猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析
猪白细胞介素-2基因的克隆与表达
（ ｉ ｌ ｕ ｂ ｎ ｒ ｎ ｔｒｎ ｒ ｓａ ｃ ｎ ｔｔ ｔ Ｓ Ａｎ ｍａ ｓａ ｄ ｙ ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａ ｙ Ｒｅｅ ｒ ｈ Ｉ ｓｉｕ ｅ， ＡＡＳ， ｈ ｎ ｈ ｉ ０ １ ６， ｈ ｎ ） Ｈ Ｓ ａ ｇ ａ １ ０ Ｃ ｉ ａ ２ Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ ：Ｂａ ｅ ｎ ｔ ｅｐ ｂ ｉｈ ｄ ｎ ｃｅ ｔｄ ｅ ｕ ｎ ｅｏ ｏ ｃｎ ｔ ｒｅ ｋ ｎ ２ Ｉ ・ ） ｅ ｅ ａｐ ｉ ｆ ｓ ｄｏ ｈ ｕ ｌ ｅ ｕ ｌｏ ｉｅｓ ｑ ｅ ｃ ｆｐ ｒｉ ｅｉ ｅ ｌｕ ｉ－ （ Ｌ ２ ｇ ｎ ， ａｒｏ ｓ ｎ
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14397549_猪JHDM2A基因的克隆及表达分析
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一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析
一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊【摘要】应用猪繁殖障碍性病毒性疫病6重PCR检测方法对贵州省开阳县某规猪场送检的1头疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病死仔猪进行病原检测,确诊感染有猪圆环病毒2型(PCV2)后,对该病毒全基因组进行扩增,将其克隆到pMD19-TSimple载体上,筛选获得了重组质粒pMD19-T-PCV2,并对其进行序列测定和分析.结果表明:克隆得到的PCV2毒株的基因组全长为1 767 bp,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为94.1％～98.4％,根据欧盟猪圆环病毒疾病委员会规定的PCV2基因型划分标准,将PCV2 GZ-KY1毒株划分为PCV2b亚型.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2014(050)008【总页数】3页(P20-22)【关键词】猪圆环病毒2型;基因组;克隆;序列分析【作者】王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学教学实验场,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。
PMWS于1997年首次在加拿大报道，随后在美国、法国、德国、日本等多个国家相继报道。
近年来该病在我国普遍流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1]。
2000年郎洪武等首次报道中国猪群存在PCV2感染，阳性率为42.9%[2]。
2007年周绪斌等报道在2000-2005年间20多个省市PCV2感染平均阳性率达55.04%[3]。
根据崔亚兰等对贵州省2007-2011年猪圆环病毒感染的流行病学调查结果表明，PCV2在贵州省的感染日益严重[4]；另根据本实验室对2011-2012年间贵州部分地区的PCV2血清学调查发现，PCV2野毒感染的阳性率高达61.3%[5]。
猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究的开题报告
猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究的开题报告题目: 猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究一、研究背景ApoER2和VLDLR是细胞膜上的两种受体，与神经元迁移和突触塑性等过程有关。
它们在哺乳动物和家禽中的结构和功能已有较深入的研究，但在猪中的研究尚不足够。
同时，猪是重要的经济动物，其神经系统发育和认知能力等方面的研究对于提高猪的生产效益和研究人类疾病具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在克隆猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列，分析其基因结构和表达特点，并进行功能鉴定，以进一步深入了解其在猪神经系统发育和认知能力等方面的作用。
三、研究方法1. 克隆猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列，进行生物信息学分析和基因结构预测。
2. 利用RT-qPCR技术检测猪不同组织中ApoER2和VLDLR基因的表达水平，并进行差异分析。
3. 利用CRISPR/Cas9技术建立ApoER2和VLDLR基因敲除的细胞系，检测其对神经元迁移和突触塑性的影响。
4. 构建ApoER2和VLDLR基因的过表达重组质粒，转染至细胞系中进行功能鉴定。
四、研究意义1. 构建猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列并分析其基因结构可进一步了解其在猪神经系统发育和认知能力等方面的作用和机制。
2. 通过RT-qPCR技术检测不同组织中ApoER2和VLDLR基因的表达水平，可以研究它们在不同组织和疾病中的作用。
3. 利用CRISPR/Cas9技术建立ApoER2和VLDLR基因敲除的细胞系可深入了解其在神经元迁移和突触塑性等方面的作用和机制。
4. 构建ApoER2和VLDLR基因的过表达重组质粒并进行功能鉴定，可以研究它们对神经系统发育和认知能力等方面的作用和机制。
五、研究进展及展望目前，已完成了猪ApoER2和VLDLR基因的克隆和序列鉴定，正在进行基因结构预测和表达分析。
6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析.
