几丁质的提取技术

合集下载

几丁质_壳聚糖在植物保护中的研究与应用进展_赵蕾

生物防治几丁质、壳聚糖在植物保护中的研究与应用进展赵蕾汪天虹(山东省科学院生物研究所济南 250014) (山东大学微生物技术国家重点实验室)几丁质(chitin),又称甲壳素,广泛分布于于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼,节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。

与植物的纤维素一样,具有保护及支持生物体的作用。

壳聚糖(chitosan),又称几丁聚糖,是几丁质经脱乙酰作用而得到的一种氨基多糖,存在于某些生物体内,特别是真菌的细胞壁上。

近年来,对这类在自然界含量仅次于纤维素的几丁质和壳聚糖的研究与应用日益扩大,本文介绍其在植物保护中的应用潜力。

1 几丁质与壳聚糖的特性几丁质是一种构造类似于纤维素的直链聚合物,约由1000~3000个N -乙酰葡萄糖胺单体以B -1,4键构成的高分子糖类聚合物,其中约每6个N -乙酰葡萄糖胺连接一个葡萄糖胺[1]。

几丁质在生物体中以对称同向或反向非平行的糖链以氢键结合而成。

由于氢键结构十分强固,使得几丁质在物理性质和化学性质上较其它多糖类具有更高的稳定性。

对一般溶剂抗性大,只溶于强无机酸、氟化醇及含有5%氯化锂的N,N .-二甲基乙酰胺中。

壳聚糖为几丁质经去乙酰作用后失去乙酰基产物的总称,去乙酰程度为65%~99%,一般以70%~80%最常见。

分子特性为可生物分解,溶于10%的己二酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸等。

其中以甲酸为最好溶剂,在无机酸中的溶解度则相当有限。

几丁质与壳聚糖的化学结构式见图1。

2 几丁质与壳聚糖诱发植物防御机理分析几丁质与壳聚糖在植物保护中的作用正在引起有关方面的重视。

其诱发植物防御系统的机理是,病原菌入侵植物时,植物本身即有辨认系统,能识别病菌入侵。

而病菌细胞壁上的几丁质即扮演被辨认的角色,使被侵染植株中原本低量而具活性的几丁质酶大大提高,以分解入侵病菌细胞壁上的几丁质。

植株内产生的几丁质寡糖活化植物细胞膜上的蛋白质激发酶,使细胞内的酶产生磷酸化反应提高酶的活性,启动植物的防御系统并产生植物干扰素、酚类复合物等抗病物质,对病原菌产生抑制作用,这些反应均在数小时内完成。

人工饲养家蝇蛆和蛹提取几丁质的研究

第22卷第3期2002年8月赣南医学院学报JOU RN AL O F GAN NA N M EDICAL COL LEGEV ol.22N O.3AU G.2002人工饲养家蝇蛆和蛹提取几丁质的研究苏水莲1,李娟1,胡雅琼2,谢学斌2,廖华2(1.赣南医学院病原生物学教研室;2.赣南医学院显微实验室,江西赣州 341000)摘要:目的:提取蝇蛆表皮和蛹壳的几丁质。

方法:在实验室内人工饲养家蝇48天,传代饲养3代,用人工竹筛分离收集蝇蛆和蛹,并用清洗、脱钙、脱脂、漂白、脱乙酰基、干燥的方法初步提取了几丁质。

结果:获得蝇蛆表皮几丁质0.8g和蛹壳几丁质2g。

结论:用人工饲养家蝇所得到的家蝇蛆表皮和蛹壳的几丁质含量分别为60%~70%。

关键词:家蝇;蝇蛆;蛹;几丁质中图分类号:R384.2 文献标识码:A 文章编号:1001-5779(2002)03-0227-03家蝇(housefly)的繁殖在昆虫世界位居第一,繁殖力强,饲养周期短,无滞育现象,而饲养便宜,其幼虫具有丰富的蛋白质和氨基酸和纯度极好的几丁质。

