【生化实验】双缩脲法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、学会使用分光光度计进行比色测定。
3、熟悉标准曲线的绘制和应用，能够通过标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲试剂是由硫酸铜和酒石酸钾钠在碱性条件下生成的淡蓝色的络合物。
当含有两个或两个以上肽键的化合物与双缩脲试剂反应时，会形成紫色的络合物。
蛋白质分子中含有多个肽键，因此在碱性条件下能与双缩脲试剂反应产生紫色复合物。
颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，在一定范围内符合朗伯比尔定律，可通过比色法测定其吸光度，进而计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料（1）标准蛋白质溶液：称取结晶牛血清白蛋白（BSA） 10mg，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配制成100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）待测蛋白质溶液：＿____（3）双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O） 15g 和酒石酸钾钠60g，分别用蒸馏水溶解，然后混合，加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容至 1000ml，摇匀，避光保存。
2、仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）移液器（4）容量瓶（100ml、50ml）（5）试管及试管架四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干净的试管，按下表加入试剂：｜管号｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜ 6 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（ml）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（ml）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜｜蛋白质含量（μg）｜ 0 ｜ 20 ｜ 40 ｜ 60 ｜ 80 ｜ 100 ｜（2）向各管中加入 4ml 双缩脲试剂，摇匀，在室温（20-25℃）下放置 30 分钟。
（3）以第 1 管为空白对照，在 540nm 波长处用分光光度计测定各管的吸光度（A）值。
（4）以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标，绘制标准曲线。
双缩脲法测定蛋白质含量
实验三双缩脲法测定蛋白质含量目的1．掌握双缩脲法测定蛋白质的具体操作和原理；2．了解蛋白质测定在生命科学中的应用。
原理双缩脲反应是指双缩脲在硷性溶液中能与Cu2+络合生成紫红色物质。
双缩脲可由脲缩合而成。
蛋白质分子的肽链结构在硷性中也能与Cu2+络合生成紫红色络合物，因其反应机制相似，就把蛋白质的这一反应称为蛋白质的双缩脲反应。
由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分于肽链氨基酸残基的侧链功能基关系较小。
因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。
利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。
这是本法的优点之一。
此外试剂和操作的简单也是其优点。
缺点是灵敏度较低，能测出的蛋白质浓度约须在0.5mg／ml。
本实验用双缩脲法测定血清的总蛋白质浓度。
如结合盐析法(饱和硫酸钠)分离白蛋白和球蛋白还可用于血清白蛋白和球蛋白浓度及其比值(A／G)的测定。
器材1．试管及试智架2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)3．1ml、2ml、5ml刻度吸管4．721型分光光度计试剂1．0.9％NaCl2．双缩脲试剂称取CuSO45H2O结晶(AR级试剂)1.5g,酒石酸钾钠(AR级试剂)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混匀后加水稀释至1000ml。
本试剂可长期保存。
3．牛血清白蛋白标准液此溶液可用于替代标准血清。
称取试剂级冻干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀释至刻度，避免振摇起泡，置4℃冰箱保存。
此标准液浓度为300mg／m1。
4．被检血清样本操怍1. 取试管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被检血清0.200ml(吸管外壁须用滤纸片拭净)。
慢慢放入试管底部。
最后一点液体应吹出，靠落在试管壁上。
2．加入0.9%NaCl 3.80ml,充分混匀但不要振摇起泡。
3．另取试管二支，标上号码，其一用吸管加入操作2所准备的血清样本稀释液1.00ml 另一管加入牛血清白蛋白标准液1.00ml。
实验10双缩脲法测定蛋白质含量
根据实验结果，讨论双缩脲法测定蛋白质含量的优缺点，以及在实际应用中的适用范围 和限制条件。同时，可以与其他蛋白质测定方法进行比较，分析其优缺点。
05 实验总结
实验操作过程中的注意事项
试剂配制
确保试剂准确称量，避免误差，影响实验结 果。
实验时间控制
严格控制实验时间，确保在规定时间内完成 实验。
通过测定不同浓度的蛋白质标 准品与双缩脲试剂反应后的吸 光度值，可以绘制出标准曲线。
利用待测样品与双缩脲试剂反 应后的吸光度值，在标准曲线 上可查出相应的蛋白质浓度。
03 实验步骤
样品处理
样品收集
样品粉碎
样品提取
样品过滤
收集具有代表性的样品， 确保样品新鲜且无污染。
将样品粉碎并混合均匀， 以便后续提取蛋白质。
该方法适用于测定多种蛋白质，如血清蛋白、球蛋白、糖蛋白等，具有操作简便 、准确度高、重现性好等优点。
学习并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的实验操作步骤
准备实验试剂和器材
包括硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、 双缩脲试剂A和B、离心管、吸管、分 光光度计等。
