生物有机化学氨基酸的分析方法综述
生物分析化学
与茚三酮的显色反应
α-氨基酸与茚三酮的水合物在水溶液中加热时， 生成蓝紫色或紫色化合物，同时产生醛、二氧化 碳和氨。这个反应非常灵敏，是鉴定氨基酸最迅 速、最简单的方法，常用于α-氨基酸的比色测定 或纸层析、薄层层析时的显色。
三．氨基酸分离分析方法
原因：氨基酸种类多 结构较相似 不经分离，难以直接分析
分离与检测
衍生后的氨基酸一般在高效C18或C8柱上， 根据液液分配原理进行分离。流动相多以乙酸盐 或磷酸盐缓冲液为主，以乙睛、甲醇或四氢呋喃 为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合 物的特点，故除改变调节剂的比例外，还可通过 调节缓冲液pH值，离子强度、柱温等使之达到理 想的分离
邻苯二甲醛
异硫氰酸苯酯
先将氨基酸进行柱前衍生，使之与带有疏水基 团的衍生剂反应生成利于在反相柱上保留、分 辨的化合物，经柱分离后，再根据衍生物的光 学特性选择相应的检测器进行检测、定性与定 量。
目前国内外应用最广、影响最大的柱前衍生剂有 邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、 二硝基氯苯（PDNB）和二甲基氨基偶氮苯磺酞氯 等。
通过改换Li+ 缓冲液体系可分离。
衍生与检测
多数氨基酸没有生色基团，因此在紫外可见光区 无吸收（在常规蛋白水解氨酸中只有苯丙氨酸 ,酪 氨酸和色氨酸三个有紫外吸收），必须将之衍生、 转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质 才能检测分析。
常用的衍生法
茚三酮法：经色谱柱分离的氨基酸与茚三酮溶液 混合、加热后，多数a一氨基酸可与茚三酮反应生 成兰紫色的化合物，其最大吸收波长为570nm，a 一氨基酸与茚三酮的反应方程式如下：
蛋白质结构的复杂性
分子中含有 100多个氨基酸的残基 具有特定的构型 可分为四级结构
氨基酸分析方法
氨基酸背景知识简介
❀ 手性氨基酸
✎ 人们发现组成蛋白质的氨基酸都是α-型氨基酸(即 氨基与羧基旁的碳相连)并且除甘氨酸外,其α-碳原 子都是不对称的,即都具有旋光性(手性),研究表明: 只有L型氨基酸参与蛋白质的组成,故组成蛋白质的 氨基酸,除甘氨酸外都是L-型氨基酸.
氨基酸分析的重要性
❀ 氨基酸是构成蛋白的基本要素
AccQ·Tag的色谱条件
❀ 色谱柱: AccQ-Tag C18, 3.9×150mm
✎ 洗脱剂 A: 140mM 醋酸钠/17mM 三乙胺 pH 5.05 ,用稀H3PO4
✎ 洗脱剂 B: 乙腈 ✎ 洗脱剂 C: 水
❀ 柱温: 37°C
✎ 流速 = 1.0 ml/min ✎ 梯度洗脱
AccQ衍生氨基酸标样的色谱图
分离衍生困难
低 pmole 低 pmole 低 pmole 低 pmole 高 fmole 低 pmole
困难
致癌物质
简单快速
只能用于一级 氨，稳定性差
室 温 反 应 ， 需要液-液萃取
要萃取
除取过量试剂
多步室温反 应
反应步骤多
加热，单步 反应
分离较慢
加 热 ， 多 步 复杂步骤，反
反应
应产物多
Waters氨基酸分析概况
✎ 可测定蛋白分子中各种氨基酸的个数 ✎ 用来做蛋白定量
❀ 关键的代谢介质
✎ 重要的诊断依据 ✎ 营养研究
❀ 营养价值
✎ 动物饲料，宠物食品 ✎ 静脉输液，植物生理 ✎ 婴儿食品
氨基酸定量分析的需求
❀ 为什么要测定浓度？
✎ 营养成分的确定 - 食品、饲料或药物的质量 ✎ 蛋白营养成分的质量或性质 ✎ 计算蛋白的含量 ✎ 测定多肽含量 ✎ 计算蛋白的氨基酸组成，支持序列分析 ✎ 特征活性的测定，用于医院病理分析
生物有机化学氨基酸的分析方法综述
生物有机化学氨基酸的分析方法综述A Review on Amino acid Analysis Methods摘要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。
本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。
关键词:氨基酸分析方法综述Abstract：The analysis methods of amino acids are very important in ream of industry, agriculture and life science. Inthis paper，the analysis methods of amino acid are reviewed，with focus on chemistry method, spectrophotometry method, chromatography method and electrochemistry method.Key words: amino acids;analysis;review1 前言氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。
作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。
各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L 一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱( IEC) [1]、高效液相色谱(HPLC) [2] 或气相色谱(GC) [3]等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。
然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱, 自身又无荧光,因此不能直接检测。
通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。
电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。
氨基酸分析的检测方法评述
文章编号:1004-7964(2004)03-0039-05收稿日期:2003-11-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)经费资助,课题编号:2001AA647020四川大学青年基金,课题编号:H2002[9-057]第一作者简介:戴红,女,1966年出生,副教授。