90年代后期国内外医学界人士对家蝇进行昆虫抗菌蛋白、几丁质的生产提取越来越产生浓厚的兴趣。

发现几丁质是纠正现代文明疾病的良药,是医药界急待研发的好项目。

而人工饲养家蝇育蝇蛆和蛹提取几丁质的研究未见报道,为了探索蝇蛆、蛹中几丁质的提取,我们在实验室内人工饲养家蝇48天,传代饲养3代。

现将结果报告如下。

1 材料与方法1.1 蝇种中国科学院动物研究所抗生组提供(间接从吉安市永丰县农业局购买)。

1.2 饲料配制及饲养方法接卵缸的饲料配制设A、B两组,每组3笼蝇种,A组用麦麸100g奶粉1g,水为200ml。

配制时先用少量热水将奶粉调匀,然后放入麦麸、水拌匀。

B组在A组的混合饮料中再加入30g锯末搅匀,然后加入万分之二的碳酸铵水液3滴。

幼虫饲料:同接卵缸A组饲料。

成蝇喂以奶粉和红糖为1 1及少量水。

几丁质的提取技术

几丁质的提取技术几丁质是一种在动物和植物界广泛存在的重要生物聚合物，具有多种生物活性和应用潜力。

因此，开发高效的几丁质提取技术对于利用几丁质的功能具有重要意义。

一种常见的几丁质提取技术是酸碱法。

该方法通过酸碱处理将几丁质从其所在的生物材料中提取出来。

首先，将生物材料经过粉碎和筛网处理，得到细粉末。

然后，将细粉末浸泡在酸性溶液中，使几丁质与酸反应生成溶解态的几丁质酸盐。

接下来，将酸性溶液中的几丁质酸盐用碱性溶液中和，使几丁质从酸盐状态转变为溶胶状态。

最后，通过离心、过滤和干燥等操作，得到纯净的几丁质。

除了酸碱法，还有一种常用的几丁质提取技术是酶解法。

该方法利用几丁质酶将几丁质从生物材料中水解出来。

首先，将生物材料经过粉碎和筛网处理，得到细粉末。

然后，将细粉末与几丁质酶溶液混合，在适宜的温度和pH条件下进行酶解反应。

几丁质酶能够特异性地降解几丁质，使其分解为较短的寡聚糖和单体糖。

最后，通过离心、过滤和干燥等操作，得到纯净的几丁质。

还有一些新型的几丁质提取技术正在不断发展和研究中。

例如，超声波辅助提取技术利用超声波的机械作用和热效应来促进几丁质的提取过程。

超声波的震荡和剪切作用能够破坏生物材料的细胞壁结构，有利于几丁质的释放和提取。

同时，超声波的热效应也可以提高提取效率，加速几丁质的溶解和扩散。

这种技术具有提取效率高、操作简便、时间短等优点。

还有一些其他的几丁质提取技术，如微波辅助提取技术、离子液体提取技术等。

这些新兴的技术都在不同程度上改善了传统提取技术的不足之处，提高了几丁质的提取效率和纯度。

几丁质的提取技术是利用化学、酶解、超声波等方法将几丁质从生物材料中提取出来的过程。

酸碱法和酶解法是两种常见的提取技术，而超声波辅助提取技术、微波辅助提取技术、离子液体提取技术等是一些新兴的提取技术。

这些技术的不断发展和创新将为几丁质的应用和开发提供更多的可能性。

几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良

几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良齐齐晗尔医学院2008年第29卷第4期几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良张可勇刘兴汉赵炜明【摘要】目的探索亲和层析的方法,采用有效的方法提高几丁质树脂的使用效力和使用次数,降低成产成本使之更有利于提高产量.方法考察几丁质纯化的过程.探索出如何提高几丁质珠的重复使用次数,寻找出适合工业生产的纯化步骤结果用高浓度的碱液进行洗枉,并延长浸泡时间到1h,可以使几丁质珠使用次数由原来的4～5次增加到7～8次.结论实验结果证实采用提高碱液浓度并延长浸泡时问可以增加几丁质树脂的使用次数,有利于指导实验室实验和药物开发.【关键词】蛋白质纯化亲和层析凡丁质ChitinaseproteinpurifiedbyaffinitychromatographymethodsimprovedZHANGKe——yong,eta1.(DepartmentofBiochemiatryandMolecularBiology,HarbinMedicalUniversity,ttarbin,H eilorl卣iang150086China)[Abstract]0bjectiveExploreaffinitychromatographymethod,theadoptionofeffectivemea nsto enhancechitinresineffectivenessandtheuseoffrequencyofuse,lower—costproductiontomakeitmoreconducivetoraisingoutput.MethodsInvestigationchitinpurificationprocess,andexpl orehowtoimprovethechitinbeadsrepetitionfrequencyofuse,findingsuitableindustrialproductionandpurifica—tionsteps.ResultsWithahighconcentrationofcausticwashingcolumn.andtheextensionofi mmer—siontimetolh,canmakeuseofchitinbeadsfrom4—5timesthenumberincreasedto7～8times.Con-clusions,l,heexperimentalresultsconfirmedusinglyeimproveconcentrationandtheextensi onofim—mersiontimechitincanincreasethefrequencyofuseresin,toguidethelaboratoryexperiment sanddrugdevelopment.[Keywords]ProteinpurificationChromatographyChitinase蛋白的纯化离不开层析.层析通常用于蛋白的后期纯化过程中,包括离子交换层析,凝胶层析(分子筛),亲和层析.前两种成本低但效果不理想,不同程度造成目的蛋白的损失和杂蛋白的混人,甚至使目的蛋白稀释,活性降低等.亲和层析由于目的蛋白与层析介质问能发生特异性结合,可以去除所有的杂蛋白,只保留目的蛋白,特异性高.小分子多肽由于分子量小,在纯化过程中极易丢失,所以亲和层析尤其适合以融合形式表达的小分子多肽的纯化.内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立,可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化出目的蛋白j】.我室前期构建的多种工程菌表达的均采用TYB类质粒载体.由该载体转化的工程菌表达的融合蛋白含有几丁质结合域和内含肽两部分功能元件.几丁质结合域可与几丁质树脂紧密结合,这样目的蛋白,内含肽和几丁质结合蛋白在一起以融合蛋白形式表达.