动物医学进展,2006,27(7:66273Progress in Veterinary Medicine6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析3黄伟坚,连慧香,尹业师,屈素洁,李军,余克伦,罗廷荣,陆芹章,刘芳(广西大学动物科技学院,广西南宁530005中图分类号:S852.659.2;S858.28文献标识码:A文章编号:100725038(20060620066208摘要:参考GenBank发表的PCV22全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV22流行株的全基因,并进行了序列测定分析。
结果表明,6个分离株基因组全长为1768bp或1767bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5% ~100%,与GenBank上已发表的PCV22分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。
6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。
关键词:猪圆环病毒2型;全基因组;同源性;变异猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV22是近年来兽医界关注较多的新发现病毒之一,具有重要的科研价值和经济意义。
PCV22是引起断奶后仔猪多系统衰竭征的主要病原体[1],随着对PCV22研究的不断深入,发现PCV22还与仔猪的A2型先天性震颤、怀孕母猪的繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征及猪呼吸道综合征等临床疾病有关[2]。
PCV22的主要危害在于能够使感染猪的免疫功能受到损害[324],导致机体抵抗力下降,易遭受其他病原的并发或继发感染,使病情加重,造成巨大的经济损失。
这种可导致机体免疫抑制的病毒,由于经常以亚临床感染的形式出现,常被忽视。
最近两三年,广西地区也出现了与PCV22相关疾病的报道[5],而且危害逐年增加。
本研究通过流行毒株的全基因克隆与测序,分析PCV毒株之间的遗传发生关系和分子差异,探索PCV22变异规律,为今后深入研究该病的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供科学依据。
猪圆环病毒Ⅱ型盐城株的全基因组克隆与序列分析
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 ２００１，９８（１５）：８９０９－８９１４．［１２］ＰｉｍｅｎｔａＬＪ，ＬｉｅｂｒａｎｄｔＡ，ＡｒｎｏｌｄＬ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｏｘｉｄａｓｅｓｆｒｏｍｃｕｃｕｍｂｅｒ，ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，９０：６２－６９．［１３］ＳｐｉｅｌｍｅｙｅｒＷ，ＥｌｌｉｓＭ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＭ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｇｅｎｅｓｆｒｏｍｂａｒｌｅｙａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｍａｐｐｉｎｇｉｎｂａｒｌｅｙ，ｗｈｅａｔａｎｄｒｉｃｅ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０９（４）：８４７－８５５．［１４］ＷｕＪＺ，ＭｉｚｕｎｏＨ，ＳａｓａｋｉＴ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｉｃｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｉｃｅ，２００８，１（２）：１１９－１２６．［１５］ＬｏＳＦ，ＹｕＳＭ，ＣｈｅｎＬＪ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔａｇｇｉｎｇｏｆａｎｅｗｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ２－ｏｘｉｄａｓｅｃａｕｓｅｓａｄｗａｒｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｉｎａＴ－ＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１３２（３）：１２８３－１２９１．［１６］ＴｅｎｇＦ，ＺｈａｉＬＨ，ＬｉｕＲＸ，ｅｔａｌ．ＺｍＧＡ３ｏｘ２，ａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｆｏｒａｍａｊｏｒＱＴＬ，ｑＰＨ３．１，ｆｏｒｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，７３（３）：４０５－４１６．［１７］ＫｉｍＣＭ，ＰｉａｏＨＬ，ＰａｒｋＳＪ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄ，ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＤｓｔｒａｎｓｐｏｓａｎｔｌｉｎｅｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＤｓｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００４，３９（２）：２５２－２６３．［１８］ＳｕｎＢＹ，ＰｉａｏＨＬ，ＰａｒｋＳＨ，ｅｔａｌ．ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｏｐｔｉｍａｌｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＴＡＩＬ－ＰＣＲｉｎｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＤｓｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍＡｃ／Ｄｓｉｎｓｅｒｔｉｏｎｒｉｃｅｌｉｎｅｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２０（６）：８２１－８２６．［１９］ＴａｋｅｄａＫ．Ｉｎｔｅｒｎｏｄｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｎｄｄｗａｒｆｉｓｍｉｎｓｏｍｅｇｒａｍｉｎｅｏｕｓｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＧａｍｍａＦｉｅｌｄＳｙｍｐｏｓｉａ，１９７７，１６：１－１８．［２０］ＢｕｅｌｌＣＲ，ＹｕａｎＱ，ＯｕｙａｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｙｎｔｅｎｙｂｅｔｗｅｅｎｒｉｃｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ３ａｎｄｄｉｖｅｒｇｅｄｇｒａｓｓｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２００５，１５（９）：１２８４－１２９１．［２１］ＢａｉＬ，ＳｉｎｇｈＭ，ＰｉｔｔＬ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｎｏｖｅｌａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，１７５（３）：９８１－９９２．［２２］ＺｈｏｕＬ，ＭｉｔｒａＲ，ＡｔｋｉｎｓｏｎＰＷ，ｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｈＡＴｅｌｅｍｅｎｔｓｌｉｎｋｓｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｄＶ（Ｄ）Ｊｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３２（７０２０）：９９５－１００１．［２３］ＳｃｏｔｔＬＡ，ＬａｆｏｅＤ，ＷｅｉｌＣＦ．ＡｄｊａｃｅｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅＤＮＡｒｅｐａｉｒａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｅｘｃｉｓｉｏｎｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌ＆ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｙｇ，１９９６，１：１８３－１８９． ［２４］ＬａｚａｒｏｗＫ，ＤｏｌｌＭＬ，ＫｕｎｚｅＲ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｍａｉｚｅＡｃ／Ｄｓｅｌｅｍｅｎｔｓ：ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０５７：５９－８２．陶宏卫，郭广富，曹军平，等．猪圆环病毒Ⅱ型盐城株的全基因组克隆与序列分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１６）：３９－４１．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１６．００９猪圆环病毒Ⅱ型盐城株的全基因组克隆与序列分析陶宏卫１，郭广富１，曹军平１，申建荣２，张晋川１，练国俊１，朱爱萍１，张佳浩１，朱金其３（１．江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州２２５３００；２．江苏泰州泰牧动物医院，江苏泰州２２５３００；３．江苏滨海鸿盛生猪饲养有限公司，江苏滨海２２４５００） 摘要：采用ＰＣＲ方法对采集自盐城地区的疑似猪圆环病毒病病料进行猪圆环病毒Ⅱ型（ＰＣＶ２）全基因组的扩增，确定了２份病料中的ＰＣＶ２的分子特征，分别命名为ＢＨ０７株和ＢＨ１１株，对其进行克隆、测序后，应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。
猪FcγR ⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析
Ａｇ ｉｕｔ ｒ ｌＵｎｖ ｒｉ Ｚｈ ｎ ｚ ｏ ５ ０ ２， ｉ ｒｃ ｌｕ ａ ｉｅｓｔ ｙ， ｅ ｇ ｈ ｕ ４ ０ ０ Ｃｈｎ ａ
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ｐｒ ｒ ｅ ｓ ｇａｐｉｏ ｐｍｅ ｅｉ ｅ ｃｏｄ ｇｔ ｔ ｑｅｃ ｆ ｕｈｈｄｐｒｎ ｃＲＩＢ （ Ｑ ２０ ４ ．ｕｌ ｔ ｅａｄａ ｉ ｃ ｅｏｍ ｄｕｉ ｒ ｆ ｒ ｒ ｄｓ ｎｄａｃｒｉ ｅｓ ｕｎｅｏ ｂ ｓｅ ｏ ｉ Ｆ７ Ｄ ０６ ６ ）Ｎ ｃ ｏｄ ｎ ｍｎ ａｉ ｆ ｎ ａ ｉ ｓ ｇ ｎ ｏｈ ｅ ｐ ｃｅ Ｉ ｅｉ ｏ ｄ
猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析
ｇ ｔ ｗｏ ＰＣＶ １ ｉｏ ａ ｅ ． ｙ ｗｉｈ ｔ ｓ ｌｔ ｓ Ｋｅ ｒ ｓ： ｐｏ ｃｎｅ ｃｒ ｏ ｉｕｓ ｔ ｐ ｙ ｗｏ ｄ ｒ ｉ ｉｃ ｖ ｒ ｙ ｅ ２；ｃ ｍｐｌ ｔ ｎ ｏ ｅ ｅ ｇｅ ｏｍｅ；ｓ ｑｕ ｎｃ ｎ ｌ ｉ ｅ ｅ ｅ ａ ａ ｙｓｓ