主要研究方向:分析检验。
氨基酸分析的检测方法评述戴红,张宗才,张新申(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学),四川成都610065)摘 要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。
关键词:氨基酸;检测;分析中图分类号:Q517;Q503 文献标识码:ADetermination M ethods of Amino A cids A nalysisDA I Hong ,ZHA N G Zong 2cai ,ZHA N G Xi n 2shen (Key L aboratory of L eather Chemist ry and Engi neeri ng(S ichuan U niversity ),M i nist ry of Education ,Chengdu 610065,Chi na )Abstract :Determination methods for amino acids ,including chemistry determination ,elec 2tric 2chemistry determination ,spectrophotometer determination and conductivity detection method were reviewed for the sake of improving the analysis sensitivity and accuracy.The paper aimed at providing useful reference to building a fast and effective amino acids aualytic methods.K ey w ords :amino acid ;analysis ;determination 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质,氨基酸分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义,广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析,并且用于皮革化学鞣革机理的研究中[1,2,3]。
常见的生物化学实验方法
常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。
本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。
一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。
常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。
在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。
例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。
二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。
常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。
在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。
例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。
三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。
常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。
在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。
例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。
四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。
常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。
在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。
例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。
有机化学氨基酸分析
有机化学氨基酸分析1.色谱法色谱法是一种广泛使用的氨基酸分析方法，主要包括气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。
气相色谱法：气相色谱法主要适用于描绘和鉴定原料氨基酸的种类、含量和结构等信息。
在该方法中，氨基酸样品首先通过酸水解生成对应的酸，然后酸再经甲醇酯化生成甲酯化酸。
最后通过气相色谱分离并检测酸甲酯化物。
液相色谱法：液相色谱法主要适用于定量分析氨基酸含量。
液相色谱法将氨基酸样品进行衍生化反应，如酰氯化反应或酸酐酯化反应，生成稳定的色氨酸酰胺衍生物，然后分离并检测各个衍生物。
2.光谱法主要包括紫外-可见吸收光谱法、红外光谱法和核磁共振光谱法等。
这些方法可以用于研究和确定氨基酸的结构和功能。
紫外-可见吸收光谱法：氨基酸溶液在特定波长范围内对紫外或可见光的吸收程度可以用来定量分析氨基酸的含量。
红外光谱法：红外光谱法可以用来研究氨基酸分子中的官能团和结构信息。
核磁共振光谱法：核磁共振光谱法可以提供关于氨基酸分子中原子的化学位移和耦合常数等信息。
3.电化学法电化学法主要包括电位滴定法和电化学发光法。
电位滴定法：通过测定氨基酸溶液的电化学行为，如氧化还原电位的变化，可以定量分析氨基酸的含量和测定其在酸碱条件下的酸解离常数。
电化学发光法：氨基酸在特定条件下通过电化学反应发光，凭借发光的强度可以定量分析氨基酸的浓度。
4.质谱法质谱法主要包括质子化时间飞行质谱法（PIT-TOFMS）和质子化辅助激光解吸电离质谱法（PALDIMS）等。
质子化时间飞行质谱法：PIT-TOFMS可以在非常短的时间内通过氨基酸分析样品中的氨基酸类型和含量。
该方法的优势在于可以同时测定样品中的多种氨基酸。