内含肽足一种自剪接元件,一端与几丁质结合蛋白构成载体蛋白,另一端与目的多肽相结合,当含有巯基的化合物(DTT.8一巯基乙醇)存在时,内含肽与目的多肽间肽键断裂,经缓冲液洗脱而得到目的多肽,而载体蛋白仍吸附在几丁作者单位:哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室:作地址:齐齐哈尔医学院邮编150086收稿日期2008—01～17质柱上.然后,用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放,从而实现柱的再生.但传统的方法柱的再生只能重复使用4～5次,由于树脂的成本较高,如何提高几丁质柱的使用次数使几丁质使用效力最大化是限制其临床应用及产业化开发的重要因素.1材料与方法1.1材料1.1.1菌种本实验室前期构建的内皮抑素(en—dostatin,ES)抗肿瘤相关的3O肽_4.1.1.2试剂酵母提取物,胰蛋白胨(TaKaRa),异丙基硫代8一D一半乳糖苷(IpTG,TakaRa),二硫苏糖醇(DTT),考马斯亮蓝G250(TaKaRa),考马斯亮蓝R250(TaKaRa),Tris(Sigma),甘氨酸(Prorna—ga),溴酚兰(Promaga),几丁质亲和树脂(Chitinbeads,NEB),HEPES(TaKaRa),-f二烷基硫酸钠(SDS)EDTA,甲叉双丙烯酰胺(Sigma),过硫酸铵,丙烯酰胺,其它试剂均为国产分析纯.1.2实验方法1.2.1几丁质结合使用效力的测定挑取平板上3O肽基因工程表达菌的单菌落至20ml含氨苄青霉素(100tLg/m1)的IB培养基中,37℃,110r/min振荡过夜.次日,按1:50比例将前一日培养的菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养至A∞一0.5时加入IPTG终浓度为0.5mmol/L,28℃诱导表达6h,将菌液5000r/min, 4℃,离心10min,收集菌体沉淀,称量菌体湿重(3.5 克).将菌体沉淀加入裂解液,超声波细胞粉碎仪进行裂解,400Hz,工作2s,间歇4s,共用时50min.裂解的菌液12000r/rain,4℃,离心15min,取上清.以略超载的菌体上清量上样.获得目的多肽的同时,记录几丁质使用次数与0.3mol/LnaOH洗脱载体蛋白风高度的关系,保持记录器灵敏度及基线刻度不变. 1.2.2几丁质再生使用次数的测定分别取四支儿丁质层析柱各加入lml几丁质珠,每支几丁质柱用最大承载的工程菌量上样.第一支儿丁质柱样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.第二支几丁质柱反复上样4次,每次在进行洗柱的过程中用至少l0倍柱床体积的0.3mol/ LNaOH洗柱,此时出现的峰即是载体蛋白峰(内含肽一几丁质结合蛋白),继续洗脱,待基线平稳后,用20倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOtt,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.在进行第五次上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.第三支几丁质柱同样进行反复上样7次,每次在进行洗柱的时加大NaOH的浓度,延长洗脱时间.每次用l0倍柱床体积的0.5mol/INa()H进行洗柱,待基线平稳后,将几丁质柱上下接口对接,让NaOH在几丁质注中浸泡lh有效的去除载体蛋白.然后用20倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOH,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.在进行第八次上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.同样用0.5mol/LNaOH进行洗柱,待基线平稳后,将几丁质柱上下接口对接.让NaOH在几丁质注中浸泡1h有效的去除载体蛋白.然后用2o倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOH,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.进行第九次上样,上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.分别将留取的四个样品进行SDS—PAGE电泳.浓缩胶为5,分离胶为12的SDS—PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,取1O.ul的样品加入4O肚l的凝胶上样缓冲液,混匀,煮沸5min,瞬时离心,将2oj上1的样品混合液上样.浓缩胶采用80V电压,分离胶采用120V电压,电泳待溴芬兰接近电泳槽底部时卸下胶[】.考马斯亮蓝R一250染色过夜后用脱色液进行脱色,观察判定结果.2结果2.1几丁质结合使用效力的测定结果利用同一组1ml几丁质树脂进行重复试验,获得几丁质柱复性峰样(图1).由于复性时间不均等,峰高存在不规律性. JournalofQiqiharMedicalCollege,2008,V o1.29.No.41,2再生时间4O分钟;3,4,8,1O再生时间6O分钟;5,7,9再生时间30分钟;6再生时间50分钟.峰高直接显示瞬时载体蛋白浓度. 峰宽与液体流速有关,与蛋白■无关.图1同一组3ml几丁质树脂使用次数,再生时间与结台载体蛋白■关系图.图示续号为几丁质树脂使用次数2.2几丁质再生使用次数的测定结果将述四个样品连同上样液进行SDS—PAGE电泳,如图2显示,四条条带均未出现融合蛋白条带,说明经过上述处理,用0.5mol/INa0H进行洗柱,浸泡lh后能有效的去除载体蛋白.能最大限度的提高几丁质柱的使用次数.12341.第一支几】质柱;2.第二支几丁质柱(使用五次);3.第三支几丁质柱(使用八次);4.第四支几丁质柱(使用九次) 图2几丁质再生使用次数测定结果3讨论3.1几丁质结合使用效力的测定在几丁质结合效力测定过程中,采用1O轮亲和再生验证(图1所示),结果证明使用次数对柱子的结合力影响并不明显.另外,可看载体峰高与浸泡时间成正比关系,再生时.浸泡1小时能有效的去除载体蛋白.而浸泡时间不足,造成再生不充分,将使大量无效载体蛋白占据结合位点,影响柱子的结合效力,不利于下一轮结合,降低了蛋白产量.3.2几丁质再生使用次数的测定在几丁质再生使用次数的测定过程中,四个样品进行SDS—PAGE电泳(如图2所示),结果证明采用高铱度的Na()H,由0.3mol/L提高到0.5mol/L,并增加浸泡时问1h能更有效的去除载体蛋白.此外,由于目的蛋自裂解效力很难达到百分之百,为防止其他蛋白污染.建议同一根柱子不要用于不同蛋白的纯化.