原核诱导表达汇总

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IPTG诱导表达

IPTG诱导表达IPTG 诱导表达1.原核表达系统将外源基因引⼊原核细胞，并使其在原核细胞中⾼效地表达、合成基因产物的体系。

2.原核⽣物基因表达特点原核⽣物中功能相关的基因串联在⼀起，形成操纵⼦。

操纵⼦（operon）是⼀组功能上相关，受同⼀调控区控制的基因组成的⼀个遗传单位3.原核基因的表达调控原核⽣物绝⼤多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染⾊体上，共同组成⼀个转录单位──操纵⼦（元），如乳糖（lac）操纵⼦、阿拉伯糖（ara）操纵⼦及⾊氨酸（trp）操纵⼦（元）等。

操纵⼦（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。

4.乳糖（lac）操纵⼦（元）调节机制糖操纵⼦4.乳糖操纵⼦的结构5.阻遏蛋⽩的负性调节阻遏蛋⽩的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在P启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋⽩与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）即可被诱导。

在这个操纵⼦（元）体系中，真正的诱导剂并⾮乳糖本⾝。

乳糖进⼊细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为⼀种诱导剂分⼦结合阻遏蛋⽩，使蛋⽩构象变化，导致阻遏蛋⽩与O序列解离、发⽣转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是⼀种作⽤极强的诱导剂，不被细菌代谢⽽⼗分稳定.6.乳糖操纵⼦的结构及阻遏作⽤7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件1.删除内含⼦和5’⾮编码区2.外源基因置于强启动⼦和SD顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋⽩质不被降解8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素1、启动⼦：建⽴表达载体时，选择强启动⼦2、基因剂量3、核糖体结合位点9.常见原核强启动⼦Plac：受Lac阻遏蛋⽩负调，受IPTG的诱导Ptrp：取⾃⼤肠杆菌⾊氨酸操纵⼦。

Ptac :Lac启动⼦和Trp启动⼦的杂合启动⼦。

P L和P R启动⼦：噬菌体早期左/右向启动⼦，受λ噬菌体CI基因负调控。

原核表达总结

原核表达之目的基因克隆1.了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。

还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。

稀有密码子预测网址：.ru/eng/scripts/01_11.html/~mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//~sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。

注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。

一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。

2.搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。

大肠杆菌的原核表达实验过程结果

大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

原核表达(原理、材料与实验方案)

原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1 mg / mL DNase I。

2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

原核诱导表达

原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P 上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。

在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g氯化钠 10g酵母提取物 5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。

原核表达总结

注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。

一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。

原核表达及纯化方法

原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。

37℃，过夜摇菌。

2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。

（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。

大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。

二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。

根据这个结果选择纯化方法。

（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。

（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。

三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。

4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。

（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。

第九章原核表达总结

聚合酶通过操纵基因而关闭操纵子的转录。
诱导物：与阻遏物或激活物结合，从而启动操
纵子转录的效应物，称作该操纵子的诱导物。
乳糖操纵子模型的建立(Jacob and Monod,1961)
Jacquces Monod(1910-67)
Francois Jacob(1920-)
第一节操纵子学说
操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。
乳糖操纵子半乳糖操纵子色氨酸操纵子阿拉伯糖操纵子麦芽糖操纵子
乳糖操纵子(lactose operon)
操纵子（operon）：
原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排列
组成的一个基因表达的协同单位（DNA序列）.
一个操纵子
= 编码序列（2-6） +启动序列+操纵序列+(其他调节序列)
转录衰减机制
前导DNA
RNA聚合酶
前导mRNA
4
UUUU 3’
衰减子结构就是终止子可使转录终止
5’
1
核糖体
2
3
3
UUUU 3’ UUUU……
4
trp 密码子
前导肽
1.当色氨酸浓度高时
前导DNA
Trp合成酶系相关结构基因被转录
RNA聚合酶结构基因
前导mRNA
2 3 2 4
5’
核糖体 1
3
分解底物的酶只有在底物存在时才出现。
无乳糖：有乳糖：〈５个分子的半乳糖苷酶５０００个半乳糖苷酶分子／２－３分钟５％－１０％（蛋白总量）