质子化辅助激光解吸电离质谱法：PALDIMS利用激光对氨基酸样品进行解离和电离，然后通过质谱仪进行质量分析。
该方法可以提供对氨基酸的结构、组成和含量等信息。
综上所述，有机化学氨基酸分析方法包括色谱法、光谱法、电化学法和质谱法等。
这些方法可以用于氨基酸的种类、含量、结构和功能的研究和分析。
四氯苯醌检测氨基酸的原理_概述及解释说明
四氯苯醌检测氨基酸的原理概述及解释说明1. 引言1.1 概述在生物化学研究领域中，氨基酸是一类重要的有机分子，对于生命体的组成和功能至关重要。
因此，准确、快速地检测氨基酸是许多研究人员关注的焦点。
本文将介绍一种利用四氯苯醌来检测氨基酸的方法，该方法具有高灵敏度、高选择性和简单操作的特点。
1.2 文章结构本文共分为五个部分，每个部分都探讨了四氯苯醌检测氨基酸的原理及其应用。
首先，在引言部分我们将给出一些关于文章主题的概述，并解释文章各个章节之间的逻辑结构；然后，在第二部分中详细描述了四氯苯醌检测氨基酸的原理；接下来，在第三部分中介绍了实验步骤和方法；在第四部分中，我们将阐述目前该方法在应用领域上所取得的进展，并展望未来可能进行的研究方向；最后，在第五部分里总结实验结果并提出改进建议。
1.3 目的本文旨在深入探讨四氯苯醌检测氨基酸的原理，并介绍该方法的实验步骤和优势。
通过本文的阐述，读者将对该方法有一个全面的了解，并为其在相关领域中的应用提供参考。
此外，本文还对未来可能进行的研究方向和发展趋势进行了展望，并提出一些改进建议，以期促进该方法在氨基酸分析中的应用与发展。
2. 四氯苯醌检测氨基酸的原理2.1 氨基酸的组成和特性氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，其结构由一个氨基（NH2）基团、一个羧基（COOH）和一个侧链组成。
氨基酸的侧链可以是不同的化学结构，决定了每种氨基酸的独特特性和功能。
2.2 四氯苯醌的原理及其与氨基酸的反应机制四氯苯醌（p-chloranil）是一种常用于检测氨基酸的试剂。
它通过与氨基酸中含有活泼亲电子反应位点（如芳香族或硫代谷胱甘肽等）发生反应来检测氨基酸。
具体反应机制如下：四氯苯醌作为强亲电试剂，在碱性条件下与含有活泼亲电子位点的氨基酸（或者是蛋白质中暴露在溶液表面上的游离端）发生加成反应。
该反应会导致四氯苯醌还原并形成彩色产物。
这个彩色产物的吸光度与氨基酸的浓度成正比关系，因此可以通过测量吸光度来确定氨基酸的含量。
生物化学与分子生物学-实验指导
生物化学与分子生物学-实验指导实验一氨基酸纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。
二、实验原理纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。
为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。
氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。
原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离Rf =三、药品器材 1实验器材层析滤纸（新华1号）、喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。
2实验试剂(1)氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液（各组分浓度0.5%）。
(2)展层剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2 (3)显色剂:0.5g茚三酮溶于100mL无水丙酮，贮存于棕色瓶中备用。
二硫代二丙酸_氨基酸__理论说明
二硫代二丙酸氨基酸理论说明1. 引言1.1 概述在化学领域中，二硫代二丙酸和氨基酸是两个重要的研究方向。
二硫代二丙酸是一种含有硫元素的有机化合物，具有特殊的结构和性质，在许多生物和工业过程中发挥着关键作用。
而氨基酸则是构成蛋白质的基本组成单元，对生命体的正常运作至关重要。
本篇长文将详细探讨二硫代二丙酸和氨基酸的理论说明，包括它们的定义、性质、合成方法以及应用领域等方面内容。
其中，将特别着重介绍二硫代二丙酸在氨基酸合成中的作用及其反应机理，并分析实验室合成案例，并展望其在工业应用方面的前景。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行叙述。
首先，在引言部分（第一部分），将介绍文章整体结构以及研究目的；其次，在第二部分中，我们会对二硫代二丙酸进行理论说明，包括对其定义、性质和合成方法进行详细介绍，并展示其在不同领域的应用。
接下来，第三部分将着重概述氨基酸的结构和分类、生物合成途径以及生物功能和作用机制等方面内容。
随后，我们会探究二硫代二丙酸在氨基酸合成中的具体作用，并讨论反应机理、催化剂选择，以及实验室合成案例和工业应用前景（第四部分）。
最后，在结论部分（第五部分），我们将总结关键要点，对研究方向和进展进行展望，并强调研究意义和两者的应用价值。
1.3 目的本文旨在全面了解并阐述二硫代二丙酸与氨基酸这两个重要化学领域的理论知识。
通过对二硫代二丙酸及其合成方法、性质以及应用领域进行详细说明，以及对氨基酸结构分类、生物合成途径和功能机制等方面的概述，我们可以更好地认识到这两个研究领域的重要性，并深入探讨了二硫代二丙酸在氨基酸合成中所起到的作用与影响。
通过本篇文章的阅读和学习，我们将能够更加深入地了解这些重要化合物，并为未来的研究和应用提供有益的参考。
2. 二硫代二丙酸的理论说明2.1 定义和性质二硫代二丙酸是一种有机化合物，化学式为C3H6O2S2。
其结构中含有两个硫原子和一个羧基。
它是无色至浅黄色的液体，具有刺激性气味。
生物化学实验 实验- 氨基酸纸层析(含实验室规则)
溶剂系统pH会影响极性基团的解离
除此之外，滤纸及温度和层析时间，都会对Rf值产生影响。
三、实验试剂及器材
1.试剂 0.5%（W/V茚三酮溶液 标准氨基酸溶液： (1)0.4%Ala, (2)0.4%Leu, (3)0.4%Asp 氨基酸混合液： Ala，Leu, Asp混合配制 溶剂系统：正丁醇：88％甲酸：水(15：3：2，V/V)
2.层析法的种类：
依据被分离物性质不同分为：吸附层 析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层 析、分配层析、聚焦层析