向时建议几丁质柱使用次数不要超过8次,因为经过多次的使用,几丁质柱难免会受到污染.通过本实验初步证实了几丁质树脂可重复利用齐齐喻尔医学院2008年第29卷第4期粘着斑激酶在喉及下咽鳞状细胞癌组织芯片中的表达及意义姜洪波肖玉丽鲁建光陈伟刚【摘要】目的应用组织芯片免疫组化技术探讨粘着斑激酶(FAK)表达与喉和下咽鳞状细胞癌生物学行为的相关性.方法设计制作喉及下咽鳞状细胞癌组织芯片,应用免疫组化技术在组织芯片上检测FAK的表达,分析FAK表达与喉及下咽鳞状细胞癌临床和病理分期的相关性.结果FAK在原发癌中的阳性表达率为96.Oof72/75),明显高于癌旁正常组织(13,/29,44.83,P<0.01);淋巴结转移癌中FAK的阳性表达率为1oo.oo(20/20),明显高于癌旁正常组织(P<0.001);有淋巴结转移组FAK表达率为95.35(41/43).明显高于无淋巴结转移组(12/32,37.50,P<0.01);高分化组FAK表达率明显低于中,低分化组(P<o.001);而FAK的表达率与肿瘤的原发部位,浸润范围(T分期),年龄和性别等因素均无明显相关性(P>0.05).结论FAK在喉癌和下咽癌组织中高表达,其表达率与喉癌和下咽癌的分化程度和淋巴结转移有关,可作为临床预测喉癌和下咽癌颈淋巴结转移趋势和估计预后的主要参考指标之一.【关键词】喉肿瘤癌鳞状细胞下咽肿瘤抗原粘着斑激酶Expressionandsignificanceoffocaladhesionkinase(FAK)intissuemicroarrayoflaryngeal andhypopha'ryngealsquamouscellcarcinomaJlANGHong一.eta1.(ENT,FirstHospital,Qiqihar,Hei' lOilgJiang161005China)[Abstract]Objective7"oinvestigatetheexpressionofthefocaladhesionkinase(FAK)inlary n—gemandhypopharyngealsquamouscellcarcinomasandanalyzetherelationshipbetweenFA Kexpression andbiologicalbehaviorofthiscancerbyusingtheimmunohistochemistryintissuemicroarra y.MethodsWedesignedandmadeatissuemicroarrayoflaryngealandhypopharyngealsquam ouscellcar—cinoma(SCC).andinvestigatedtheexpressionofFAKinSCCofthelarynxandhypopharynx byimmu—nohistochemistryinthetissuenficroarray,thenanalyzedtheclinicalsignificanceofFAKexpr essioninthiscancer.ResultsInprimarycancertissue,theexpressionrateofFAKwas58.67(44/75),sig nifi—cantlyhigherthannormaltissue(34.48,lo/29,P<o.05);FAKexpressionrateinlymphnode meta—staticcarcinomais95.00(19,20),obviouslyhigherthannormaltissue(P<0.001)andprima rycane—ertissue(P<0.01);FAKexpressionraleofthegroupwithlymphnodemetastasisishigherth angroupwithoutlymphnodemetastasis(P<0.05);theexpressionrateofthewell～differentiatedgroupwas higherthanmoderatelyandpoorlydifferentiatedgroup(P<0.001).ConclusionsFAKisov erexpres—sioninSCCoflarynxandhypopharynx,theexpressionrateisconcernedwithdegreeofcelldif ferentia—tionandmetastasisoflymphnode,itmaybecomeapredictindexofmetastasisandprognosiso fthela—ryngealandhypopharyngealsquamouscellcarcinoma.【Kcyords]Laryngealneop[asmsCarcinomasq,lalllOUScellhypopharyngealneoplasms An?tigensFAK粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)是一种非受体酪氨酸激酶,在肿瘤的增殖,生存,迁移,埕作者单位;黑龙江省齐齐哈尔市第一医院耳鼻咽喉科(姜洪波,陈伟)哈尔滨医科大学附属第::医院耳'鼻咽喉一头颈外科(肖玉丽,鲁趱光)通讯作者:鲁建光哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉一头颈外科邮编161005收稿一期2008 (0113)393?袭,转移和血管生成等生物行为中起着重要的调控作用【.研究发现,FAK在多种上皮及间充质源的肿瘤中高表达或过度激活,参与肿瘤的发生,发展和侵袭转移.作为一种细胞粘附分子,FAK及其变异体在肿瘤的发生,发展和转移过程中所起的作用被引起广泛重视.喉和下咽鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤.严重威胁着人类的健康.本研究应用多次而结合效力不会明显下降,通过提高碱液的浓良能增加柱子的使用次数,在一定程度上降低了药物生产的成本,为利朋基因工程技术从事小分子多肽新药的生产提供了技术借鉴,具有一定的实践意义.一i-9—]E33参考文献[4]r1]O'ReillyMS.BoehmT,ShingY,eta1.Endostatin:ai1enck)g—enousinhibitorofanglogenesisandtumorgrowth[J].Cel1.1997,88(2):27_,_一285骆成玉,赵丹宁,李世拥,等.内皮抑素对结肠癌肝转移的干预作用EJ].中华外科杂志,2001,39(3):188—200黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002: l564一l594朱厚础译.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].北京:科学出版社,2000:l4l—l92。