在 ， 内许 多 实 验 室 进 行 的血 清 学 调 查 表 明 ， Ｍ— 国 Ｐ
ＷＳ已在我 国大 部分地 区流行 开 来 。２ １ ０ ０年 ， 翟 少 伦［ １ 通过 滚 环 扩 增 技 术从 来 自新 疆 某 猪 场 猪 等 肺 脏病料 中获 得 ２株 Ｐ Ｖ２的全 基 因组 ， 登 录号 Ｃ 其
１ 材料 与方 法
１ １ 病料 、 ． 细胞及 菌株
工 生物 工程 有 限公 司测 序 。
１ ７ 分 子 遗 传 与 进 化 分 析 ．
新疆 昌吉 某 猪 场 （ 疑似 Ｐ ＭＷＳ断奶 仔 猪 的脾 、 肾、 巴 结 等 ） 一 ７ ℃ 保 存 备 用 。 Ｐ １ 淋 ， ， Ｏ Ｋ一５细 胞
新 疆 农 业 大 学 学 报
２ １ ，５ １ ：２ ６ ０ ２ ３ （ ） ４ ￣４
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ Ｘ ｎ ｎ ｇ ｉｕｔｒｌＵ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ａ ｉｊａ ｇＡ ｒｃｌ ａ ｎｖｒｉ ｏ ｉ ｕ ｙ
文 章 编 号 ： ０ ７８ １ （０ ２ Ｏ一０ ２０ １ ０—６ ４ ２ １ ） ｌ０ ４—５
猪 ２型 圆环病 毒 新 疆株 全基 因组 的克 隆 与序 列 分 析
吴 星 星 ， 春 娟 ，王 璐 ，宫 玉 玲 ， 建 华 ， 多 良 郭 孙 冉
（ 疆农业大学 动物医学学院 ， 新 乌鲁 木 齐 摘 ８０５） ３０ ２
要 ： 根 据 ＧｅＢ ｎ ｎ ａ ｋ中猪 ２型 圆 环 病 毒 （ Ｃ ） 核 苷 酸 序 列 ， 计 了一 对 引 物 ， 用 Ｐ Ｒ方 法 从 疑 似 断 奶 仔 Ｐ Ｖ２ 的 设 采 Ｃ
猪硒蛋白P基因克隆、鉴定及组织mRNA相对表达量分析
ChineseJournalofAnimalNutrition
doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.03.027
猪硒蛋白 P基因克隆、鉴定及组织 mRNA 相对表达量分析
汤加勇1 赵 华1* 何爱华1 周继昌2 贾 刚1 刘光芒1 陈小玲1 蔡景义1
在人体中分离得到了 种 quence，SECIS） [1-2] 。
25
硒蛋白[3] ，它 们 很 多 是 作 为 细 胞 重 要 的 抗 氧 化 防
御系统，起着清除氧自由基的作用，具有保护生物
膜完整、解毒和增强机体免疫等功能[4]。 硒蛋白 P
（ SelP） 是 其 中 一 种 较 为 特 殊 的 硒 蛋 白， 它 主 要 是
由肝脏分泌到血浆中的一种含硒分泌性糖蛋白，
人体血浆中约 50%的 Se是以 的形 SelP 式存在[5] 。
高等哺乳动物中硒蛋白一般只有一个 Sec残基，而
SelP是目前在高等生物中发现的唯一含多个 Sec
残基的硒蛋白 。 [6-7] 被 SelP 认为在生物体内起转
运和储存硒的作用[8] 。
目前，虽然在人和鼠中已经通过试验探索了
赵 华 副研究员 硕士生导师 *通信作者： ，
，
，E-mail： zhua666@
3期
汤加勇等：猪硒蛋白 P基因克隆、鉴定及组织 mRNA相对表达量分析
859
部分 的 SelP 功能，但对 而 SelP 言，在以人为模型 的研究中由于不易获得有效的研究材料，使得其 功能及其在代谢中的作用机理尚没有精确的科学 阐明，其生物学功能也还有待于进一步的深入研 究；猪与人类在营养代谢、生理结构和功能、基因 同源性等方面具有较高的相似性，它已成为研究 人类医学问题的一种理想模型。 因此，以猪为模 型研究 的 SelP 生物学功能具有重要意义，然而猪 中完整的硒蛋白 P基因（Sepp1）序列还未见报道。 本试验拟克隆猪 对其基 Sepp1， 因序列进行生物信 息学分析，并对其 在 mRNA 猪不同组织中的分布 情况进行分析，为进一步以猪为模型研究 的 SelP 生物学功能奠定基础。
猪GPS2基因的克隆及表达分析
能蛋 白质．参与了多个细胞的进程 ，能够抑 制酵母中由于Ｇ 一 蛋白信号通路持续激活引起的死 亡。 目前 ，Ｇ Ｐ Ｓ ２ 基因的
研 究 领 域主 要 分 布在 人 、小鼠 等 。在 人 的领 域 ，有 最新 研 究 表 明Ｇ Ｐ Ｓ ２ 基 因调 控细 胞核 中的 基 因表 达 。这 项 研究 发现
脂 胁 、｝ １ Ｊ 【 肉 、心 、肝 、脾 、Ｈ 、肾 、脏ｉ
二 、 实 验 结 果
１ ． Ｇ Ｐ Ｓ ２ 基因的Ｃ Ｄ Ｓ 区序 列 本实验通过对Ｇ Ｐ Ｓ ２ 肽【 夫 １
进＇ ｝ ／ Ｐ ＣＲ － Ｊ ￣ 增 ，所得 产物经 琼脂 糖凝 胶 吨 ！ ． 泳 检测 为 一 明
Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
２ ０ｏ ０ Ｂ Ｐ １ ０ｏ ０ ＢＰ
图１ Ｐ ＣＲ 产 物琼 脂 糖凝胶 电泳图
ｊ ： Ｃ Ｃ ； ＡＡ Ｔ Ｆ Ｃ Ｃ ］ ’ （ （ Ｇ 人Ｇ ＣＧ ＡＧ （ Ｔ Ｆ Ｇ Ａ Ｆ Ａ ＧＡ Ｃ；退 火 温 度
一
、
材 料 与 方 法 选 取 样
Ａ （ ＥＣ Ａ （ Ｉ 『 Ｔ Ｇ １ Ｉ ＇ Ｇ Ｇ ＴＩ ＂ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ；退 火温度为６ ０ 。 Ｃ， 火时Ｉ ＇ ｕ Ｊ 为
０ 秒 ．测定Ｇ ２ 存 长白猪 不同组织 的表达 圯 并分析 １ ． 实验材 料 所选 种 为ｋ 猪 ．样 品为巾旧农业 １ 大 、 动物 遗 传 资 源 实 验审 群 体 样 品 中 随机 抽 取
Ｇ Ｐ Ｓ ２ 基 ｆ ｌ ＜ ｊ Ｃ １ ） Ｓ 区７ 伟确 序 列 （ 罔２）
Ｎ Ａ Ｎ （ ） Ｉ ） Ｒ （ ） Ｐ ２ ０ ０ ０ 浓 度测 定 仪测 定 Ｒ Ｎ Ａ 溶 液 浓 度 ，并 榆 测
猪2型链球菌MRP基因的克隆及表达的开题报告