依据操作方式不同又分为：纸层析、 柱层析、薄层层析
3.分配层析
利用混合物中各组分在两个互不相溶的溶剂中溶 解性能不同，即分配分配系数不同，而将其分开。
分配系数
当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时， 它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这 种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数。该 常数就是分配系数
格式：
实验序号、实验名称
实验目的 实验原理 主要仪器及试剂配制 操作方法与实验步骤 结果与讨论
一、实验目的
了解层析法分离混合物的基本原理 学习分配层析的基本原理 掌握氨基酸纸层析的操作技术
二、实验原理
1.层析原理
利用混和物中各组分的理化性质（分子大小， 形状、分子极性，吸附力，分子亲和力和分配系 数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不 同从而达到分离。层析分离中的一个相是固定的， 称为固定相，另一相是流动的，称为流动相。当 流动相流经固定相时，各组分由于性质不同，移 动速度不同，从而使之分开。
2.器材 层析缸、毛细管、电吹风
四、实验操作
点样
展层
显色
用铅笔在距滤纸一边 1.5厘米处划线，并等距 离划4个点，毛细管吸样 品（约2cm高）点样， 直径小于0.5cm，冷风 吹干，重复一次。干燥 后将滤纸卷成圆形，缝 合滤纸，注意两边缘不 能接触。
氨基酸的一般代谢及对生物体的意义
《生物化学》作业氨基酸的一般代谢及对生物体的意义班级学号姓名摘要有人说，人就是一堆蛋白质。
这个说法虽然说夸张了点，但是也说明了蛋白质在人体以及生物体内的重要性。
在生物体的降解代谢过程中,蛋白质代谢十分重要,所谓蛋白质代谢,是指已有蛋白质的降解和新蛋白质的合成。
体内蛋白质不断降解,又不断合成,二者处于动态平衡中。
蛋白质代谢使各种蛋白质得到自我更新,也使细胞中蛋白质组分得到转换,这对于机体新组织、细胞形成及机体生长发育有十分重要的意义。
蛋白质降解产生的氨基酸进一步分解或做为能源或转化为其它氮化物合成前体,因此蛋白质的代谢实质上就是氨基酸的代谢。
下面简单地讨论一下各种氨基酸的代谢过程及意义。
氨基酸的分类氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。
是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基连在α-碳上。
构成蛋白质的氨基酸都是一类含有羧基并在与羧基相连的碳原子下连有氨基的有机化合物，目前自然界中尚未发现蛋白质中有氨基和羧基不连在同一个碳原子上的氨基酸。
人体内蛋白质主要由20中氨基酸组成。
谷氨酸Glutamicacid Glu E赖氨酸Lysine Lys K精氨酸Arginine Arg R组氨酸Histidine His H氨基酸的一般代谢及意义一、体内氨基酸的动态平衡：（一）氨基酸的来源与去路：1、氨基酸的来源：①食物消化吸收；②组织蛋白分解；③营养非必需氨基酸合成等。
2、氨基酸的去路：①合成组织蛋白；②转变为非蛋白含氮物质。
③氧化分解或转化为糖或脂肪。
蛋白质降解成氨基酸后,氨基酸可通过脱氨基和脱羧基作用进一步分解。
二、氨基酸脱氨基作用α-氨基酸分子上的氨基被脱去生成α-酮酸和氨的化学反应，称氨基酸脱氨基作用。
氨基酸的脱氨基作用主要包括氧化脱氨基、转氨脱氨基、联合脱氨基等，这是氨基酸主要的转化方式。
实验室和工业中制备氨基酸的方法
实验室和工业中制备氨基酸的方法在生命科学领域中，氨基酸是一种非常重要的有机化合物。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，同时也是许多生物活性物质的重要组成部分。
因此，制备氨基酸是生命科学研究中的一项重要课题。
要制备氨基酸，我们可以通过实验室合成或者工业生产两种途径。
下面我们将分别介绍这两种方法。
实验室合成氨基酸在实验室中制备氨基酸，我们需要用到一些基本的有机化学实验技术和仪器设备。
其中，氨基酸的合成多采用基于芳香族化合物的合成方法，这种方法的优点是易于操作且转化率较高。
以苯甲酸合成酪氨酸为例，首先将苯甲酸与乙酸酐加热混合，形成酰基乙酸。
然后，加入苯甲酰氯和亚氨酸，反应生成酰基氨基酸。
最后，水解得到酪氨酸。
然而，实验室合成氨基酸的转化率较低，而且操作过程中易出现多余反应，导致产物纯度低。
因此，在工业应用中，一般采用发酵或化学还原等方法制备氨基酸。
工业生产氨基酸在工业上制备氨基酸，主要采用的方法是利用微生物发酵生产或化学合成法。
发酵法制备氨基酸的关键步骤是选择适当的微生物菌种和培养条件。
以赖氨酸为例，赖氨酸是人体必需的氨基酸之一，是很多营养添加剂的重要成分。
发酵生产赖氨酸的菌种主要是大肠杆菌和芽孢杆菌等，发酵条件包括温度、pH值、营养物质浓度等。
发酵结束后，可通过蒸馏或纯化等方法得到高纯度的赖氨酸。
化学合成法制备氨基酸是对基础有机化学合成反应的一种应用。
以谷氨酸为例，化学合成法中，通过化学反应将苯氨酸和异戊酸酐合成前体物，然后在酸催化下，将前体物与氨基溶液反应生成谷氨酸。
相较于发酵法，化学合成法制备氨基酸具有反应纯度高和反应途径短的优点。
此外，在工业上制备氨基酸还可以采用微生物菌株基因改造，提高其产酸能力，从而实现大规模生产氨基酸。
但这种技术应用受到一些道德、法律和生态等诸多因素的影响，在建立伦理监管机制前，需要慎重思考。
总之，实验室合成和工业生产是两种制备氨基酸的方法。
与实验室合成相比，工业生产有更高的转化率和纯度。
生物化学实验氨基酸的纸层析法
生物化学实验氨基酸的纸层析法实验氨基酸的纸层析法一、目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。
纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。
展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。
有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法;有上向下移动的，称为下行法。
将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。