几丁质及高附加值产物酶法生产关键技术研究

几丁质及高附加值产物酶法生产关键技术研究几丁质是自然界产量仅次于纤维素的可再生性多聚物。

自然界在不断产生大量几丁质的同时，微生物也合成了大量能够降解几丁质的不同性质的酶。

几丁质在自然界的广泛分布，意味着能够分解利用几丁质及其类似物的微生物也有着广泛的分布。

环境的多样性、微生物种类的多样性为人类筛选不同性质不同要求的几丁质及其衍生物降解酶提供了可能性。

近年来几丁质及其脱乙酰基产物壳聚糖和他们的寡糖，几丁寡糖和壳寡糖，在诸如食品、制药、材料科学、微生物学、组织工程、纳米材料等很多领域得到广泛的应用。

因此对几丁质及其相关产物形成巨大的需求，但是目前无论几丁质的工业化生产，还是几丁质脱乙酰基生产壳聚糖或生产几丁寡糖、壳寡糖，均以化学方法为主，几乎都要用到强酸强碱，对环境造成极大的污染。

因此迫切需要开发新的绿色生产工艺。

采用生物学或酶学方法制备几丁质、壳聚糖及其寡糖具有生产条件温和可控，对环境污染少的优点，因此是替代化学方法的理想技术，也是目前的研究重点。

目前几丁质的生产主要是从虾蟹壳中采用盐酸和氢氧化钠分别脱除碳酸钙和蛋白质的办法，尽管有了一些改进，但是仍需要使用强酸或强碱。

另一方面，科研人员从自然界，特别是海洋环境中已经筛选出很多和几丁质分解有关的酶，如几丁质酶( EC3.2.1.14 )、几丁质脱乙酰基酶(CDA; EC3.5.1.41) 和壳聚糖酶(EC3.2.1.99) 等，但是都普遍都存在酶活力不够高和酶产量低的问题，因此多处于实验室阶段，尚未应用于工业生产。

基于此，本研究首先尝试采用蛋白酶和有机酸分别脱除虾壳中蛋白质和碳酸钙的办法生产几丁质，然后从与海洋环境差异巨大的秦岭山区不同生境中采集土样，从中分离新型几丁质酶和几丁质脱乙酰酶高产菌株，并对其培养基和发酵条件进行优化。

本研究尝试采用柠檬酸脱钙、胃蛋白酶去除蛋白质的工艺从虾壳中提取几丁质。

首先以灰分的含量为指标，通过单因素试验确定柠檬酸浓度和处理时间的最佳参数，即浓度12%的柠檬酸溶液处理13 小时。

以几丁质为基础原料生产酒精的工艺的制作方法

本技术涉及生物工程技术领域，具体来说是一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，包括预处理、几丁质的提取、壳聚糖的制备、壳聚糖提取物的降解及发酵过程，本技术以虾或蟹的甲壳为原料，经过一系列方法得到了几丁质、壳聚糖及分子量分布在10KD20KD范围内的低聚壳聚糖提取物，再将低聚壳聚糖提取物与酵母菌共同发酵，得到了酒精产品，实现了虾或蟹的甲壳的废物利用，降低了虾或蟹的甲壳对环境造成的污染，并且降低了粮食和石油的资源浪费，且具有广泛的应用空间。

权利要求书1.一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、预处理：挑选无恶臭、无腐烂的虾或蟹的甲壳，剃去残肉，清洗干净，然后冷冻干燥，并在-20℃下贮藏，得到备用甲壳；步骤2、几丁质的提取：提取步骤1的备用甲壳中的几丁质，得到几丁质提取物；步骤3、壳聚糖的制备：提取步骤2几丁质提取物中的壳聚糖，得到壳聚糖提取物；步骤4、壳聚糖提取物的降解：将步骤3制备得到的壳聚糖提取物与纤维素酶、壳聚糖酶及无菌水按照100：2-3：3-5：100的质量比混合，于50-70℃下搅拌2-4h后，然后调节pH为3-5，再加入H2O2溶液，在40-50℃下反应2-4h，并且反应过程中每隔0.5-1h进行超滤，收集分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物；步骤5、发酵：将步骤4制备得到的低聚壳聚糖提取物溶于水形成体积分数为10-20％的低聚壳聚糖溶液，在低聚壳聚糖溶液中接种酵母菌，调节pH为5.5-6.5，并在温度为30±5℃、摇床转速为50-150r/min的发酵条件下，避光密封厌氧发酵5-7天，定时排气，直到不产生二氧化碳气体，得到酒精产物。

2.根据权利要求1所述的一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，其特征在于，所述步骤2的提取过程为：将备用甲壳完全浸没于质量分数为3-8％的HCl溶液中，搅拌9-14h后，清洗至中性，然后将处理后的甲壳完全浸没于质量分数为8-10％的NaOH溶液，并加热至75-100℃搅拌1.5-3.5h，趁热过滤，再加入HCl调节至中性后，依次通过质量分数均为1％的KMnO4和NaHSO4溶液进行漂洗，每次漂洗1h，然后水洗至中性，冷冻干燥，得到几丁质提取物。

医学三基考试(中药鉴定技能)名词解释题及答案

医学三基考试（中药鉴定技能）名词解释题及答案第 1 题林下参【正确答案】：油人工播种，在山林自然环境中不经人工干预生长的人参的干燥根及根茎，称之为"林下参"。

第 2 题公防风【正确答案】：防风一般在植株未抽苔前挖取。

此时采收的药材体轻、质松，质量好。

植株抽苔以后采收的，根老质硬。

不能药用。

俗称为"公防风"。

第 3 题连续四分法【正确答案】：取样方法之一。

将总样品摊成正方形，依对角线划"×"字，使分成四等分，取用对角两份；再如上操作，反复数次至最后剩余的量足够完成所有的必要的试验以及留样数为止，称为"连续四分法"取样。

