免疫印迹法的实验技术..

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免疫印迹(immunoblotting)

免疫印迹(immunoblotting)

免疫印迹(immunoblotting)免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下:1.蛋白质抽提a.实验对象为组织样品,取适量(250~500mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白(或核蛋白)。

b.实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白(或核蛋白)。

2.蛋白质定量:按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。

3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中,电泳分离蛋白。

4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4°C转移过夜。

5.膜的封闭和抗体孵育a.膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时,抗原抗体结合。

c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。

加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6.结果检测:化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。

图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。

(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。

(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹法原理

免疫印迹法原理

免疫印迹法原理
免疫印迹法是一种实验室技术,用来检测抗体与抗原之间的相互作用。

它是一种比较灵敏的技术,可以快速准确地测量抗体和抗原之间的交互作用。

这一方法的特点是可以检测到极低浓度的抗体,并且可以在短时间内完成测试。

免疫印迹法通常具有五个步骤:1)准备抗原:将抗原溶解在溶剂中,以便它能够与抗体结合。

2)制备抗体:将抗体溶解在溶剂中,以便它能够与抗原结合。

3)将抗体与抗原混合:将抗体和抗原混合,使它们能够形成结合物。

4)检测结合物:使用某种技术,如荧光技术,来检测抗体和抗原之间的结合物。

5)分析结果:对检测到的结合物进行分析,以确定抗体与抗原之间的交互作用。

免疫印迹法在医学诊断中有着重要的应用。

它可以用来检测抗体与抗原之间的结合,以确定患者是否患有特定病毒或疾病。

此外,它还可以用来检测肿瘤细胞,以确定是否有癌症。

免疫印迹法的优点是,它可以检测到极低浓度的抗体,可以在短时间内完成测试,并且可以检测出抗体与抗原之间的结合物。

它的缺点是,它只能检测出抗体与抗原之间的结合,而不能检测出抗体与抗原之间的其他关系。

免疫印迹法是一种灵敏、准确的技术,可以用来检测抗体与抗原之
间的结合,以确定患者是否患有特定病毒或疾病。

它可以快速准确地检测出极低浓度的抗体,并且可以在短时间内完成测试。

因此,免疫印迹法在医学诊断中具有重要的应用。

免疫印迹技术实验报告

免疫印迹技术实验报告

免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术(Western Blotting)是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。

它基于免疫学原理,通过将待测蛋白质进行电泳分离,并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理,最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。

本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平,并观察其变化情况,以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。

二、实验步骤1. 样本制备首先,我们需要准备样本。

样本可以是细胞或组织。

在实验中,我们选择了A 细胞和B细胞作为样本,分别进行后续实验。

2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液,通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。

3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中,进行电泳分离。

电泳时间和电压根据实验需要来确定。

4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。

转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。

5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中,在室温下进行阻断。

阻断的目的是防止非特异性结合。

6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中,将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中,进行一抗处理。

一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。

7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出,进行洗涤。

洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。

8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中,将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中,进行二抗处理。

9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出,再次进行洗涤,确保清洗干净。

10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中,将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中,进行显色反应。

显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。

11. 照相观察显色结果,并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜,记录实验结果。

三、结果与讨论根据实验步骤,我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。

蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项

蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项

蛋⽩质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋⽩质转移到膜上,然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。

对已知表达蛋⽩,可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交⽅法类似,但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋⽩质,“探针”是抗体,“显⾊”⽤标记的⼆抗。

经过PAGE分离的蛋⽩质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质,且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应,经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。

实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基⼄醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液:⽢氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容⾄1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O⾄1000 ml。

5. 膜染⾊液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇80 ml;⼄酸2 ml;ddH2O118 ml。

免疫印迹 实验报告

免疫印迹 实验报告

免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹(Western blot)是一种常用的蛋白质检测技术,广泛应用于生物医学研究领域。

本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况,并探究其在细胞信号转导中的作用。

实验材料和方法:材料:1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体:一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法:1. 培养细胞并进行处理,如添加特定药物或刺激剂。