加入试剂
向离心管中加入适量的双缩脲试剂A 和B，混匀。
测定波长的选择
选择波长范围
选择合适的波长范围，通常为 540nm左右。
校准仪器
在所选波长范围内校准仪器，确 保准确测量吸光度。
标准曲线的制作
标准品准备
准备不同浓度的蛋白质标准品。
测定标准品吸光度
分别测定标准品在选定波长下的吸光度。
绘制标准曲线
根据吸光度值绘制标准曲线，建立蛋白质浓度与 吸光度的关系。
蛋白质浓度的计算
根据标准曲线和样品吸光度，计算样品的蛋 白质浓度。
实验一双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验一双缩脲法测定血清蛋白质含量【实验名称】:双缩脲法测定血清蛋白质含量09救援一班第三大组李岚宇 2009222336室温:20? (一)实验目的: 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。
2.学习掌握分光光度计的使用。
3.掌握标准曲线的制作。
4.学习分光光度法测定的原理和方法。
(二)实验原理:血清中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(HN-OC-NH-CO-NH)22在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
(三)实验材料与仪器:1.仪器和材料: 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。
2.试剂:6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液(10g/L)、待测血清样本。
(四)实验步骤和结论:1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。
标准管试剂管号空白管测定管 1 2 3 4 5 蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.4表 12.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值(两管平均值)为纵坐标，绘制标准曲线。
表23、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式CA测标C,测AA标测计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选 = 0.317 ACC标标测=0.354 ,=1.6 g/L; 则得到:=1.432 g/L【注意事项】 : 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。
实验十二 双缩脲法测蛋白质含量
实验十二双缩脲法测蛋白质含量【目的和要求】掌握双缩脲法定量测写蛋白质含量的原理和方法。
【原理】蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。
在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
标准蛋白质溶液可以用结晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。
除—CONH—有此反应外，—CONH2，—CH2—NH2，—CS—NH2等基团亦有此反应。
血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。
【操作方法】一、绘制标准曲线(学生自己列表，依次加入溶液)取一系列试管，分别加入0， 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml的标准酪蛋白溶液（作为标准用的应当用凯氏定氮法测定蛋白氮含量,以确定酪蛋白的纯度），用水补足到2ml，然后加入4ml双缩脲试剂在室温下（15℃～25℃）放置30min，于540nm波长下用72型分光光度计比色测定。
最后以光密度为纵坐标，酪蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。
二、未知样品蛋白质浓度的测定未知样品必须进行稀释调整，使2ml中含有1～10mg蛋白质，才能进行测定。
吸取1ml 1:10稀释的血清待测液，用水补足到2ml。
操作同前，平行做两份。
与标准曲线的各管同时比色。
比色后从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再按照稀释倍数求出每毫升血清原液的蛋白质含量。
【试剂和器材】一、试剂（1）标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05N氢氧化钠配制。
（2）双缩脲试剂：溶解1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石腊的瓶中。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。
3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。
二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。
当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。
该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。
- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。
五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。
六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。
- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。
2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。
- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。
3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、熟悉分光光度计的使用。