猪2型链球菌MRP基因的克隆及表达的开题报告一、研究背景和意义猪2型链球菌是一种引起猪类疾病的重要致病菌，其病情严重影响了猪类的健康和养殖业的发展。
MRP（M protein-related protein）是猪2型链球菌表面群A蛋白家族中的一种，广泛存在于许多猪2型链球菌菌株中。
MRP蛋白具有抗原性，是猪2型链球菌的重要表面抗原之一，也是猪2型链球菌的一种重要毒力因子，参与了细菌的菌体黏附、侵入和避免免疫反应等过程。
因此，对MRP蛋白的研究对于了解猪2型链球菌的致病机制、开发疫苗、制定防治策略等具有重要意义。
二、研究内容本研究旨在克隆猪2型链球菌MRP基因，并进行表达研究，为进一步研究MRP在猪2型链球菌中的功能和应用奠定基础。
具体研究内容包括以下三个方面：1. MRP基因的克隆通过对猪2型链球菌基因组序列分析，设计合适的引物序列，PCR 扩增出MRP基因全长，并进行序列分析和验证。
2. MRP基因的重组表达将克隆得到的MRP基因亚克隆至真核表达载体上，转染至CHO细胞中，利用Western blot等方法检测MRP蛋白表达情况。
3. MRP蛋白的功能研究利用FACS等方法，研究MRP蛋白在猪2型链球菌中的功能及其与宿主细胞相互作用的机制。
三、研究方法1. MRP基因的克隆采用PCR技术，设计合适的引物，扩增出MRP基因的全长，利用DNA Gel Extraction Kit纯化PCR产物，得到MRP基因的亚克隆。
2. MRP基因的重组表达将MRP基因亚克隆至真核表达载体pCDNA3.1+上，经限制性内切酶切割、酶切位点验证和测序确认后，转染至CHO细胞中，采用Western blot等方法检测MRP蛋白表达情况。
3. MRP蛋白的功能研究采用FACS技术，利用CHO细胞表达的MRP蛋白和猪2型链球菌菌株，研究其贴附、侵入及免疫逃逸等功能。
四、预期成果1. 成功克隆出猪2型链球菌MRP基因，并扩增得到全长序列。
东北野猪IFN_OMEGA-2_基因的克隆测序和遗传多样性分析
118猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2023年40卷第7期地方猪种INDIGENOUS BREEDS东北野猪IFN OMEGA-2基因的克隆测序和遗传多样性分析王文涛 1，张冬杰 1，何鑫淼 1，龚林明 2，亓美玉 1，张海峰 1，何海娟 1，吴赛辉 1，冯艳忠 1，陈赫书 1，田 明 1，刘自广 1，李忠秋 1，李 淼 1，刘 娣 1 *（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；2.伊春宝宇农业科技有限公司，黑龙江 伊春 153000）干扰素OMEGA-2（IFN ω-2）基因属于ω型干扰素，在结构、来源方面为Ⅰ型，根据前期研究发现猪的IFN ω-2基因位于1号染色体，处于其染色体长臂的187329341–187329913位置，赵光伟研究团队针对荣昌猪IFN ω基因研究中发现IFN-ω基因具有良好的抗原性，能够增强荣昌猪的免疫力，与Xin Zhao 研究团队研究结果相似，推测其具备在提高机体免疫调节能力、抵御病毒侵染过程中发挥重要作用。
本研究针对东北野猪IFN OMEGA-2基因进行克隆测序，并与民猪、大白猪基因序列进行比对，同时进行遗传多样性分析。
1 材料与方法1.1 试验材料采集黑龙江省小兴安岭地区东北野猪耳组织样品23个，采集后液氮保存，运输至黑龙江省农业科学院畜牧研究所种养结合重点实验室。
1.2 试验方法 1.2.1 DNA 提取选取50～100 mg 东北野猪样品，采用常规提取DNA 酚抽提法进行DNA 提取，提取后检测DNA质量，使用分光光度计检测时，基金项目：国家现代农业产业技术体系(CARS-36)作者简介：王文涛（1981—），男，副研究员，博士，研究方向为猪遗传育种与繁殖， E-mail:****************通信作者：刘娣（1963—），女，研究员，博士，研究方向为猪遗传育种与繁殖，E-mail:*****************OD260/280应在1.70～1.90范围内，采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测时，条带显示效果应满足无拖尾，且整齐清晰等条件。
中国合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的克隆及基因结构与多态性分析
中国合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的克隆及基因结构与多态性分析专业品质权威编制人：______________审核人：______________审批人：______________编制单位：____________编制时间：____________序言下载提示：该文档是本团队精心编制而成，期望大家下载或复制使用后，能够解决实际问题。
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猪圆环病毒2型 Cap 基因的克隆与原核表达