2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。

3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。

4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。

5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。

6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。

7. 清洗膜,并使用二抗与一抗结合。

8. 再次清洗膜,并使用ECL检测试剂盒进行显色。

9. 使用图像分析软件分析结果。

结果与讨论:通过免疫印迹实验,我们成功检测到目标蛋白的表达情况。

在实验中,我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白,以探究其在细胞内的作用和调控机制。

首先,我们培养了细胞并进行了不同处理。

通过细胞裂解液裂解蛋白,我们成功地提取了目标蛋白。

接下来,我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离,并将其转移到蛋白转印膜上。

通过这一步骤,我们可以将蛋白在膜上固定,并便于后续的抗体结合。

在进行免疫印迹之前,我们需要对膜进行阻断,以防止非特异性结合。

通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质,我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。

在阻断后,我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。

一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要,因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。

在与一抗结合后,我们进行了膜的清洗,以去除未结合的抗体。

接下来,我们使用二抗与一抗结合,并再次清洗膜。

二抗通常被标记有荧光素或酶,以便于后续的信号检测。

最后,我们使用ECL检测试剂盒进行显色。

ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号,从而检测目标蛋白的表达情况。

蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤

蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤

蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。

待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。

关键词:印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernblottingimmunoblotting免疫印迹法蛋白质印迹法【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。

待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。

如图所示,可溶性抗原,也就是待测蛋白首先要根据其性质,如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上;利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合的原理,以抗体作为探针钓取目的蛋白。

值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白,如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。

经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。

常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。

2.湿法:凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中,转移时间可从45分钟延长到过夜进行。

由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料,因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。

对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。

该抗体往往是购买的成品,已经被结合或标记了特定的试剂,如辣根过氧化物酶。

这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应,该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上,容易鉴别。

因此可通过对二抗的识别而识别一抗,进而判断出目标蛋白所在的位置。

其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。

免疫印迹介绍及实验过程

免疫印迹介绍及实验过程

免疫印迹介绍及实验过程免疫印迹免疫印迹免疫印迹(immunoblotting)⼜称蛋⽩质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋⽩的⽅法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种新的免疫⽣化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的⾼分辨⼒和固相免疫测定的⾼特异性和敏感性,现已成为蛋⽩分析的⼀种常规技术。

免疫印迹常⽤于鉴定某种蛋⽩,并能对蛋⽩进⾏定性和半定量分析。

结合化学发光检测,可以同时⽐较多个样品同种蛋⽩的表达量差异。

免疫印迹法的基本原理将混合抗原样品在凝胶板上进⾏单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。

在印迹纸的⾃然吸附⼒、电场⼒或其它外⼒作⽤下, 使凝胶中的单⼀抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。

最后应⽤免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进⾏检测和分析。

免疫印迹法的基本步骤免疫印迹法(以抗原分析为例)基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。

在每⼀步中因采⽤的具体实验⽅法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。

免疫印迹法的优点免疫印迹法是⼀项分析抗原、抗体的技术。

它具有下列优点:1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作;2 、固定化的⽣物⼤分⼦可均⼀的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔;3、免疫印迹分析只需少量试剂;4、孵育、洗涤的时间明显减短;5、可同时制作多个拷贝, ⽤于多种分析和鉴定;6、结果以图谱形式可长期保存;7、免疫探针可通过降低PH值等⽅法, 象抹去录⾳磁带⼀样将探针抹掉, 再换⽤第⼆探针进⾏分析检测。

免疫印迹法的应⽤范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这⼀⽅法的深⼊研究⽽不断发展和完善。

免疫印迹免疫印迹⼜常称Western blot,是⼀综合性的免疫学检测技术。

它利⽤SDS-PAGE技术将⽣物样品中的蛋⽩质分⼦按分⼦量的⼤⼩在凝胶上分离开,然后⽤电转移的⽅法将蛋⽩转移到固相膜上(NC、尼龙或PVDF膜),最后进⾏免疫学检测。