第 4 题金井玉兰【正确答案】：经验鉴别术语之一。

指某些药材横切面上，皮部白色或黄白色，木部淡黄色或黄色，状如金玉相映，习称为"金井玉兰"。

如黄芪。

第 5 题无影纹【正确答案】：经验鉴别术语之一。

羚羊角全体光润如玉，若对光照视，质嫩的先端可见血丝、斑点，无裂纹，称为"无影纹"。

第 6 题钉头【正确答案】：代赭石一面可见的圆形乳头状突起习称"钉头"。

有钉头的赭石称"钉头赭石"。

第7 题珍珠虹光【正确答案】：珍珠虹光环是指珍珠磨片在显微镜下暗视野中可见特有的一圈圈彩光。

第8 题相对密度【正确答案】：是指在相同的温度(通常为20℃)和压力下，待测物质的密度与水的密度之比。

第9 题十大广药【正确答案】：指主产于广东的广藿香、广陈皮、广佛手、广地龙、阳春砂、化橘红、益智仁、高良姜、金钱白花蛇、沉香等十种道地药材。

第10 题中药鉴定学【正确答案】：中药鉴定学是研究和鉴定中药的品种与质量，制定中药质量标准，寻找和扩大新药源的应用性学科。

第11 题中药材【正确答案】：中药材是指经过简单的产地加工，便于包装、运输、储藏，一般不直接用于临床的中药。

几丁质粉末

几丁质粉末几丁质粉末是一种常见的天然产物，广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。

它具有多种独特的性质和功能，对人体健康有着重要的保护作用。

本文将从几丁质粉末的来源、制备方法、应用领域等方面进行详细介绍，让我们一起来了解一下几丁质粉末吧。

一、几丁质粉末的来源几丁质是一种天然存在的多聚葡萄糖胺，主要存在于甲壳类动物的外壳和真菌的细胞壁中。

常见的几丁质来源包括虾、蟹、贝类等海产品以及蘑菇等真菌。

这些生物体在生长和代谢过程中，会产生大量的几丁质，通过提取和加工处理，可以得到几丁质粉末。

几丁质粉末的制备方法主要有酸法法、碱法法和酶法法等。

其中，酸法法是最常用的方法之一。

具体制备步骤如下：1. 将几丁质原料加入酸性溶液中，通过酸的作用将几丁质分解成几丁糖；2. 将几丁糖溶液进行过滤和洗涤，去除杂质；3. 将洗涤后的几丁糖溶液进行干燥和粉碎，得到几丁质粉末。

三、几丁质粉末的应用领域1. 医药领域：几丁质粉末具有抗菌、抗炎、促进伤口愈合等多种药理活性，被广泛应用于医药领域。

例如，可以制备成敷料、药膏等，用于治疗烧伤、创伤等皮肤损伤。

2. 食品领域：几丁质粉末可用作食品添加剂，具有增稠、保湿、抗氧化等功能。

例如，可以用于乳制品、面包、肉制品等食品的改良，提高食品的质地和口感。

3. 化妆品领域：几丁质粉末具有良好的保湿性能和皮肤修复功能，被广泛应用于化妆品领域。

例如，可以用于面膜、乳液、护肤霜等产品中，具有滋养皮肤、减少皱纹等作用。

4. 环境领域：几丁质粉末可以作为生物材料，用于水处理、废水处理等环境领域。

例如，可以用于去除水中重金属离子、有机物等污染物，净化水质。

四、几丁质粉末的优势和发展前景1. 天然可再生：几丁质粉末来源于自然界的生物体，属于天然可再生资源，具有较高的环境友好性。

2. 生物相容性：几丁质粉末具有良好的生物相容性，不会引起明显的过敏反应和副作用，适用于不同人群的使用。

3. 多功能性：几丁质粉末具有多种功能，可以应用于医药、食品、化妆品等多个领域，具有广阔的市场前景。

木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯

木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯沈奕1,伍万荣1,高智谋1*,王革2(1.安徽农业大学植物保护学院,安徽合肥230036;2.云南玉溪红塔集团生化研究中心,云南玉溪653100)摘要 [目的]为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供必要的技术支持。

[方法]由高产几丁质酶的木霉菌株Y H S 1液体振荡培养得到木霉几丁质酶粗酶液,分别测定了木霉菌株Y H S 1在不同时间、不同温度下的几丁质酶活值,优化木霉产酶条件。

并研究了几丁寡糖的制备及提纯方法。

[结果]供试木霉最佳产酶温度为35 ,最佳产酶时间为4d ,此时酶活值为55U 。

几丁质酶粗酶液通过(NH 4)2S O 4分级沉淀、阴离子交换柱层析、SDS PAGE 提纯后可以达到层析纯,出现单一并且峰值很高的层析峰,电泳确认2条带,分别为几丁质外切酶和几丁质内切酶。

几丁寡糖用初提纯的几丁质酶与过量的胶态几丁质反应得到粗溶液,再经过蛋白质沉淀和冷冻离心后得到纯化。

[结论]建立了木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯方法,为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供了必要的技术支持。

关键词木霉;几丁质酶;几丁寡糖;制备;提纯中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)16-07332-02Preparatio n and Purificati on of Tri chode ma Ch iti nase and Chitooli gosacchari de S HEN Y i et al (College of P l ant Protecti on ,AnhuiAg ricult ura lUn i versit y ,H ef e,i A nhui 230036)Abstract [Objecti ve]The technica l support for t he preparati on and purifica tion of Tr i chode ma chiti nase and chitooligosacchar i de was prov i d ed .[M ethod]The crude s o l uti on of T ric hode ma ch iti nase was obta i ned fro m t he liqui d o f T richode ma strai n YH S 1cu l tured and t he chitinase activity of T ric hode ma strai n YH S 1at the different tm i es(1,2,3,4and 5days)and te mperat ures (20,30,35and 40 )were deter m i ned ,respecti vely ,for t he research on t he its preparati on and pur i ficati onm et hod .[Results]The results showed that t he optm i u m te mperature for the production o f chiti nase w as 35 and t he optm i u m tm i e ,t he fort h day and at t he conditi on ,enzy m e acti vity was 55U.Chro m at ographica l l y pure chiti nase cou l d be obta i ned by (NH 4)2S O 4fractional preci p i tati on ,an i on exchange chro m atography ,S DS PAGE .A si ngular and hi gh chromatog raphy peak coul d be f ound and t wo e l ectrophoretic bands coul d be va li da t ed fro m gel e l ectrophoresis .T he t w o bands are exochitinase and endochiti nase .The crude extract of chiti noo li gosacchar i de was produced by enzymolysis o f ch i ti nase and co lloi d ch iti n .The pure chiti noo l i gos acchari de could be obtai ned t hrough the pur ificati on of the crude extract w it h prote i n sedm i entati on and refri gera t ed centrifugation .[Con cl usi on]The preparati on and pur i ficati on met hod of Tr ic hode ma ch iti nase and ch i tooli gos acchari de was establi shed .K ey words T ric hode ma ;Ch i ti nase ;Chitoo li gosaccharide ;P reparati on ;Purifi cati on .基金项目安徽省教育厅自然科学重点项目(2006KJ 057A )。

