及缬氨酸
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CH3 CH 3 COOH
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第二节
培养基的配制原则
一.营养物质应满足微生物的需要 不同营养类型的微生物对营养的需求差 异很大，所以，应根据所培养菌种对各营 养要素的不同要求进行配制。如自养微生 物的培养基成分是无机的，而异养型微生 物的培养基成分必须含有机物。 针对四大类微生物，一般可以采用现成 配方的培养基。如细菌采用肉汤蛋白胨培 养基、放线菌采用高氏1号合成培养基、酵 母采用麦芽汁培养基及霉菌采用查氏合成 培养基。
第二章 培养基
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第一节 培养基的成分及来源
• 1．定义：培养基是人工配制的供微生物或 动植物细胞生长，繁殖，代谢和合成人们 所需产物的营养物质和原料，同时，培养 基也为微生物等提供除营养外的其它生长 所必须的环境条件。 • 2．培养基要求 （1）都必须含有作为合成细胞组成的原料 （2）满足一般生化反应的基本条件，如C、 N源，无机盐、生长因素
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（2）无机氮源
• • • • • 1）种类：铵盐、硝酸盐和氨水等。 无机氮源比有机氮源吸收利用快 无机氮源称为迅速利用N源 有机氮源称为缓慢利用N源 生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成酸性物质无机氮源称为生理酸性物质
• 生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成碱性生物的无机氮源称为生理碱性物质
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二.营养物的浓度及配比应恰当 营养物的浓度太低，则不能满足 微生物生长的需要，浓度太高，又会 抑制微生物的生长。如糖和盐都是良 好的营养物质，但是，浓度升高，则 有抑菌作用。
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在设计营养物配比时，还应该考虑 避免培养基中各成分之间的相互作用。 如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会 与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉 淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或 氨基酸也会相互作用产生褐色物质。 在培养基配制时，可添加化学试剂补 充宏量元素。其中，首选的是K2HPO4和 MgSO4，因为它们包含了四种宏量元素。 对于微量元素，一般化学试剂、水及器 皿上均有存在。
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• 工业微生物绝大部分为异养微生物，需糖、 蛋白质，前体等物质，微量元素，提供能 量和构成特定的需要 • 一、碳源 • 二、氮源 • 三、无机盐及微量元素 • 四、前体促进剂和抑制剂
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一、碳源
• 1、种类：各种糖、纤维素水解物、油脂、 有机酸、低碳醇 • 2、作用：用来供给菌种生命活动所需的能 量，构成细胞及代谢产物。是发酵的主要 原料之一。 • 不同菌株对不同C源利用不一样
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四.根据培养的目的 培养基的成分直接影响着培养的目标。在设计培养基时 必须考虑是要培养菌体，还是要积累产物，是实验室培养还是 大规模发酵等问题。 用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，尤其是氮 源含量宜高。即碳氮比值低。相反，用于积累大量生产代谢产 物的发酵培养基，它的氮源一般应比种子培养基稍低。当然， 若发酵产物是含氮化合物时，有时还应该提高培养基的氮源含 量。 在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是初级代谢 产物，还是次级代谢产物。若是次级代谢产物还要考虑是否加 入特殊元素(如维生素B12中的Co)或特定的前体物质(如生产卞 青霉素时，应加入苯乙酸)。 在设计培养基尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应 重视培养基中各种成分的来源和价格，应该优先选择来源广泛、 价格低廉的培养基，提倡“以粗代精”，“以废代好”。 22
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（1）有机氮源
• 种类：花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白质、尿素 等，其在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成AA，被菌 体吸收后再进一步分解代谢。 • 其除含Pr外，还含少量糖、脂肪、无机盐、维生素及某些 生长因子，因而以有机氮源为培养基，菌生长旺盛，菌浓 度增长迅速，有可能微生物可直接利用AA为骨架，且某 些微生物对AA有特殊需要，如β—内酰胺类抗生素——青 霉素合成中用玉米浆，因玉米浆中含有苯乙胺，其被优先 结合到青霉素分子中，提高了青霉素G的产量。 • 由一个β内酰胺环和一个四氢噻唑环（5员环）组成，青霉 素G由苯乙胺、半胱氨酸、缬氨酸组成。
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1.天然培养基(natural medium) 凡利用生物的组织、器官及其抽取 物或制品配成的培养基，称为天然培养基。 优点是配制方便、经济、营养丰富，但是， 它的化学成分不清楚或不稳定(受产地、品 种、保存加工方法等因素影响)。常见的天 然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、 麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃 薯等。实验室常用牛肉膏、蛋白胨及酵母 膏等。
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二、氮源