猪圆环病毒2型 Cap 基因的克隆与原核表达杨克礼;孟丽;时代;段正赢;田永祥;周丹娜;郭锐;刘泽文;袁芳艳;刘威【摘要】According to the complete genome of Porcine Circovirus Type 2 ( PCV2) strain HBEZ, a pair of specific primers were designed to amplify ORF2 gene in HBEZ, and Sac Iand Hind III were used in the primers.ORF2 gene fragment was cloned to the prokaryotic expression vector pET-28a to construct the recombinant plasmid pET-ORF2.PCR and restrict enzyme identifi-cation confirmed that the recombinant plasmid was constructed successfully .Then pET-ORF2 was transformed into E.coli strain Rosetta.After being induced by IPTG, the recombinant protein with the molecular weight of 34.5 kD could express mainly in the form of inclusion body in SDS-PAGE electrophoresis.The best inducement conditions were acquired as follows:bacterial culture at 37 ℃, adding 1 mmol/L IPTG when the OD-value was between 0.4 and 0.6, and inducement by IPTG for 5h.The expression product Cap protein was purified by His-tag Ni-column and then was examined by Western-blot.The results showed that the ex-pressed recombinant protein could react specifically with the polyclonal antibody against PCV 2, and it possessed a good reactoge-nicity.%利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物，分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点，扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因；将该片段克隆至pET－28a原核表达载体，经PCR、酶切鉴定，成功构建了阳性重组表达质粒pET－ORF2。
猪圆环病毒2型Cap基因原核表达载体的构建及表达
ｗａ ｓ ｉ ｎｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ ＥＴ． ３ ０ａ， ａ ｎｄ ｔ ｈ ｅ ｇ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｒ ｅ ｃ ｏｍ ｂ ｉ ｎａ ｎｔ ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐＥＴ－ ３ ０ ａ — ＰＣＶ ２ 。
上海农业学报
２ ０ １ ４ ， ３ ０ （ １ ） ： ４ ９—５ ３
Ａｃ ｔ ａ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ａ ｅ Ｓ ｈａ ｎ ｇｈ ａｉ
文章编号 ： １ ０ ０ ０ ห้องสมุดไป่ตู้ ３ ９ ２ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ － ０ ４ ９ — ０ ５
猪 圆环 病 毒 ２型 Ｃ ａ ｐ基 因原 核 表 达 载 体 的构 建及 表 达
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文献 标 识 码 ： Ａ
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｏ ｆ ｐｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｃ ｉ ｒ ｃ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｔ ｙ ｐ ｅ ２ Ｃａ ｐ ｇ ｅ ｎ ｅ
猪MORC2基因克隆、生物信息学分析及组织表达定位
中国畜牧兽医 2022,49(7):2431-2441C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i ne 猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位齐南南,钱永航,罗 刚,司徒旭祺,刘吉英(江苏科技大学生物技术学院,镇江212018)摘 要:ʌ目的ɔ克隆猪的M i c r o r c h i d i a 家族C W 锌指蛋白2(M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W -t y p e z i n c f i n g e r 2,MO R C 2)基因,利用生物信息学手段分析其序列特征,并检测M O R C 2基因在猪不同组织中的表达情况和卵巢中的定位㊂ʌ方法ɔ以猪卵巢c D N A 为模板扩增和克隆M O R C 2基因完整C D S 区,并进行相似性比对及系统发育树构建;利用生物信息学软件对猪MO R C 2蛋白序列进行预测;使用实时荧光定量P C R 检测M O R C 2基因在猪不同组织中的表达情况;利用免疫组化方法检测猪MO R C 2蛋白在猪卵巢中的定位情况㊂ʌ结果ɔ猪M O R C 2基因C D S 区序列全长3102b p,编码1033个氨基酸㊂猪MO R C 2蛋白氨基酸序列与人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁小鼠㊁牛㊁绵羊㊁鸡和斑马鱼的相似性分别为94.8%㊁94.6%㊁94.9%㊁91.9%㊁93.8%㊁93.9%㊁80.8%和64.3%㊂系统进化树表明,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与斑马鱼(鱼类)亲缘关系最远㊂猪MO