双缩脲法测定蛋白质

不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收
λ＝ 550nm
A
µg/ml
物质定性分析常用方法
原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长
标准管法 对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。 A标 =K标c标b标 A测 =K测 c测 b测 c测 =A测 /A标 ×c标
分光光度计的基本构造
光源
单色器
样品室
受光器
测量器
仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入 样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显 示出吸光度（A）或透光度（T）。
比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。
上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。
分光光度法
一般性实验-1
光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm，人的眼睛感觉不到的
要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必
须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗 净放好。
在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教 师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔 偿和处理。
还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而
是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。
溶液的颜色与吸收光颜色的关系
光吸收示意图
I0
I
C
b
吸收光谱和物质的定性分析
物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
端。 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
吸量管的使用注意事项
生物化学与分子生物学实验
实验记录
实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程 中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。 要求： ⑴ 真实性 ⑵ 原始性 ⑶ 完整性 ⑷ 条理性
实验报告的书写
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包 括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结 论等项目。
实验室规则
上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大 声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。
实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法 步骤。
实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记 录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。
严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
试剂使用规则
使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免
在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测
定蛋白质浓度。
NH2 CO
NH2
CO
NH2 NH2 加热180oC?
NH +NH3
CO
CO
NH 2
NH 2
紫红色铜双缩脲复合物分子结构
显色剂与显色反应
在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比 色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转 变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。
在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了 保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下： 1. 选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。
2. 各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml，充分混匀； 3. 37度水浴30min； 4. 在540nm 处以0号管调零点测定各管吸光度； 5. 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标； 6. 对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。
注意事项
读数时要注意读的是A的值； 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）； 准确记时。
实验目的
了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，
称为双缩脲反应。
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能
与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白
ຫໍສະໝຸດ Baidu
质的浓度。
相同，吸收系数不同。 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
物质的定量分析
标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定 时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐 标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
实验步骤
1.按下图表所示加入相应的试剂或样品
试剂
管号
01
2 34 5
6
牛血清标准蛋白溶液（ml） 2mg/ml
—
0.6
1.2 1.8 2.4 3.0
0
待测蛋白液（ml）
— — — — — — 3.0
蒸馏水（ml）
3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0
蛋白质浓度（mg/ml）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 未知
玻璃器皿的一般清洗方法
一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗， 再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。
容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用 铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次，干燥 备用。
污染瓶中的标准液体。 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
吸量管的使用
正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
722分光光度计使用注意事项
样品室盖应轻开轻放； 比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水
冲洗干净，倒置于滤纸上； 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”。
双缩脲法测定蛋白质含量
722分光光度计使用方法
接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min; 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样
品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应; 调好波长; 调节按钮
开盖时，调 T 参数 调为 100 合上盖，调 A 参数 调为 0; 逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）; 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。