甲壳素几丁质的制备实验

5
三、甲壳素的开发应用前景
► 甲壳素中的主要成分几丁质与几丁聚醣是由天然物质所制取的生物高分子，与天物体细胞有良好的生物兼容性（biocompatibility），不具毒性且可以被生物体分解，具有生物活性，因此广泛地应用在医药食品等方面。甲壳素的主要应用方向有：
1、机能食品 2、医药用品 3、食品加工 4、纺织品 5、环保用品
2
► 在自然界中几丁质是地球上含量最丰富的胺基醣型式的多醣，含量仅次于纤维素；它主要存在于昆虫类及水生甲壳类等无脊锥动物的外壳上，以及真菌类的细胞壁，它在生物体中所扮演的角色主要是用来作为身体骨架及保护作用。
► 虾（螃蟹）壳里各有三成左右的蛋白质、碳酸钙和几丁质 (chitin)。用稀碱去除其蛋白质，再用稀酸来排除碳酸钙，就能得到较纯的几丁质(chitin)。再将几丁质(chitin)处理就变成了几丁聚醣(chitosan)。甲壳素普遍存在于植物中的低等藻类、菇类和真菌的细胞壁，以及动物中的昆虫、甲壳类外层表皮，其中以虾蟹外壳为几丁质最常见之来源。根据文献报导，全球虾蟹壳年产量近2,000万吨，贝类、蚵类年产几丁质139万吨，发酵副产品中的丝状菌类年产几丁质79万吨，几丁质可谓取之不尽，用之不竭。
► 甲壳素另外还具有缓释性：利用几丁聚醣及其它成胶物质形成一错合物，可包埋药物或其它以达到控制物质释出之特性，以使药物于适当的时间释放适当的剂量。
► 另外，甲壳素在医药方面的用途还有血液凝固阻抗剂、促创伤愈合等功效。
8
么么么么方面
►Sds绝对是假的
3、食品加工
► 甲壳素具抗菌性，因此在食品加工上可用为食物防腐用，避免使用人工合成的防腐性，是较健康的食物保存剂。
► 沉淀物用水洗涤至中性，在室温下浸泡于2.5mol/L的氢氧化钠溶液中24小时，得沉淀物。

一种提取几丁质的方法

一种提取几丁质的方法
提取几丁质的方法可以通过以下步骤进行：
1. 粉碎：将获得的几丁质样品粉碎成较小的颗粒状，以增加提取效果。

2. 中和：将几丁质颗粒与酸性溶液（如盐酸）反应，使其变为阳离子形式。

3. 溶解：将中和后的几丁质溶于酸性溶液中，由于几丁质具有碱性基团，其阳离子形式会与溶液中的酸基团发生离子交换，使几丁质溶解在溶液中。

4. 过滤：将溶解的几丁质溶液通过滤纸或孔径合适的过滤器进行过滤，以去除杂质和固体颗粒。

5. 沉淀：将过滤后的溶液中的几丁质以盐酸或其他碱性溶液中和，使几丁质从溶液中沉淀出来。

6. 洗涤：用适量的去离子水或其他溶剂将沉淀中的杂质洗去，可多次重复此步骤。

7. 干燥：将洗涤后的几丁质沉淀放置在通风条件下，使其自然干燥或通过加热干燥。

注意：上述提取几丁质的方法仅为一种常用方法，实际应用中可能还需要根据具体实验目的和条件进行优化和改进。

第十二章微纳米颗粒制备技术

壳聚糖、海藻酸与白蛋白、白蛋白与阿拉伯胶等。
• 现以明胶与阿拉伯胶为例，说明复凝聚法的基本原理。将溶液pH值调至明胶的等电点以
下使之带正电（pH 4.0～4.5时明胶带的正
电荷多），而阿拉伯胶仍带负电，由于电荷
互相吸引交联形成正、负离子的络合物，溶
解度降低而凝聚成囊，加水稀释， pH值是
8～9，加入甲醛交联固化，洗去甲醛，即

单凝聚法和复凝聚法的异同
制备微胶囊,单凝聚法只需要一种囊材, 复凝聚法需要两种带电荷相反的囊材; 沉淀微胶囊时,单凝聚法需要额外加入物质使其沉淀,而复凝聚法只需调节pH

3. 溶剂-非溶剂法(solvent-nonsolvent)

是在囊材溶液中加入一种对囊材不溶的溶剂 ( 非溶剂 ) ，引起相分离，而将药物包裹成囊的方法。药物可以是固体或液体，但必须对溶剂和非溶剂均不溶解，也不起反应。
(3) 成囊条件
① 凝聚系统的组成：明胶、水、硫酸钠、固化剂，可以用三元相图来寻找成囊系统产生凝聚的组成范围。
② 明胶溶液的浓度与温度：增加明胶的浓度可加速胶凝，浓度降低到一定程度就不能胶凝，同一浓度时温度愈低愈易胶凝，而高过某温度则不能胶凝，浓度愈高的可胶凝的温度上限愈高。通常明胶应在37℃以上凝聚成凝聚囊，然后在较低温度下粘度增大而胶凝。 ③ 药物及凝聚相的性质：单凝聚法在水性介质中成囊，因此要求药物在水中极微溶解，但也不能很疏水。微囊化的难易取决于明胶同药物的亲和力，亲和力强的易被微囊化。

1. 单凝聚法(simple coacervation)