在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变)，不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值)Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。
这种方法称为双向层析法。
本试验主要介绍的是单向层析法。
其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
、实验仪器三1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸溶液(甘氨酸，苯丙氨酸)，甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v)3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、试验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点(原点)。
2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。
3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层(大约2~3小时)。
18种氨基酸检测方法
18种氨基酸检测方法【原创版4篇】目录（篇1）I.氨基酸检测方法概述1.氨基酸是生命中必不可少的有机化合物2.18种氨基酸是人体必需的营养物质3.氨基酸检测方法的研究意义II.氨基酸检测方法介绍1.传统检测方法2.现代检测方法3.新型检测方法III.氨基酸检测方法优缺点分析1.传统检测方法的优缺点2.现代检测方法的优缺点3.新型检测方法的优缺点IV.氨基酸检测方法应用前景展望1.在医疗领域的应用2.在食品行业的应用3.在其他领域的应用正文（篇1）一、氨基酸检测方法概述氨基酸是生命中必不可少的有机化合物，它们在人体内扮演着重要的角色。
人体内有18种氨基酸，其中一部分是由身体自身合成的，而其余的部分必须从食物中摄取。
因此，氨基酸检测方法的研究对于了解人体健康状况具有重要意义。
传统的氨基酸检测方法较为繁琐，需要耗时费力，而现代的检测方法则更加快速、准确、简便。
例如，高效液相色谱法、质谱法等。
此外，近年来还出现了一些新型的检测方法，如表面增强拉曼光谱法、近红外光谱法等。
二、氨基酸检测方法介绍1.传统检测方法：传统的氨基酸检测方法主要包括化学法、电泳法、色谱法等。
化学法是通过测定氨基酸的化学反应来测定其含量，但操作繁琐、误差较大；电泳法是通过氨基酸在电场中的迁移率来测定其含量，但需要消耗大量的样品；色谱法是通过氨基酸在色谱柱中的分离来测定其含量，但需要消耗大量的样品。
2.现代检测方法：现代的氨基酸检测方法主要包括高效液相色谱法、质谱法等。
高效液相色谱法是一种基于色谱分离技术的分析方法，可以快速、准确地分离和测定多种氨基酸；质谱法是一种基于质谱分离技术的分析方法，可以同时测定多种氨基酸，但需要消耗大量的样品。
3.新型检测方法：新型的氨基酸检测方法主要包括表面增强拉曼光谱法、近红外光谱法等。
表面增强拉曼光谱法是一种基于拉曼散射技术的分析方法，可以在不破坏样品的情况下快速、准确地测定多种氨基酸；近红外光谱法是一种基于光学技术的分析方法，可以在不破坏样品的情况下快速、准确地测定多种氨基酸。
有机化学氨基酸分析
有机化学氨基酸分析氨基酸是生物体中重要的有机化合物之一，它具有结构多样性和功能多样性，广泛参与生物体内的代谢过程和各种生物学功能。
因此，研究和分析氨基酸在生物体内的存在和含量是生物化学和生物医学领域的重要课题之一氨基酸普遍具有两个基团：氨基基团和羧基基团。
氨基基团(-NH2)能够与酸性物质发生酸碱反应，而羧基基团(-COOH)可以与碱性物质反应。
因此，氨基酸可以在不同的pH环境下呈现出不同的离子化状态。
氨基酸分析的方法有很多种，其中最常用的方法是色谱法。
色谱法是基于物质在固定相和流动相之间相互分配过程的一种分离和测定方法。
氨基酸分析常用的色谱法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。
气相色谱法是通过将氨基酸样品蒸发成气体态后，通过柱子分离各个氨基酸，并通过检测器进行定量测定。
GC法的优点是分离效果好、分析速度快，但需要样品具有较好的挥发性。
对于挥发性较低的氨基酸，通常需要先进行酸水解或酶解处理。
高效液相色谱法是通过将氨基酸溶解在流动相中，通过柱子分离各个氨基酸，并通过检测器进行定量测定。
HPLC法与GC法相比，对样品要求较低，适用范围更广。
HPLC法可以在较低的温度下进行分析，避免了氨基酸的热解和挥发损失。
除了色谱法外，还可以使用质谱法进行氨基酸分析。
质谱法是通过将氨基酸样品蒸发成气体态后，通过质谱仪进行分析。
质谱法的优点是分辨率高、灵敏度高，可以分析低浓度的氨基酸。
质谱法可以通过离子反应进行定量测定。
此外，还可以使用光谱法进行氨基酸分析。
光谱法是利用物质吸收、发射或散射光的特性进行分析的一种方法。
氨基酸中苯环的吸收或蛋白质中色氨酸的荧光可以用于氨基酸的分析。
在氨基酸分析中，常常需要先进行衍生化反应，将氨基酸转化为稳定的衍生物，提高其检测灵敏度和分离效果。
常用的衍生反应有酸衍生、酯化、取代反应等。
总结起来，氨基酸的分析方法有色谱法、质谱法和光谱法等。
这些方法各有特点，可以选择合适的方法根据不同的需要进行分析。
纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸纸层析法是一种常用的分离和纯化化学物质的实验方法，被广泛应用于有机合成、生物化学和食品科学等领域。
本文将介绍纸层析法在氨基酸分析中的应用。
一、实验原理氨基酸的分离和鉴定是生物化学实验中常用的手段。
氨基酸分子中含有羧基和氨基，可以通过纸层析法实现其分离。
纸层析法是一种基于物质分子间不同的吸附性能而进行分离的方法。
在纸层析实验中，将试样涂在纸层析片（通常为滤纸）的一侧，并将其放入溶剂（通常为水、丙酮、甲醇等）中，溶剂会沿纸层析片向上移动，分离出不同物质组分。
氨基酸分子的羧基和氨基分别具有不同的亲水性和疏水性，因此在纸层析分离中会表现出不同的吸附行为。
例如，疏水性较强的疏水基团会被生物样品或溶剂吸附，从而较慢地从纸层析片上移动，这些氨基酸通常出现在较高位置；而亲水性较强的羧基团则会被水吸附，因此移动速度较快，这些氨基酸通常出现在较低位置。