免疫印迹原理

免疫印迹原理

免疫印迹原理免疫印迹技术是一种用来检测特定蛋白质的方法,它利用抗体与抗原之间的高度特异性结合来实现。

这种方法可以被广泛应用于生物医学研究、生物化学分析以及临床诊断等领域。

免疫印迹原理的核心在于抗体与抗原之间的特异性结合,这种结合使得目标蛋白质可以被准确、可靠地检测出来。

首先,免疫印迹技术的基本原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合。

在实验过程中,首先需要将目标蛋白质分离出来,并将其转移到固体载体上,通常是一块膜或者一块凝胶。

然后,将这个载体与特异性的抗体进行接触,这些抗体会与目标蛋白质结合。

接着,通过一系列的化学方法,可以将这些抗体标记上一种可检测的物质,比如酶或者荧光染料。

最后,通过检测这些标记物的信号强度,就可以确定目标蛋白质的存在和数量。

其次,免疫印迹技术的原理还包括了特异性识别和灵敏性。

抗体与抗原之间的结合是高度特异性的,这意味着每一种抗体只能结合一个特定的抗原,这种特异性使得免疫印迹技术能够准确地检测出目标蛋白质。

另外,免疫印迹技术还具有很高的灵敏性,即使只有极少量的目标蛋白质,也可以被可靠地检测出来。

这种特性使得免疫印迹技术成为了生物医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。

最后,免疫印迹技术的原理还包括了定量和定性分析。

通过测量标记物的信号强度,可以对目标蛋白质的数量进行定量分析,这使得免疫印迹技术成为了研究蛋白质表达水平的重要方法。

同时,通过比较不同样本中目标蛋白质的信号强度,可以进行定性分析,比如判断某种蛋白质在不同组织或者不同条件下的表达情况。

总之,免疫印迹原理是一种利用抗体与抗原之间特异性结合的方法,它具有特异性识别、高灵敏性、定量和定性分析等特点。

这种方法在生物医学研究、生物化学分析以及临床诊断中具有广泛的应用前景,为科学家们提供了一个强大的工具来研究和检测蛋白质。

免疫印迹技术的不断发展和完善,将进一步推动生命科学领域的发展,为人类健康和疾病治疗带来更多的希望和可能。

蛋白免疫印迹杂交实验方法

蛋白免疫印迹杂交实验方法

Western Blot(蛋白质免疫印迹技术)一、实验原理:与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

Western Blot(WB)是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后,将蛋白转移至固相支持物—NC膜上,根据抗原和抗体之间的反应特性,通过特异性试剂(抗体)作为探针(一抗/二抗),对靶物质(抗原)进行检测。

蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1~5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白。

Western Blot 流程图:样品聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)转膜封闭洗膜(3×5mins)孵育一抗(4度过夜或室温4-6小时)洗膜(3×10mins)孵育二抗(室温2小时)洗膜(3×10mins)显影SDS-PAGE分离蛋白的原理和操作:1. SDS-PAGE作用原理聚丙烯酰胺凝胶是网状结构,具有分子筛效应,它有两种形式,一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质在电泳中保持完整的状态,蛋白在其中依三种因素分开:蛋白大小,形状和电荷。

另外一种是SDS-PAGE,SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。

这个技术首先是1967年由shapiro建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。

免疫印迹分析原理

免疫印迹分析原理

免疫印迹分析原理
免疫印迹分析是一种常用的生物化学实验技术,用于检测特定蛋白在混合样品中的存在与定量。

其原理基于免疫学,包括抗原-抗体特异性结合和酶标记技术。

首先,将待检测的样品蛋白通过电泳技术在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。

分离完毕后,将凝胶中的蛋白转移到具有亲水性的膜上,如聚偏氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。