原核表达步骤总结

原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。

本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp （100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。

(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。

5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离心管中的水倒干净。

（二）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。

用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。

样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。

IPTG诱导原理原核表达原理及实验步骤

IPTG诱导原理原核表达原理及实验步骤在原核蛋⽩表达体系中，如E.coli（⼤肠杆菌表达系统），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进⾏表达，本⽂详细讲述了常⽤诱导剂IPTG诱导原理，对外源蛋⽩诱导表达原理以及实验步骤。

下载原核⽣物绝⼤多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染⾊体上，共同形成⼀个转录单位——操纵⼦，也称基因表达的协同单位。

E.coli的乳糖操纵⼦含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和⼄酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；⽽I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵⼦。

乳糖操纵⼦结构基因IPTG诱导原理Lac阻遏物是⼀种具有4个相同亚基的四级结构蛋⽩，都有⼀个与诱导剂结合的位点。

在没有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即下图中的阻遏蛋⽩）能与操纵基因O 结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻⽌了转录的路径，从⽽抑制转录启动。

⽽当有诱导剂（这⾥指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋⽩结合，使阻遏蛋⽩构象发⽣变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动⼦P开始发⽣转录，启动反应开始发⽣转录。

在这个操纵⼦（元）体系中，真正的诱导剂并⾮乳糖本⾝。

乳糖进⼊细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即⽣理上的诱导剂。

⽽在实验中，通常选⽤异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是⼀种作⽤极强的诱导剂，不被细菌代谢⽽⼗分稳定，因此被实验室⼴泛应⽤。

IPTG诱导表达原理图IPTG诱导表达实验⽅法材料试剂和培养基配料LB（Luria—Bertani）培养基酵母膏(Yeast extract) 5g蛋⽩胨(Peptone) 10gNaCl 10g琼脂(Agar) 1-2%蒸馏⽔(Distilled water) 1000ml pH 7.0IPTG 贮备液2g IPTG溶于10mL蒸馏⽔中，0.22µm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存凝胶电泳加样缓冲液50mmol/L Tris-CL(pH6.8) 50mmol/L DTT2%SDS（电泳级）0.1％溴酚蓝10％⽢油原核表达鉴定详细实验步骤1. 表达鉴定第⼀天的任务，常⽤抗性选择根据感受态细胞选择拿到质粒，离⼼（3000r/min；2min)在质粒中加⼊TE【使质粒最终加⼊到110µL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加⼊TE的量】，⼀般为(1µg质粒加20µLTE；2µg质粒加50µLTE；5µg质粒加100µL TE)将质粒与TE混匀，吸取2µL混液与感受态细胞混匀将感受态细胞放⼊冰箱（4℃）中，30min取出后⽴即放⼊⽔浴锅中（42℃），热激90s,再次放⼊冰箱（4℃）中，3min拿出后取200µL的LB液体培养基加⼊到已转⼊质粒的感受态细胞中放⼊摇床（37℃; 195r) 中, 30nim⾄60min; (最佳45min)取出离⼼（3000r/min；2min)去掉200µL的上清，留100µL左右上清悬浮沉淀，吸取50µL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放⼊培养箱（37℃）中预热20min】把平板放⼊培养箱（37℃），过夜（12h⾄16h）2. 表达鉴定第⼆天的任务，注意Pcold表达载体的表达温度每个平板挑取单菌落⾄4⽀对应抗性的LB(4ml)试管中，编号为“0”“1”“2”“3”将试管放⼊摇床（37℃；195r) 中，【单抗3h左右；双抗4h左右；刚开始⽤可见分光光度计测OD值；熟练后可⽬测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测OD值（0.6⾄0.8）从“0”号管中取700µL悬液加⼊到100µL（C=80%）的保种⽢油中，震匀，放⼊冰箱（-20℃）冻存在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加⼊2µL的IPTG【终浓度0.5mM最适，可根据⽇后表达摸索】视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h ⾄4h（4⽀试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h⾄4h）。