二、实验步骤1、制备样品：取大约1mg的氨基酸标准品或被测样品，加入1mL的去离子水中，并轻轻搅拌，制成1mmol/L的溶液。
2、制备纸层析片：取一张长约50cm的滤纸，将其叠成4层，然后将中间部分剪成30cm的长条，每条的宽度为1cm左右，用铅笔在底部标记出位置，离开1cm到1.5cm的距离。
3、涂样：在每个标记位置上滴加不同氨基酸溶液，每次加约5µL。
所有样品均按照氨基酸的相对极性从小到大进行涂样，从左到右编号，以便于鉴定。
4、溶剂选择：选择一种适宜的溶剂，通常为水、丙酮、甲醇等。
将滤纸上端放入溶剂中，约1cm左右的位置即可。
5、开始实验：用三角架和夹子将滤纸张贴在玻璃板上，使其呈现较小的倾斜面。
在滤纸的底部悬挂一张白纸，以便于观察样品在纸层析上的位置变化。
待溶剂无法再升高时，实验结束。
6、结果读取：按照行（从上到下）顺序，观察样品的移动距离。
三、实验结果及分析纸层析法可以分离并识别出存在于试样中的氨基酸分子，在实验中，通过观察样品从纸层析片底部开始向上移动的情况，可以确认每个氨基酸的相对位置和含量。
生物化学经典实验——纸层析法分析氨基酸
2cm
图1. 点 样
展层剂 展层剂 图2. 滤纸的缝合
➢ 3、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的 溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡 (30min) ,否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶 剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发 生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前 沿，影响层析效果。
纸上层析的原理
常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互 溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素 上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附的水相 为固定相, 有机溶剂相为移动相。
由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例有 所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随有 机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多, 移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开
➢ 4、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约
1.5cm） ，液层不要超过点样线，将滤纸点样点 朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂 到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。
➢ 5、显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚
三酮，热风吹干(加快反应)反应显色(或晾干后， 将滤纸放入烘箱中80-100℃，烘烤5分钟后 )，滤 纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。
在相同的条件下，每种物质都有其固定 的Rf值。 Rf值的定义为：
原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
➢影响Rf值的因素有：
①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。
氨基酸的生物有机化学
色氨酸
16
第二节 氨基酸的性质
一 等电点 二 与茚三酮反应
三 氨基酸金属盐络合物的形成 四 氨基酸的重要反应
17
第十七页，课件共62页
总述：具有胺和羧酸的共性。例如形成酰胺
+
- - 2H2O
2 H3NCH2COO
O
NH HN
2分子甘氨酸
O 2,5-二嗪哌酮
O
HOOCCH2CH2CHCOO-
- H2O
33
第三十三页，课件共62页
6.与醛反应生成西佛碱(Schiff’s base)
R1CHO
COOH
H2N R
COOH R1 N R
Schiff’sw base
34
第三十四页，课件共62页
7.叠氮反应
O R
O NHY
NH2NH2H2O
OH
R
N
O NH2
NHY
HNO2
O
R
N- N
ON
+
NHY
35
第三十五页，课件共62页
四 盖布瑞尔法
RCHCOOH Br
NH3
在封管或高 压釜内进行
RCHCOOH NH2
O
O
NK O
H3O+
+ RCHCOOCH3 Br
N CHCOOCH3
O
R
COOH COOH
+ + NH3CHCOO- + CH3OH R
应用盖布瑞尔法可以制备很纯的氨基酸。
40
第四十页，课件共62页
五 丙二酸酯法
1. 通过酰基丙二酸酯法
37
第三十七页，课件共62页
氨基酸质谱
百泰派克生物科技
氨基酸质谱
氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同种类和数量的氨基酸通过不同的排列方式组成了不同种类的功能多样的蛋白质。
除了作为蛋白质的基本组成单位之外，游离的氨基酸以及氨基酸衍生物也对维持机体的稳态和平衡至关重要，在调节机体生长与免疫方面有着重要作用。
研究表明，异常的氨基酸水平还会引起一些疾病。
此外，氨基酸还可作为保健品和生物制药的原料。
不管是进行蛋白质氨基酸组成测定还是在氨基酸保健品或生物药制造方面，都离开不开氨基酸的鉴定。
氨基酸组成鉴定是分析蛋白质一级结构的基础和前提，也是保证氨基酸类保健品和生物药质量的关键指标。
进行氨基酸鉴定主要包括对其种类和含量进行鉴定，氨基酸质谱就是指利用质谱技术对氨基酸进行分析，高分辨率和高灵敏度的质谱技术通过检测氨基酸的质荷比以及离子峰强度等信息实现定性和定量鉴定，该方法依赖于已知的理论氨基酸质谱数据库，将检测所得的数据与数据库中的数据进行比较，确定氨基酸的种类。