是相分离法中较常用的一种，它是在高分子囊材 ( 如明胶 ) 溶液中加入凝聚剂，以降低高分子溶解度凝聚成囊的方法。

几丁质培养基制备

一、几丁质分解菌的分离几丁质也称壳多糖或称甲壳素，广泛地分布于海沙、海泥、海水、淡水和土壤，以及吃几丁质的头足类动物的胃肠，虾、蟹体表中．如几丁色色杆菌、嗜几丁杆菌、呈色几丁杆菌和蚀几丁芽孢杆菌等。

它们将几丁质分解成中间产物醋酸与还原糖，最终产物为二氧化碳与氨．1 ．几丁质培养基制备（1）几丁质的制取：洗净蟹壳或将大海虾壳浸泡在l%HCl 中7 天，( 2 天换盐酸溶液1 次）脱去壳的钙质，使壳变得柔软而有韧性。

然后用水洗净外壳，剪成1×3 厘米壳条。

用2 %氢氧化钾溶液浸泡壳条10 天，每2 天加热一次，加热的温度低于沸点为宜，借以除去几丁质以外的其他物质，如色素和蛋白质等。

用蒸馏水洗净壳条上的碱，然后用乙醇抽提数次．直到全部颜色脱净为止。

这样的几丁质适用于液体培养基培养未纯化的细菌，和保存几丁质分解菌．如用于琼脂培养基中的几丁质，必须将这种去净杂质的几丁质研细分散于培养基中．这可用去杂质的若干几丁质条放于3 升的瓶中，在另一个烧瓶中准备好1500毫升冷水，用100 毫升5%的硫酸加到装几丁质条的烧瓶中，当几丁质刚溶解完时，迅速加入已准备好的1500 毫升冷水将酸稀释，静置过夜，使几丁质重新沉淀出来，轻轻倒出上清液．反复离心，洗涤沉淀至使石蕊呈中性。

或将几丁质放在一个透水的玻璃纸袋里悬挂在流水中，使酸透析完全。

按1：10，使几丁质重新悬浮于水中。

取5 毫升悬液于直径10 厘米培养皿时，以仍呈轻微而又清晰的乳白色为宜。

将悬液分装于试管中，每管10 毫升，于121 ℃下灭菌15 分钟。

（2）几丁质无机盐培养基制备：K2HPO4 1.0克MgSO4·7H2O 0.5克NaCl 海水菌用30克淡水菌0.5克CaCl2·2H2O 0.1克FePO4·2H2O 0.001 克NH4Cl 1.0克H2O 1000毫升溶解上列无机盐类，调pH 为7.0分装于试管中，每管10毫升，各管加l 条去杂质的几丁质条，于121℃蒸汽下灭菌15分钟，冷后保存待用，（3）无机盐琼脂培养基：将上述培养基的无机盐成分全部溶于水后，加入2％的琼脂（不加几丁质）加热溶解之，调pH 为7.0 ，分装于试管中，分与每管5 毫升和10 毫升的两种，在121 ℃蒸汽中灭菌15分钟.（1）几丁质琼脂培养基：K2HPO4 0.7克KH2PO4 0.3克MgSO4·7H2O 0.5克FeSO4·7H2O 0.01克ZnSO4 0.001克琼脂10 克蒸馏水1.0升Ph7.0以上为基础培养基，以121 ℃蒸汽灭菌20 分钟、每100 毫升加20毫升胶体几丁质悬浮液和5 毫克放线菌酮，或制成用于分离放线菌的双层平板．底层用基础琼脂和放线菌酮，上层用胶体几丁质培养基。

几丁质生物合成的机制

几丁质生物合成的机制几丁质是一种多糖类物质，与纤维素类似，可溶于酸，同时也是一种生物高分子材料，主要存在于昆虫外骨骼、甲壳类动物外壳和菌物细胞壁中。

几丁质的生物合成机制涉及到多种酶和蛋白质的参与，其过程大致可分为下面几个步骤：1. 合成和分泌NsyltransferaseNsyltransferase是几丁质生物合成过程中的关键酶，能够将N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）与核苷酸底物结合，生成不同长度的多聚物，并将其转运到细胞外。

这种酶由具有相似结构的家族成员组成，并且在不同的物种中具有不同的表达模式。

多数昆虫及真菌中能够发现Nsyltransferase，但在甲壳类动物中则是由多个不同的酶来完成。

在细胞内部，Nsyltransferase由细胞高尔基体合成，并成为泡体或小體结构的一部分，最终被包装进小胞体内部，准备转运到细胞外。

Nsyltransferase由内质网的高尔基体合成，通过细胞分泌途径转运到细胞外。

细胞分泌途径包括囊泡运输、内质网高尔基体侧劈、内P表面滞留、液泡分化和内分泌途径等。

在昆虫中，内质网高尔基体偏向分泌途径，但在甲壳类动物中则会被内质网固定，并在内膜表面形成塑料片。

这种塑料片被解离成小胞体结构，然后由评价槽、基膜、基膜与细胞外液交界处的负电性环境提供跳跃所需能量，实现转运到细胞外。

在昆虫的外骨骼中，Nsyltransferase能够与胶原和壳聚糖等其他蛋白质相互作用，诱导这些多聚物的体外合成和组装。

胶原是构成昆虫外骨骼的主要成分之一，而壳聚糖则是甲壳类动物外壳的主要成分。

当Nsyltransferase与这些多聚物接触时，胶原分子之间的交叉链接就会增加，从而加强了外骨骼的耐磨性和韧性。

同样的，壳聚糖的交叉链接也变得更加密集，加强了外壳的刚性和硬度。

4. 后期修饰和切割在这个生物合成过程的后期，几丁质受到酶的修饰和碎片剥离。

例如，在昆虫外骨骼中，一种叫做几丁质酶的酶可以降低胶原的交叉链接密度，从而增加其柔软性。