3、学会绘制标准曲线，并通过标准曲线计算未知样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲（NH₂CONHCONH₂）在碱性溶液中能与铜离子（Cu²⁺）作用，形成紫红色的络合物。
由于蛋白质分子中含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也能发生类似的反应。
而且，反应所产生的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，在 540nm 波长处有最大吸收峰。
据此，可以通过比色法测定蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料标准蛋白质溶液：浓度为 10mg/mL 的牛血清白蛋白溶液。
未知蛋白质样品溶液。
双缩脲试剂：由硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆·4H₂O）和氢氧化钠（NaOH）配制而成。
2、仪器分光光度计。
移液管（1mL、5mL、10mL）。
容量瓶（100mL）。
试管及试管架。
四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干净的试管，编号为 1 6 号。
按照下表在各试管中分别加入试剂：｜试管编号|1|2|3|4|5|6|｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（mL）｜0|02|04|06|08|10|｜蒸馏水（mL）｜10|08|06|04|02|0|｜蛋白质含量（mg）｜0|2|4|6|8|10|向各试管中加入 4mL 双缩脲试剂，摇匀后，在室温下放置 30 分钟。
以 1 号试管为空白对照，在 540nm 波长处，用分光光度计测定各试管中溶液的吸光度值（A）。
以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品蛋白质含量的测定取 2 支干净的试管，编号为 7 号和 8 号。
在 7 号试管中加入 1mL 未知蛋白质样品溶液，8 号试管中加入1mL 蒸馏水作为空白对照。
向 7 号和 8 号试管中分别加入 4mL 双缩脲试剂，摇匀后，在室温下放置 30 分钟。
以 8 号试管为空白对照，在 540nm 波长处，用分光光度计测定 7 号试管中溶液的吸光度值。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量一、双缩脲法实验原理双缩脲法测定蛋白质含量实验中，双缩脲是在大约180°C条件下加热两个尿素分子，以达到释放出一个氨分子而获得的产物。
在强碱性溶液中，缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物，称为缩二脲反应。
任何包含两个酰胺基或两个直接连接的肽键或可以通过中间碳原子连接的肽键的化合物都将发生缩二脲反应。
紫色复合色的强度与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。
它可以用来确定蛋白质含量。
测量范围是1-10mg蛋白质。
干扰测定的主要物质是：硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸。
这种方法的优点是速度快，不同的蛋白质产生相似的颜色，干扰物质少。
主要缺点是灵敏度差。
因此，缩二脲法通常不用于蛋白质的精确测定。
二，双缩脲法所需材料1种试剂：标准蛋白溶液的制备：用标准结晶牛血清白蛋白（bsa）或标准酪蛋白制备10mg/ml标准蛋白溶液。
可以用0.66a280校准纯度，bsa浓度为1mg/ml。
如有必要，可以使用标准蛋白质预先通过微凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，计算其纯度，然后称重，并根据其纯度制备标准蛋白质溶液。
用H2O或0.9％NaCl制备牛血清白蛋白，用0.05NaOH制备酪蛋白。
双缩脲试剂制备：称取1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O），6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），溶于500ml水，在搅拌下加入300ml10％NaOH溶液，用水稀释至1升，储存在塑料瓶（或内壁涂有石蜡的瓶子）。
该试剂可以长期保存。
如果在储存瓶中出现黑色沉淀物，则需要对其进行重新配制。
2台设备：可见光分光光度计，15个大试管，涡旋混合器等三，双缩脲法的实验步骤1标准曲线的确定：将12个试管分为两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质标准溶液，用水补足1ml，再加入4ml缩二脲试剂。
摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，并在540nm下测量颜色。
第一个不含蛋白质溶液的试管是空白对照溶液。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告实验目的：通过双缩脲法测定不同食品中蛋白质的含量，掌握蛋白质含量的测定方法，为食品质量检测提供参考。
实验原理：双缩脲法是一种测定蛋白质含量的方法，其基本原理是将蛋白质与双缩脲在酸性条件下发生酸水解反应，生成氨氮。
然后利用盐酸与氢氧化钠溶液将氨氮中和，最后用硫酸亚铁溶液滴定未反应的氢氧化钠，从而计算出蛋白质的含量。
实验步骤：1. 样品制备，将不同食品样品按照一定比例加入试管中，加入适量的双缩脲溶液和盐酸溶液，混合均匀后静置片刻。
2. 酸水解反应，将试管放入沸水中进行酸水解反应，控制时间和温度，使反应充分进行。
3. 氨氮的中和，取出试管，加入氢氧化钠溶液，使氨氮中和。
4. 滴定，用硫酸亚铁溶液滴定未反应的氢氧化钠，记录滴定消耗的体积。
5. 计算，根据滴定的体积计算出样品中蛋白质的含量。
实验结果：经过实验测定，不同食品样品中蛋白质含量分别为，样品A为12.5g/100g，样品B为9.8g/100g，样品C为15.2g/100g。
实验分析：通过实验测定得出的结果，可以看出样品C中蛋白质含量最高，样品B次之，样品A最低。
这与我们平常对这些食品的认知基本一致，也验证了实验方法的准确性和可靠性。
实验结论：双缩脲法是一种简便、准确的测定蛋白质含量的方法，通过本次实验，我们成功测定出不同食品中蛋白质的含量，并得出了合理的结论。
这为我们今后进行食品质量检测提供了参考和依据。
总结：本次实验通过双缩脲法测定了不同食品中蛋白质的含量，掌握了该方法的操作步骤和原理，提高了我们对蛋白质含量测定方法的理解和掌握程度。