通常结合需要结合色谱技术进行鉴定，如LC-MS以及LC-MS/MS等。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC纳升色谱，提供氨基酸质谱分析服务技术包裹，可实现对超过70种氨基酸及其衍生物进行定量及定性分析，其中涉及到的95%的物质均使用标准品和同位素标准品定量，以保证定量结果的准确性，欢迎免费咨询。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物有机化学氨基酸的分析方法综述A Review on Amino acid Analysis Methods摘要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。
本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。
关键词:氨基酸分析方法综述Abstract：The analysis methods of amino acids are very important in ream of industry, agriculture and life science. Inthis paper，the analysis methods of amino acid are reviewed，with focus on chemistry method, spectrophotometry method, chromatography method and electrochemistry method.Key words: amino acids;analysis;review1 前言氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。
作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。
各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L 一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱( IEC) [1]、高效液相色谱(HPLC) [2] 或气相色谱(GC) [3]等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。
然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱, 自身又无荧光,因此不能直接检测。
通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。
电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。
本文对近年来各种化学方法分析氨基酸已获得的进展进行评述。
2 氨基酸的直接电化学分析对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分析法[4]。
使用循环伏安法[5]可以直接测定L - 半胱氨酸,在pH 值小于7 的磷酸盐缓冲溶液中,在金电极上于0. 96V 处有一氧化峰,在- 0. 75V 左右有一还原峰,氧化峰和还原峰的峰电流的大小与半胱氨酸的浓度成正比。
有研究报道,不经衍生化处理,可以直接检测色氨酸和酪氨酸的含量,分别置聚酰胺修饰的碳糊电极于以0. 2mol/LHCl - CH3COONa (pH = 3. 0) 为底液的色氨酸和酪氨酸溶液中,从0. 5V - 1. 50V 进行循环伏安扫描,色氨酸和酪氨酸分别在0. 94V 和0. 92V呈现一个稳定的氧化峰,随扫描次数的增多,两个氧化峰的峰电流都减小,结合2. 5 次微分技术,色氨酸和酪氨酸的检测限可达到0. 024mol/L 和0. 034mol/L ,相对标准偏差分别为5. 2 %和7. %。
3 氨基酸的间接电化学分析3. 1 通过衍生化反应间接测定多数氨基酸于金属电极上是非电活性的,无法直接测定,一般是采用衍生化反应[6]将其转化成电活性的物质进行间接测定。
例如,赖氨酸是非电活性的,但将其与芳醛进行衍生化反应后,在约0. 3mol/L 的磷酸盐缓冲溶液中(pH = 11) 衍生产物于峰电位- 1. 12V 处在滴汞电极上生产生一灵敏吸咐还原波,导数波高与赖氨酸浓度有良好的线性关系,检测限为3 ×10 - 8mol/L。
莫健伟等人研究了精氨酸、赖氨酸、组氨酸等多种碱性氨基酸与水杨醛在Britton Robinson(B - R) 缓冲溶液中的衍生化反应,衍生产物在- 1. 1V～ - 1. 6V(Vs. SCE) 电位范围有灵敏的极谱行为,并且发现这种行为与氨基酸的结构有关。
氨基酸与水杨醛的反应是亲核加成反应,反应的氨基氮原子的电子云密度愈高或醛基碳原子的电子云密度越低,越有利于活性席夫碱的形成,而有利于低浓度氨基酸的测定。
3. 2 通过氨基酸与金属离子配位间接测定氨基酸作为配体,可与多种金属离子配位,形成电活性的配合物,以提高氨基酸自身的检测灵敏度。
如酪氨酸在pH为3. 94 的B - R 缓冲溶液中,在玻碳电极上于1.20V 处出现一氧化峰,们灵敏度较低,加入少量Cu2 +后,此峰消失,在0. 95V 处有一新的氧化峰出现,且灵敏度提高了2 倍多,用新极谱法测得酪氨酸浓度在0. 3～3mg/L 范围内与氧化峰的2. 5 次微分值呈线性关系,检测下限为0. 2mg/L。
Gilbert 等人使用CO2 + : - 催化半胱氨酸产生氢波来测定胱氨酸和半胱氨酸的灵敏度很高。
胱氨酸在碱性溶液中被还原成半胱氨酸,半胱氨酸在Co2 + 一氨体系中与Co2 + 络合,于滴汞电极上- 1.55V 处产生—催化氢波,波峰高度与脉冲幅度有关,当用10mV 和30mV 的脉冲时,其检测限分别为5 ×10 - 8mol/L 和5 ×10 - 9mol/L。
彭爱红等人用极谱法研究了酪氨酸(Tyr) 、脯氨酸(Pro) 、组氨酸, (His) 与Ni2 +在硼砂缓冲溶液中(pH = 9. 2) 配位后的情况,在- 0. 6～ - 1.60V 电位范围内扫描,峰电位分别为- 1. 04V、- 1. 20V、- 1. 34 ,三种氨基酸的峰电流与浓度分别在2. 0 ×10 - 5～3. 0 ×10 - 4mol/L、3. 2 ×10 - 6～2. 2 ×10 - 4mol/L、4. 0 ×10 - 5～2. 5 ×10 - 4mol/L 的范围内呈线性关系。