原核表达实验报告

原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。

二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。

三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。

2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。

3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。

6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。

四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。

2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。

3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。

6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。

五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。

这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。

原核诱导表达汇总

原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。

在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。

目的基因的原核诱导的具体表达及SDSPAGE凝胶电泳

实验原理
• 目的蛋白质的检测
– 蛋白质分子量的检测 – SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 – 目的蛋白质的分析
目的基因的原核诱导的具体表达及SDSPAGE凝胶电
实验原理
• 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。
• SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如 β巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与 SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
目的基因的原核诱导的具体表达及SDSPAGE凝胶电
蛋白质中加入 SDS 并加热， SDS 分子上的非极性区 (黄色尾巴)会与蛋白质上的非极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满 SDS 分子。SDS 分子的极性区 (洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异。SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子。
目的基因的原核诱导的具体表达及SDSPAGE凝胶电
实验步骤
• 培养 • 诱导 • 样品制备 • SDS-PAGE • 凝胶检测
目的基因的原核诱导的具体表达及SDSPAGE凝胶电
目的蛋白质的诱导表达及检测
1）挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液， 37℃ 培养过夜。
SDS-PAGE
6 ）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边,安装好 7 ）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽

原核表达中小量诱导表达的原理

原核表达中小量诱导表达的原理
原核表达中小量诱导表达的原理主要包括以下几个方面：
1. 阻遏蛋白与lac操纵子的融合：一旦由lacI细胞所形成的阻遏蛋白与lac
操纵子融合后，就无法影响外部基因的转录和表达，从而保证了宿主细胞的健康生长。

2. IPTG的作用：IPTG是一种可以与乳糖水解融合的中间物质，虽然无法被细胞所同化，但却能够与阻遏蛋白结合，使细胞可以控制外源融资基因的大量转录和高效表达。

3. 蛋白质溶解性和折叠的优化：高温会使蛋白质以聚集的形式表达成包涵体，因此可以选择低温诱导表达以增加蛋白质溶解性和折叠。

4. 翻译水平的提高：可以通过调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变
碱基、增加mRNA稳定性等方式提高翻译水平。

5. 减轻细胞的代谢负荷：将细菌的生长与外源基因的诱导表达分开，使用化学诱导、温度诱导等方式可以减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平。

6. 稀有密码子的优化：多数氨基酸有一个以上的密码子，当异源靶基因的mRNA异常表达后，tRNA的数量直接反应密码子的偏好性，一个或多个tRNA的稀有或缺少会导致翻译的停止。