同时，也增强了我们对食品质量检测的实际操作能力和实验数据分析能力，为今后的实验和科研工作打下了坚实的基础。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告双缩脲法测定蛋白质含量实验报告引言：蛋白质是生命体内不可或缺的重要营养物质，对于维持生命活动和促进生长发育具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
本实验选用双缩脲法测定蛋白质含量，通过对其原理、步骤和结果的详细描述，探讨该方法的可行性和准确性。
实验原理：双缩脲法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
该方法基于蛋白质与双缩脲在碱性条件下发生酸解反应，生成氨基酸和缩脲。
然后，通过与酚类试剂发生酚酞反应，产生红色化合物，利用比色法测定其吸光度，从而间接测定蛋白质含量。
实验步骤：1. 准备样品：将待测样品溶解在适量的缩脲溶液中，并加入一定量的氢氧化钠溶液，使其呈碱性。
2. 酸解反应：将样品置于水浴中，加热至沸腾，保持一段时间，使蛋白质充分酸解。
3. 加入酚类试剂：待样品冷却后，加入酚类试剂，与缩脲反应生成红色化合物。
4. 比色测定：将反应液转移到比色皿中，利用分光光度计测定其吸光度。
实验结果：通过实验测定，我们得到了不同浓度的蛋白质溶液对应的吸光度值，并利用标准曲线法计算出了各个样品的蛋白质含量。
结果显示，吸光度与蛋白质浓度呈正相关关系，且线性关系良好。
通过对样品的测定，我们准确地测定了其蛋白质含量。
讨论：双缩脲法测定蛋白质含量具有操作简单、结果准确、灵敏度高等优点，被广泛应用于生物学、医学等领域。
然而，该方法也存在一些局限性。
首先，该方法对于某些特殊的蛋白质样品可能不适用，例如含有酶活性的蛋白质。
其次，该方法对于其他物质的干扰较为敏感，如胆红素、尿素等，可能会导致结果的误差。
因此，在实际应用中，我们需要根据具体情况选择合适的方法来测定蛋白质含量。
结论：通过本次实验，我们成功地利用双缩脲法测定了不同样品中蛋白质的含量，并得到了准确的结果。
该方法操作简单、结果准确，适用于大多数蛋白质样品的测定。
然而，在实际应用中，我们需要注意该方法的局限性，并结合具体情况选择合适的方法进行蛋白质含量的测定。
双缩脲法实验一蛋白质含量测定
6 1.2
0.8 1.0 5.0
0.0
2.0 1.0 5.0
五 操作
3.2.2 样品浓度测定 吸1 mL多糖液分别用蒸馏水稀释到100倍后， 再取1mL稀释到100倍，待用。 取2mL稀释后的多糖溶液，加入1 mL5%苯酚 混匀,迅速加5mL浓硫酸,振摇5 min,室温静 止显色20 min,于490 nm处进行比色测定, 将所得的吸光度值代入回归方程,得到多糖 浓度。
五、操作
2、平菇多糖的分离纯化
将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖
液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，
在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，
将烧杯中的溶液放在离心管中，在
4000r/min条件下离心15min，得到平菇多
糖沉淀。
五 操作
3、平菇多糖的鉴定
离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用
3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离
子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白 质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应：大分子跑得慢，小分子跑得快 (3)电荷效应 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝 胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因 素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDSPAGE测定蛋白质分子量。
实验一双缩脲法测定蛋白质含量
实验一双缩脲法测定蛋白质含量实验一:双缩脲法测定蛋白质含量一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。
二原理双缩脲( )是两分子尿素经180?左右加热,放出一分子氨( NH)后得到的产物。
在强碱溶液中，双缩脲与CUSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
34 其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。
蛋白质含有多个2+肽键，在碱性溶液中能与CU络合成紫红色的络合物。
其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。
tris(三甲羟基氨基甲烷)、一些氨基酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。
在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。
反应产物在540nm处有最大吸收峰(吸光度)。
将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量(浓度)。
由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。
三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机(器)、漏斗、试管架、具塞三角瓶(100ml) 容量瓶(250 ml、500 ml、1000 ml)、刻度吸管(1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml)试管(1.5cmX15cm)。
四试剂1、双缩脲试剂称取硫酸铜(CUSO?5HO)1.5g，酒石酸钾钠( )426.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下(可用旋涡混合器或摇动)加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度(1000ml)。
将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。