3. 3 通过电致化学发光分析电致化学发光( ECL)以其独特的优点在分析当中的应用越来越广泛。
ECL[7]是具有电致化学发光活性的物质处于一定的电位时,与溶液中存在的氧化还原性物质作用生成的不稳定激发态回至基态时所产生的化学发光。
目前,采用ECL或免疫电化学发光( IECL) 手段对各种氨基酸及蛋白质分析的报道较多。
联吡啶钅了[ Ru (bpy) 32 + ]化合物是一种典型的ECL 活性物质,它与氨基酸发生ECl 反应,发出一定强度的光测定氨基酸。
4 色谱法4. 1 衍生化离子交换色谱法氨基酸自动分析仪的分析原理是基于阳离子交换树脂分离—柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。
该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液为流动相,在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测,具有重现性好、仪器稳定、结果可靠等优点,适合于大量常规样品的分析。
另外,由于衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离之后,因而避免了其他物质的干扰,适合未知复杂样品中氨基酸的分析。
其缺点是仪器复杂,体积大,费用高。
此外,由于脯氨酸的测定波长为440 nm ,而其他氨基酸的测定波长为570 nm ,因此脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。
4. 2 衍生化高效液相色谱法柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点, 已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。
柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/ 弱酸盐缓冲液为流动相。
常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA) 、萘- 2 ,3 - 二甲醛(NDA) 、9 -芴甲基氯甲酸酯(FMOC) 异硫氰酸苯酯(PITC) 、丹酰氯(Dansyl - Cl) ] 、4 ,4 - 二甲胺基偶氮苯- 4′- 磺酰氯(DABS - Cl) 、6 - 氨基奎啉- N - 羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC) ]和2 ,4 - 二硝基氟苯(DNFB) [8] ]等。
OPA 衍生化方法具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的优点,而且试剂本身不发荧光,不会干扰氨基酸的测定;缺点是OPA 不能和仲氨酸反应,与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定。
FMOC 衍生化方法灵敏度高,反应快速,FMOC 能仲氨酸反应;缺点是衍生副产物干扰测定,需用戊烷将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应并避免衍生物的水解。
PITC 衍生试剂可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生副产物对测定无干扰,衍生物非常稳定(在干燥条件下可在冰箱中长期储存) ;缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸) 形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定,不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸,样品制备需较长时间(30min 以上) ,衍生化反应过程中需真空蒸发装置,不利于衍生反应的自动进行。
Dansyl - Cl 方法具有衍生反应迅速、样品制备简单、灵敏度高和剩余衍生试剂不需除去等优点;缺点是流动相中的杂质和衍生副产物对测定有干扰。
DABS - Cl 方法可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生物在室温条件下稳定,检测波长在436～460 nm 处仍有较高的专属性和灵敏度;缺点是与一些氨基酸(精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸) 不能进行定量反应,而且产物成分复杂。
AQC 方法适合于复杂样品中的氨基酸分析,具有灵敏度高、衍生物稳定等优点。
DNFB 方法的优点有衍生产物稳定、操作简便、成本低等。
除了以上几种常见的衍生试剂外,还有几种新的改进试剂。
以异硫氰酸苄酯(BzITC) 和异硫氰酸丁酯(BITC) 为衍生试剂,其衍生物稳定,能同时测定半胱氨酸和胱氨酸,试剂有挥发性容易除去。
使用荧光衍生试剂N —羟基琥珀酰亚胺基- α- (92 吖啶) - 乙酸盐(HSAA) ,反应后剩余试剂无需萃取,产物稳定,有较高的专属性和灵敏度。
以二氢苊- 5 - 磺酰氯(AcNSCl) 为衍生试剂,其衍生物的荧光强度是Dansyl - Cl 的10～25倍,而且衍生化反应速度比Dansyl - Cl 的快115 倍。
此外还有使用多种芳基碳氧酰氯,包括4 - 苯基偶氮苄基碳氧酰氯(PAZ - Cl) 、2 - (萘甲基) 碳氧酰氯(NMOC -Cl) 等衍生试剂,对一些蛋白水解液进行分析,结果与FMOC 方法一致。
4. 3 柱前衍生化气相色谱法气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱仪联用等优点。
氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极性基团,需要先对其衍生化。
衍生化方法有两种:两步法和一步法。
两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化,然后再用各种酸酐将N - (O ,S) 基团乙酰化。
常用的衍生试剂有三氟乙酰(TFA) 、五氟丙酰(PFP) 、正丙醇、七氟丁酰(HFB) 和异丙醇等一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳氧酰烃基酯[9]。