接下来,将膜放入一种称为“阻断剂”的溶液中,将未被分离的蛋白表面区域堵塞,防止非特异性的抗体结合。

然后,将膜孵育于含有特异性一抗(primary antibody)的溶液中。

一抗与目标蛋白发生特异性结合。

一抗通常通过小鼠、兔子或山羊等动物制备,可以识别和结合特定的抗原。

经过一抗的孵育后,膜需要进行洗涤,去除未结合的一抗分子,以减少后续步骤中的背景干扰。

随后,加入与一抗结合的辅助二抗(secondary antibody),通
常二抗是被标记上酶或荧光染料的抗体。

二抗与一抗发生特异性结合,形成复合物。

紧接着,利用一种称为“底物”的分子与酶标记的二抗发生反应。

底物通过酶的催化作用,产生可定量测量的信号,如发光或颜色的产生。

最后,在暗室或成像系统中,通过检测信号的强度和位置来分析目标蛋白的存在与定量。

在印迹图上,目标蛋白通常以条带(band)的形式显示出来,其强度与其在样品中的丰度成正比。

免疫印迹分析原理的关键在于特异性的抗原-抗体结合,通过
使用合适的一抗和二抗,可以高度选择性地检测目标蛋白。

此外,由于酶标记技术的应用,使得信号可以转化为可测量的结果。

因此,免疫印迹分析成为生物医学研究中常用的工具之一,用于研究蛋白表达、诊断疾病等方面。

免疫印迹法的实验技术

免疫印迹法的实验技术
免疫印迹法,又称Western Blot,是70年代末80年代初发展起来的蛋白质测定技术,用于检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性或半定量方法。实验主要内容包括实验原理、用途、方法及步骤和注意事项。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子量分离,转移至固相支持物上,用非标记抗体与靶蛋白特异性结合,再用标记的二抗结合,最后显色检检测样品中特异性蛋白质是否存在及其半定量分析。蛋白样本制备时需注意低温和蛋白酶抑制剂的使用以减少蛋白降解,蛋白浓度测定常用BCA法等。实验过程中需注意个人防护、离心机预冷、冰上操作及避免吸取沉淀。

免疫印迹法的实验技术PPT课件

免疫印迹法的实验技术PPT课件

根据实验结果和反馈,不断优化和改 进实验条件和方法,提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术, 提高实验效率案例一:病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点,能够快速识别病毒抗原, 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平,辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中,利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ,从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平,有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品,确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂,确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求,采用不同的分离 方法,如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量,以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜,如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间,确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭,以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗,确 保与目标蛋白的结合。
案例二:肿瘤标志物的检测

Western blot 实验技术

Western blot 实验技术
最佳程度时,立即用三蒸水洗涤终止反应。
二抗与底物反应显色•辣根过氧 Nhomakorabea物酶法(HRP) •碱性磷酸酶法(AP) •化学发光显色法
朱珊丽老师的结果
1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4
Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein
达到最佳程度时,立即用三蒸水洗涤终止反应
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
(尼龙膜: 480µg/cm2 ;硝酸纤维素膜:80µg/cm2 )
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
三、免疫染色 1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭,4℃过夜。 2.TBS洗膜1-2次,10min/次。 3. 加一抗孵育,37 ℃或室温孵育1h。 4. TBS洗3次,10min/次。 5.加HRP标记的抗体,室温1h 。 6.TBS洗3次,10min/次。 7.NC膜再转入DAB显色液中,避光反应,待显色反应
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
【器材】
转移电泳仪 ,硝酸纤维素膜,滤纸,剪刀, 手套
【试剂】
1.一抗 2.二抗:HRP标记的IgG 抗体 3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加

免疫印迹技术实验报告

免疫印迹技术实验报告

免疫印迹技术实验报告免疫印迹技术实验报告引言:免疫印迹技术是一种广泛应用于生物学研究领域的实验方法,通过检测目标蛋白在细胞或组织中的表达情况,可以帮助科学家深入了解生物体内的分子机制。

本文将介绍我们在实验室中使用免疫印迹技术的实验过程和结果,以及对实验结果的分析和讨论。

实验材料与方法:我们使用了以下材料和方法进行实验:1. 细胞或组织样本:我们选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象,同时还使用了正常肺组织作为对照组。