以上是原核表达中小量诱导表达的原理，具体操作流程和实验步骤可参考相关的生物学书籍或咨询相关专家学者。

原核表达原理

原核表达原理及应用一、目的基因获取目的基因的获取是原核表达的第一步，通常通过基因克隆技术从基因文库或PCR扩增中获得。

克隆技术包括质粒载体克隆、噬菌体载体克隆、染色体重组克隆等。

PCR技术则包括常规PCR、巢式PCR、反转录PCR等。

二、载体构建载体构建是将目的基因连接到原核表达载体上的过程，该载体含有原核生物可以识别的启动子、多克隆位点以及筛选标记等必要元件。

构建载体时，需要确保目的基因插入后的正确阅读框架和终止子。

常用的原核表达载体有pET系列、pGEX系列、pBAD等。

三、转化转化是将目的基因导入到受体细胞的过程，受体细胞通常是原核生物。

常用的转化方法有电击转化法、热激转化法、化学转化法等。

转化成功后，目的基因会整合到受体细胞的染色体上或质粒上，进而实现基因的表达。

四、诱导表达诱导表达是目的基因在受体细胞内表达的过程，通常在特定的诱导条件下进行。

常用的诱导方法有温度诱导、IPTG 诱导、金属离子诱导等。

诱导表达后，目的基因在受体细胞内转录和翻译，生成相应的蛋白质。

五、表达产物检测表达产物检测是通过特定的方法检测目的基因表达产物的过程。

常用的检测方法有SDS-PAGE电泳、Western blot、ELISA等。

这些方法可以用来检测表达产物的分子量、含量以及纯度等信息，为后续的优化和纯化提供依据。

六、表达优化表达优化是提高目的基因在受体细胞内表达水平的过程，通过调整诱导条件、宿主菌种类和培养基成分等方法实现。

优化后的目的基因表达水平更高，有利于提高产物的产量和纯度。

七、产物纯化产物纯化是从表达产物中分离和纯化目标蛋白质的过程。

常用的纯化方法有离心、过滤、沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

这些方法可以根据目标蛋白质的理化性质和分子量等进行分离和纯化，获得高纯度的蛋白质。

八、应用研究原核表达技术在应用研究方面具有广泛的应用价值。

它可以用于蛋白质结构与功能的研究，通过同源建模和晶体结构解析等方法研究蛋白质的结构和功能；可以用于蛋白质药物的开发，如抗体药物、细胞因子药物等；可以用于疫苗的研制，如细菌性疫苗和病毒性疫苗等；可以用于酶工程领域，如固定化酶、酶抑制剂等；可以用于基因工程领域，如基因诊断和基因治疗等。

第九章原核表达总结

调控机制（负调控）

Lac操纵子诱导剂
生理性诱导剂实验常用诱导剂

乳糖，别位乳糖异丙基硫代半乳糖（IPTG）

安慰诱导物（IPTG）：
有极强的诱导效应，而本身不被分解。
No lactose:repressor
LacI
Promoter mRNA
Operator
Repressor monomer
高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因
阻遏物
活化的阻遏蛋白
(Trp)
图 16-27 TrpR 被 Trp 激活后可阻遏 trp 操纵子的转录 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅳ，1990, Fig .13.16)
色氨酸的调节
调节区
trpR
转录衰减
结构基因
RNA聚合酶 P O RNA聚合酶
分解底物的酶只有在底物存在时才出现。
无乳糖：有乳糖：〈５个分子的半乳糖苷酶５０００个半乳糖苷酶分子／２－３分钟５％－１０％（蛋白总量）
有的酶可被诱导
乳糖操纵子的调控机制
1. 乳糖操纵子的负调控 2. 乳糖操纵子的正调控： cAMP-CAP的调控作用
3.乳糖操纵子的协调调控
乳糖操纵子的负调控
第七章原核生物基因的表达与调控
授课内容
相关基本概念乳糖操纵子模型及调控机制色氨酸操纵子模型及调控机制翻译水平的调控真核生物的调控
重点：乳糖、色氨酸操纵子调控的机制
难点：阻遏蛋白与诱导物操作子的相互作用 cAMP-CAP的正调控作用
原核生物基因表达的调控
1、基因表达的多级调控
转录衰减机制
前导DNA
RNA聚合酶

目的基因在原核细胞中的表达

实验八目的基因在原核细胞中的表达一、实验原理（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰氨聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。

常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。

化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。

低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。

（二）诱导表达原理IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。

二、实验用品1.仪器用具：垂直电泳槽、电泳仪、eppendorf管、微量移液器、枪头、微量加样器、25ml烧杯、直径20cm 培养皿、量筒、容量瓶、试剂瓶、单面刀片、蛋白Marker；2.材料试剂：含目的基因表达载体的M15菌株，Amp，Kana，LB液体培养基，SDS、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰氨、Tris、甘氨酸、HCl、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、甘油、溴酚蓝、甲醇、乙酸、NaOH。

3.需配试剂（1）4×Tris.Cl/SDS pH8.8300mlH2O中溶解91gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH8.8，补加H2O至整体积为500ml，加入2g SDS，可4℃保存一个月。

原核表达及纯化总结

His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。

2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。

PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 µLdNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL上游引物（10 µmol/L） 1 µL下游引物（10 µmol/L） 1 µLTaq酶（5 U/µL）0.3 µLddH2O 13.1µLTotal 20 µL 条件：94℃预变性10min94℃变性45s50℃退火45s72℃延伸1min，30个循环的扩增反应72℃延伸10 min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3µL样品（1µL loadingbuffer +6µL PCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。

（注意：记得保存菌种）3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。