免疫印迹法的实验技术..

蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴 定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
方法：
目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩 脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法 Bradford法）。
目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试 剂盒.
实验前的准备
设备和材料的准备: 电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的 准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、 烧杯、量筒 试剂的准备和配置: 双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为 8.8)、Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、 10%过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲 液、电泳缓冲液、蛋白Marker
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳法。
原理
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决 于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫 酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋 白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一 定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合（1.4gSDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度 的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量， 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其 它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
体情况具体选择。
注意事项
注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼 睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即 用大量水冲洗。 所用离心机需提前预冷。 为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。
蛋白浓度的测定 原因： Western Blot作为一项半定量实验技术， 电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含 量测定。
实验用途
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用于检测样品中特异性蛋白质是否存 在。
对特异性蛋白质进行半定量分析。
蛋白免疫印迹组成
1
SDS -聚丙烯酰 胺凝胶电泳，使 待测样品中的蛋 白质按分子量大 小在凝胶中分成 带
2
把凝胶中已分成 条带的蛋白质转 移到一种固相支 持物上
3
用特异性的抗体 检测出已经印迹 在膜上的所要研 究的相应抗原
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种 方法。
Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合 液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为 确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不 同条件下的相对含量的半定量方法。
实验主要内容：
BCA法工作原理
BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白 质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白 质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原 成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的 紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并 与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该 测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的 颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂 等影响小。
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免疫印迹法的实验技术
（Western Blot 印迹方法）
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一、Western-Blot简介
Western Blot，又称为免疫印迹 （Immunoblot）,是70年代末80年代初发 展起来的蛋白质测定技术。
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大 学的乔治· 斯塔克（George Stark）。在尼 尔· 伯奈特（Neal Burnette）于1981年所 著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
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实验原理
实验用途 实验方法及步骤
实验注意事项
实验原理

【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDSPAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离
将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶
→ 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物 （硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 → 用抗靶蛋白 的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进 行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联） 的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如 果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现 棕黄色条带蛋白条带。
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
含量→制备SDS-PAGE胶→蛋白 变性、上样→电泳→ 转膜→封闭 →一抗→TBST洗膜→HRP标记 的二抗→TBST洗膜→ECL底物显 色→X光片曝光、显色→结果分析
二、蛋白样本的制备和浓度的测定
蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白 的提取 组织蛋白提取 组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞 内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制-置于玻璃 匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4℃离心， 12000rpm，10min取上清分装1.5ml离心管 中－20℃保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少 蛋白的降解。） 蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固 相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起 反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也 广泛应用于检测蛋白水平的表达。