2. 蛋白提取:利用细胞裂解液将细胞或组织中的蛋白质释放出来。

3. SDS-PAGE凝胶电泳:将蛋白样品分离成不同大小的带状蛋白条带。

4. 转膜:将分离的蛋白迁移到聚合物膜上,以便进行后续的免疫检测。

5. 免疫检测:使用特异性抗体对目标蛋白进行检测,并使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行信号放大。

6. 显色:通过添加显色底物,使目标蛋白在免疫印迹膜上形成可见的带状条带。

7. 图像获取与分析:使用化学发光成像系统获取免疫印迹膜上的图像,并使用图像分析软件进行定量分析。

实验结果:在实验中,我们成功地提取了A549细胞和正常肺组织中的蛋白质,并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。

通过免疫检测,我们发现在A549细胞中,目标蛋白X的表达水平明显高于正常肺组织。

此外,我们还观察到在A549细胞中,目标蛋白Y的表达水平也有所上调。

对实验结果的分析与讨论:通过实验结果的分析与讨论,我们可以得出以下结论:1. 目标蛋白X在肺癌细胞中的过度表达可能与肺癌的发生和发展有关。

这一发现与之前的研究结果相符,进一步验证了目标蛋白X在肺癌中的重要作用。

2. 目标蛋白Y的上调表达可能与肺癌细胞的增殖和侵袭能力增强有关。

这一发现为进一步研究目标蛋白Y在肺癌发展中的功能和机制提供了线索。

进一步研究的展望:基于本次实验结果,我们提出了以下进一步研究的展望:1. 探究目标蛋白X在肺癌细胞中的功能和调控机制,以揭示其在肺癌发展中的具体作用。

免疫印迹试验名词解释

免疫印迹试验名词解释

免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验(immunoblotting)是一种常用的实验技术,用于检测和分离蛋白质样本中特定抗原的存在。

该技术结合了蛋白质电泳分离和免疫反应原理。

免疫印迹试验的步骤如下:
1.样本处理:将待测蛋白质样本经过电泳分离,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

2.转印:将分离的蛋白质从凝胶转移到固定在膜上的靶蛋白(通常是聚偏二氟乙烯膜)。

3.阻断:用一种阻止非特异性结合的蛋白质(例如乳清蛋白或牛血清白蛋白)封闭膜上的未被转移的位点,以减少非特异性结合。

4.抗体结合:将特异性抗体添加到膜上,使其与目标抗原特异性结合。

5.洗涤:洗去未结合的抗体,以减少非特异性结合。

6.检测:添加适当的检测试剂,例如酶标记的二抗或荧光标记的二抗,以与特异性抗体结合的抗原发生化学或光学反应。

7.显色:通过添加染色剂,例如酶底物或荧光染料,可使目标抗原在膜上可视化。

通过免疫印迹试验,可以确定样本中特定蛋白质的存在与否,确定蛋白质的分子量,并研究蛋白质的表达水平和亚细胞定位等信息。

这项技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域广泛应用。

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免疫印迹实验报告

免疫印迹实验报告

免疫印迹实验报告竭诚为您提供优质文档/双击可除免疫印迹实验报告篇一:免疫印迹实验报告——westerblotwesternblot实验报告摘要:目的:学习并掌握westernblot分离蛋白及观察方法方法:westernblot结果:见后文结论:westernblot能很好地分离蛋白关键词:westernblot、分离、小鼠组织、蛋白westernblottestreportAbstract:objective:Learnandmasterthewesternblotprot einisolatedandobservationmethodmethods:westernblot :,sds-pageandelectrictransferResults:seebelowKeywords:westernblot、separate、mousetissues、protein前言:免疫印迹又称western印迹(westernblotting),与DnA的southern印迹技术相对应,两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为nc膜),然后用探针检测特异性组分。

不同的是,westernblotting所检测的是抗原类蛋白质成分,所用的探针是抗体,它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点,具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。