此试剂可长期保存(须无红色或黑色沉淀出现)，长期使用。
双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一CO-NH2)，或与此相似的基团［如一CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1〜10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近, 敏度以及干扰物质少。
主要的缺点是灵差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材［试剂］1 •双缩脲试剂：取CuSO4 • 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol/L NaOH溶液300ml, KI 1.0g，然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
［器材］1. 试管：15X 150mm试管7只；2. 1ml，5ml 移液管；3. 坐标纸;4. 721分光光度计。
四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作:混匀，37C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。
【生物化学实验】双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验开始！
3.0
标准管 2×2 3×2 4×2
0.4
0.6
0.8
—
—
—
0.6
0.4
0.2
3.0
3.0
3.0
5×2 1.0
— — 3.0
测定管 ×2
—
0.1 1.9 3.0
✓ 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波 长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。
在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标， 两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲 线。
➢ 常用方法：
1. 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线 不同，表明物质的化学结构不同。
2. 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同； 化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不 同。
3. 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
利用吸收光谱对物质进行定量分析
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
实验目的 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 掌握分光光度计的使用 掌握标准曲线的制作 学习分光光度法测定的原理和方法
实验原理
双缩脲反应（Biuret reaction）
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2NOC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接 的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。
➢ 原理： Lambert-Beer定律
➢ 常用方法：
1. 标准曲线法
2. 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显 色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白 溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条 通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
蛋白质含量测定-双缩脲试剂法实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；1.2.掌握双缩脲试剂的配制；1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义；1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
二、实验原理2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
三、材料与方法：3.1.实验材料：3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。
3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤0.9%Nacl 0.5 - -双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0测定次数1 2 3 平均吸光度依据公式算出结果：）蛋白质标准液浓度（）血清总蛋白（g/LAAg/LSU⨯=四、结果与讨论：4.1.实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。
（如图一）图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数S 0.185 0.184 0.185 0.1847U 0.152 0.151 0.152 管号0.1517结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。
双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1～10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材[试剂]1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
[器材]1．试管：15×150mm 试管7只；2．1ml，5ml移液管；3．坐标纸；4．721分光光度计。
四、实验操作混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。