R C 2蛋白分子质量为117.44k u ,理论等电点为8.16,半衰期为30h ,属于不稳定蛋白㊂MO R C 2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白,不含跨膜结构和信号肽㊂猪MO R C 2蛋白有174个磷酸化位点㊁81个糖基化位点;亚细胞定位属于核蛋白,细胞质次之,线粒体中有少量表达;含有经典的MO R C 蛋白家族结构:G H K L -A T P a s e ㊁z f -C W 和C C 结构域㊂组织表达谱结果显示,M O R C 2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最多,显著高于其他组织(P <0.05),在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量较少,显著低于其他组织(P <0.05)㊂免疫组化结果显示,MO R C 2蛋白在健康猪卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达且表达量较高,在闭锁的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达量较少㊂ʌ结论ɔ试验成功获得猪M O R C 2基因完整C D S 区序列,该基因在猪各组织中广泛表达,MO R C 2蛋白主要在健康猪的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达㊂研究结果为进一步研究MO R C 2蛋白调控猪卵巢发育和卵泡闭锁的分子机制提供理论依据㊂关键词:猪;M O R C 2基因;克隆;表达;定位中图分类号:Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.001 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-17基金项目:江苏省自然科学基金(B K 20200994);国家自然科学青年基金(32102542)联系方式:齐南南,E -m a i l :1065810464@q q .c o m ㊂通信作者刘吉英,E -m a i l :l i u j i y i n g @ju s t .e d u .c n C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s a n dT i s s u eE x pr e s s i o n L o c a t i o no f P o r c i n e M O R C 2G e n eQ IN a n n a n ,Q I A N Y o n g h a n g ,L U O G a n g ,S I T U X u q i ,L I UJ i y i n g(S c h o o l o f B i o t e c h n o l o g y ,J i a n g s uU n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,Z h e n j i a n g 212018,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h ea i m o f t h i ss t u d y w a s t oc l o n e p o r c i n e M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W -t y pe z i n cf i ng e r 2(MO R C 2)g e n e ,a n a l y z e th e s e q u e n c e c h a r a c t e ri s t i c s u s i n g b i o i n f o r m a t i c s ,a n dd e t e c t t h e e x p r e s s i o no f M O R C 2g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s a n d t h e l o c a l i z a t i o n o f M O R C 2g e n e i n o v a r y o f p i g s .ʌM e t h o d ɔT h e c o m p l e t eC D S r e g i o no f M O R C 2g e n ew a s a m p l i f i e d a n dc l o n e dw i t h p o r c i n e o v a r y c D N Aa s t e m p l a t e ,a n dt h es i m i l a r i t y c o m p a r i s o na n d p h y l o ge n e t i c t r e ec o n s t r u c t i o nw e r e c a r r i e do u t .T h e s e q u e n c eof p o r c i n e MO R C 2p r o t e i nw e r e p r e d i c t e db y bi o i n f o r m a t i c s s o f t w a r e .中国畜牧兽医49卷T h ee x p r e s s i o n o f M O R C2g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f p i g s w e r e d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.T h e l o c a t i o n o f MO R C2p r o t e i n i n p o r c i n e o v a r y w a s d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d.