该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。

目前,westernblotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。

免疫印迹可分成两个步骤:蛋白质由凝胶转移至固相基质;特异性抗体检测。

蛋白质转移通常由电泳实现,现常用的方法有二:1半干法:将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间,通电10-30分钟可完成转移;2湿法:将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电45分钟或过夜课完成转移。

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免疫印迹法的实验技术
(Western Blot 印迹方法)

一、Western-Blot简介
Western Blot,又称为免疫印迹 (Immunoblot),是70年代末80年代初发 展起来的蛋白质测定技术。
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大 学的乔治· 斯塔克(George Stark)。在尼 尔· 伯奈特(Neal Burnette)于1981年所 著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。
BCA法工作原理
BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白 质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白 质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原 成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的 紫蓝色复合物,在562 nM处有最大光吸收值并 与蛋白质浓度成正比,颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比,可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该 测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的 颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质去垢剂 等影响小。
实验用途
用于检测样品中特异性蛋白质是否存 在。
对特异性蛋白质进行半定量分析。
蛋白免疫印迹组成
1
SDS -聚丙烯酰 胺凝胶电泳,使 待测样品中的蛋 白质按分子量大 小在凝胶中分成 带
2
把凝胶中已分成 条带的蛋白质转 移到一种固相支 持物上
3
用特异性的抗体 检测出已经印迹 在膜上的所要研 究的相应抗原
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳法。
原理
1.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决 于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫 酸钠(SDS),SDS是一种阴离子表面活性剂,能使蛋 白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,在一 定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合(1.4gSDS/1g 蛋白质),使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度 的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时,蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其 它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
体情况具体选择。
注意事项
注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼 睛及皮肤,一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,立即 用大量水冲洗。 所用离心机需提前预冷。 为防止蛋白降解,所有操作应在冰上完成。 吸取蛋白上清液时,注意不要把沉淀吸上来。
蛋白浓度的测定 原因: Western Blot作为一项半定量实验技术, 电泳前,必须对不同的样品进行总蛋白含 量测定。
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体 上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种 方法。
Western Blot 印迹方法,是检测蛋白质混合 液体中某种特定目的蛋白的定性方法,也可作为 确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不 同条件下的相对含量的半定量方法。
实验主要内容:
3 1 2 3 4
实验原理
实验用途 实验方法及步骤
实验注意事项

实验原理

【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDSPAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离
将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶
→ 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物 (硝酸纤维素膜或PVDF 膜)上 → 用抗靶蛋白 的非标记抗体(一抗)与转印后膜上的靶蛋白进 行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记(偶联) 的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如 果转印膜上含有靶蛋白,经DAB显色后上出现 棕黄色条带蛋白条带。
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
含量→制备SDS-PAGE胶→蛋白 变性、上样→电泳→ 转膜→封闭 →一抗→TBST洗膜→HRP标记 的二抗→TBST洗膜→ECL底物显 色→X光片曝光、显色→结果分析
二、蛋白样本的制备和浓度的测定
蛋白的提取:一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白 的提取 组织蛋白提取 组织和裂解液(加入蛋白酶抑制剂,为防止细胞 内蛋白酶对蛋白质的降解)按比例配制-置于玻璃 匀浆器中,充分研磨(冰上操作)4℃离心, 12000rpm,10min取上清分装1.5ml离心管 中-20℃保存。(低温和蛋白酶抑制剂可以减少 蛋白的降解。) 蛋白酶抑制剂:如PMSF、EDTA、EGTA等,要根据具
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳, 被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色” 用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品, 转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固 相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体 起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起 反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也 广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验前的准备
设备和材料的准备: 电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的 准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、 烧杯、量筒 试剂的准备和配置: 双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为 8.8)、Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、 10%过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲 液、电泳缓冲液、蛋白Marker
蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴 定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
方法:
目前常用的有五种经典的方法,即定氮法、双缩 脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法 (Lowry法)、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法 Bradford法)。
目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒,如BCA法试 剂盒.
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