生物化学实验2.双缩脲测定血清蛋白质含量
蛋白质是生命的物质承担者，要揭示生命 的本质，探讨各种生命活动的物质基础，就必 须对蛋白质的结构、性质和功能进行深入的研 究，这首先就需要将蛋白质分离出来，进行纯 化，再进一步进行测定。
蛋白质是是构成人体及动物细胞组织的重要成分，参 与机体内的各种生命活动
人体内蛋白质含量直接关系着人体的健康状况，测定 蛋白质含量在临床上尤为重要。
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
-
1 2 4 6 8 10
混匀后，37℃水浴中放置20分钟，然后在540nm波长 处，以空白管调零，在分光光度计上读取各管吸光度， 以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度（g/L）为横坐标，绘 制标准曲线。
实验步骤
2、样品测定
取2只试管，分别标上测定管和空白管，加入试剂
注意事项
加完试剂需要将试管混匀 注意水浴的温度及时间 分光光度计的正确使用
标准溶液
实验原理
绘制出蛋白质标准溶液的标准曲线：以吸光 度为纵坐标，蛋白质浓度（mg/mL）为横坐 标，绘制标准曲线。
在相同的实验条件下，测定未知蛋白质含量 的血清样品溶液，在540nm处的吸光度，查 标准曲线求得样品的蛋白质浓度（g/L）。
试剂和仪器
(一）试剂 1、双缩脲试剂：取3g硫酸铜，500mL蒸馏水 溶解，加9g酒石酸钾钠、5g碘化钾，加入 100mL6mol/L氢氧化钠，用蒸馏水稀释到 1000mL，贮存于塑料瓶中，避光保存。 2、0.9%（W/V)NacL溶液 3、小牛血清 4、蛋白质标准溶液
血清蛋白质中某些蛋白质含量的变化可以作为临床上 某些疾病诊断的依据
方 法 灵敏度 时间 原 理 干扰物质 说 明
凯氏定氮法 (Kjedahl法)
实验双缩脲法测定蛋白质含量
2．常用方法
（1）标准曲线法
▪ 标准曲线与样品的测定条件必须一致。
（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称 为摩尔吸光系数。
微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量
被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出 氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加 入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽 馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶 液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测 样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计 算样品的含氮量。
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA
试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收 值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋 白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以 通过测定染料在595nm处光吸收的增加量 得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅 速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法 灵敏4倍）。
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A ⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测
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原理
在碱性环境下，具有两个以上肽键的物质 与双缩脲试剂中的铜离子反应，形成紫红 色的络合物，颜色的深浅与肽键的多少即 蛋白质含量呈正比。
双缩脲法是基于铜离子与蛋白质之间的反应。 溶解于碱性溶液中的硫酸铜加入蛋白质溶液 中，二价的铜被还原为一价的铜并在碱性环 境中与蛋白质分子肽键中的氮形成络合物。 该络合物呈紫红色， 可在540 nm波长下进 行检测，吸光度与蛋白质含量成正比。
混匀
置37℃水浴30 分钟, 在540nm 波长下以0号管调零测各管吸光度
★实验结论: ___号待测蛋白浓度为_____ ★实验结束,清洗仪器,锁好抽屉,钥匙交班长处 ★所有实验报告装订好，按学号顺序放讲台上
2、绘制标准曲线
★实验结论中注明待测蛋白编号 ★实验结束,清洗仪器,锁好抽屉,钥匙交学委处 ★所有实验报告订好，上交时按学号顺序叠好
1、取8支试管，按下表操作
试剂 0
1
2
3
4
5
6
测定管
卵清蛋白溶液
(6mg/ml)
—
0.3ml 0.6ml 0.9ml
1.2ml
1.5ml
1.8ml
3.0ml 待测蛋白
蒸馏水 3.0ml 2.7ml 2.4ml 2.1ml 1.8ml 1.5ml 1.2ml —
双缩脲试剂 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml
蛋白质浓度标准曲线
A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
ห้องสมุดไป่ตู้
0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6 蛋白质浓度 （ ）
722光电比色计使用
1.放入液体 2.调波长 3. 模式 “透射比”，开盖，调“0%” 4.将对照管对准光路， 关盖，调“100%”
5.将“模式”选定为“吸光度”，拉动拉杆依次读 各管吸光度，并记录。
双缩脲法测定蛋白质含量 biuret method
双缩脲是尿素的缩合物，双缩脲法采用双缩 脲试剂。然而，双缩脲试剂并不含双缩脲， 但双缩脲及蛋白质都对铜具有相同的反应， 因此，双缩脲法是一个在碱性环境中利用硫 酸铜溶液来测定蛋白质含量的一般述语。双 缩脲试剂由氢氧化钾(KOH)、硫酸铜(CuSO4) 及酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)组成。