• 1．种类：有机氮源、无机N源 • 2．作用：用来构成菌体的细胞物质（AA、Pr核酸）和含 N代谢物（包括含N的抗生素，如链霉素） • 3．不同氮源差别 （1）有机氮源 （2）无机氮源 • 注：C/N比在工业上C一般指总糖还原糖，N一般指N源原 料，粗蛋白含量。 • 而不是实验室指的C、N元素之比。 • 在考察培养基组成时，人们常以碳氮比作为一个重 要的指标。一般培养基的C/N比为100：0.5-2；在谷氨酸 生产菌发酵中，C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积 累量较少；当C/N为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大 量积累。
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三、无机盐及微量元素
• 1．作用：微生物在生长繁殖和生产过程中， 需要某些无机盐和微量元素如P、Mg、S、 K、Ni、Fe、Cl、Zn、Mn、Co等从作为其 生理活性物质的组成或生理活性作用的调 节物。一般低浓度时对微生物合成，产物 形成促进。 • 高的浓度时对微生物合成产物形成抑制。 • 2．各种元素的作用
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3.半合成培养基(semi-defined medium) 由部分天然材料和部分已知的纯化 学药品组成的培养基称为。例如，培养 真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。严格地 讲，凡含有未经特殊处理的任何合成培 养基，实际上都只是一种半合成培养基。 特点是配制方便，成本低，微生物生长 良好。发酵生产和实验室中应用的大多 数培养基都属于半合成培养基。
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• （1）缓慢利用碳源的使用，（如青霉菌生产采用 乳糖，放线菌采用半乳糖） • （2）流加葡糖，如青霉素流加葡萄糖的母液； • （3）用混合碳源：用混合碳源：把快速利用碳源 与慢速利用碳源加在一起。 • 如青霉素采取葡萄糖+乳糖 • 土霉素 葡萄糖+淀粉 • 放线菌素 葡萄糖+半乳糖 • 快速利用碳源在菌体生长过程作为碳的来源。 • 慢速利用碳源在产物合成过程作为碳的来源。 • 不同种类碳源其分解氧化后，对PH影响不同（升 高或降低）
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四、前体促进剂和抑制剂 • 1．前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，可直接被 微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身 的结构并没有多大变化，但产物的产量却因加入前体而有 较大的提高， • 2．促进剂：即不是营养体，也不是前体，却能提高产量 的添加剂。 • 3．抑制剂 在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径进行，同时 使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物，或 使正常代谢的某一中间代谢产物积累起来。 在甘油发酵中加入NaHSO3其与乙醛生成加成物，使乙醛 不能成为NADH2（还原型辅酶I）的受氢体，使NADH2在 细胞中积累，激活α-磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟 基丙酮取代乙醛成为NADH2的受氢体，还原为α-磷酸甘油 13 再水解形成甘油。
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调节K2HPO4和KH2PO4两者浓 度比，可获得从pH6.0到pH7.6间一系 列稳定的pH，当两者等摩尔浓度比时， 溶液的pH可稳定在6.8。 其反应式如下： K2HPO4 + HCl -----> KH2PO4 + KCl KH2PO4 + KOH ----> K2HPO4 + H2O
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甘蔗糖 蜜 甜菜 糖蜜
2.合成培养基(synthetic medium) 使用成分完全了解的化学药品配制 而成的培养基称为合成培养基。合成培 养基的优点是：成分已知、精确、重复 性好。但价格较贵，培养的微生物生长 较慢。适用于实验室进行微生物生理、 遗传育种及高产菌种性能的研究。培养 放线菌的高氏一号培养基和培养真菌的 察氏培养基都属于合成培养基。
第三节 培养基的类型及选择
• 一、培养基成分和配比选择 • 影响因素包括：组成成分，配比，缓冲能 力，粘度，消毒是否易彻底，消毒后营养 破坏程度，及原料中杂质 的含量对菌生长 和产物合成的影响。 • 通过小试，对单因子试验及正交试验来确 定培养基组分和浓度，考虑各方面因素。
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二、 培养基的种类 培养基的种类繁多。因考虑的角度不 同，可将培养基分成不同的类型。
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2．各种元素的作用
• ①P：是核酸和Pr的必要成分，也是重要的能量传递者— ATP的成分，在代谢途径的调节方面起重要作用。 • ②Ca：可控制细胞透性。 • ③Mg：许多重要酶的激活剂，细菌芽孢的重要组成成分。 • ④S：含硫AA的组成和某些酶（CoA）的活性基。 • ⑤Fe：细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分。 • ⑥Cl：嗜盐菌必需；改善啤酒口味。 • ⑦Na+、K+：钠维持渗透压，钾渗透压和透性。 • ⑧微量元素：酶的辅基和激活剂，机体对其需求很少，称 之为微量。
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三.物理化学条件适宜 pH值 各大类微生物一般都有它们生长繁殖的最 适pH。细菌的最适pH一般在7.0-8.0，放线菌 在pH7.5-8.5间，酵母菌在pH3.8-6.0间，霉菌 在pH4.0-5.8之间。对于具体的微生物菌种来说， 它们都有各自特定的最适pH范围，有时会大大 突破上述界限。 在微生物生长繁殖过程中会产生引起培养 基pH改变的代谢产物，尤其是不少微生物有很 强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑 制甚至杀死其自身。在设计它们的培养基时， 就要考虑到培养基的pH调节能力。一般应该加 入磷酸缓冲液或CaCO3，使培养液的pH 稳定。