双缩脲法测定蛋白质26页PPT
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A＝KCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度 T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则A＝KC
相同，吸收系数不同。 ➢ 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
物质的定量分析
玻璃器皿的一般清洗方法
➢ 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗， 再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。
➢ 容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用 铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次，干燥 备用。
不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收
λ＝ 550nm
A
µg/ml
物质定性分析常用方法
➢ 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 ➢ 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 ➢ 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长
➢ 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。
➢ 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。
分光光度法
一般性实验-1
➢ 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 ➢ 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm，人的眼睛感觉不到的
端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
吸量管的使用注意事项
实验室规则
➢ 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大 声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。
➢ 实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法 步骤。
➢ 实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记 录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组பைடு நூலகம்样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 ➢ 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而
是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。
溶液的颜色与吸收光颜色的关系
Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律
➢ 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 ➢ 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。
➢ 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。 ➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必
须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗 净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教 师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔 偿和处理。
实验记录
实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程 中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。 要求： ⑴ 真实性 ⑵ 原始性 ⑶ 完整性 ⑷ 条理性
实验报告的书写
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包 括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结 论等项目。
光吸收示意图
I0
I
C
b
吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
污染瓶中的标准液体。 ➢ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ➢ 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
吸量管的使用
➢ 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 ➢ 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
➢ 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
试剂使用规则
➢ 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 ➢ 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ➢ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免
相同，吸收系数不同。 ➢ 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
物质的定量分析
玻璃器皿的一般清洗方法
➢ 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗， 再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。
➢ 容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用 铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次，干燥 备用。
不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收
λ＝ 550nm
A
µg/ml
物质定性分析常用方法
➢ 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 ➢ 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 ➢ 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长
➢ 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。
➢ 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。
分光光度法
一般性实验-1
➢ 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 ➢ 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm，人的眼睛感觉不到的
端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
吸量管的使用注意事项
实验室规则
➢ 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大 声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。
➢ 实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法 步骤。
➢ 实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记 录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组பைடு நூலகம்样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 ➢ 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而
是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。
溶液的颜色与吸收光颜色的关系
Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律
➢ 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 ➢ 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。
➢ 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。 ➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必
须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗 净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教 师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔 偿和处理。
实验记录
实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程 中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。 要求： ⑴ 真实性 ⑵ 原始性 ⑶ 完整性 ⑷ 条理性
实验报告的书写
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包 括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结 论等项目。
光吸收示意图
I0
I
C
b
吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
污染瓶中的标准液体。 ➢ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ➢ 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
吸量管的使用
➢ 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 ➢ 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
➢ 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
试剂使用规则
➢ 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 ➢ 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ➢ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免