ʌR e s u l tɔT h e l e n g t ho f M O R C2g e n eC D Sw a s3102b p,e n c o d i n g 1033a m i n oa c i d s.T h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f p o r c i n e MO R C2p r o t e i n h a d94.8%,94.6%, 94.9%,91.9%,93.8%,93.9%,80.8%a n d64.3%s i m i l a r i t y w i t h H u m a ns a p i e n s,P a n t r o g l o d y t e s,M a c a c am u l a t t a,M u sm u s c u l u s,B o s t a u r u s,O v i sa r i e s,G a l l u s g a l l u s a n d D a n i o r e r i o,r e s p e c t i v e l y.P h y l o g e n e t i ct r e e sr e v e a l e dt h a t p i g w a s m o s tc l o s e l y r e l a t e dt o p r i m a t e s, r u m i n a n t s a n d r o d e n t s w e r en e x t,a n d t h e f a r t h e s t r e l a t e dw a s D a n i o r e r i o.T h em o l e c u l a rw e i g h t o f p o r c i n eMO R C2p r o t e i nw a s117.44k u,t h e i s o e l e c t r i c p o i n tw a s8.16,t h eh a l f-l i f ew a s30h, a n d t h e r ew e r en ot r a n s m e m b r a n es t r u c t u r ea n ds i g n a l p e p t i d e s,i tw a sa nu n s t a b l eh y d r o p h i l i c p r o t e i n.T h e r ew e r e174p h o s p h o r y l a t i o nm o d i f i c a t i o n s i t e s a n d81g l y c o s y l a t i o nm o d i f i c a t i o n s i t e s o fMO R C2p r o t e i n,i tw a s m a i n l y l o c a t e di nc e l ln u c l e a r,l e s si nc y t o p l a s m a n d m i t o c h o n d r i a. MO R C2p r o t e i nc o n t a i n e dt h ec l a s s i c a lMO R C p r o t e i nf a m i l y s t r u c t u r e(G H K L-A T P a s e,z f-C W a n d C C d o m a i n).T i s s u e e x p r e s s i o n p r o f i l e r e s u l t s s h o w e d t h a t M O R C2g e n e w a s w i d e l y e x p r e s s e d i n11t i s s u e so f p i g s,t h ee x p r e s s i o n w a st h eh i g h e s t i nl i v e r,w h i c h w a ss i g n i f i c a n t h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s(P<0.05),a n d t h e e x p r e s s i o nw e r e t h e l o w e s t i nh e a r t,l u n g a n d m u s c l e,w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l o w e r t h a n t h a t i no t h e r t i s s u e s(P<0.05).I m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s s h o w e d t h a tMO R C2p r o t e i nw a s e x p r e s s e d i nb o t h g r a n u l o s a c e l l s a n dm e m b r a n e c e l l s o f h e a l t h yp i g s,a n dt h ee x p r e s s i o n w a sh i g h e r,b u t l e s si na t r e t i c g r a n u l o s ac e l l sa n d m e m b r a n e c e l l s.ʌC o n c l u s i o nɔT h eC D So f p o r c i n e M O R C2g e n ew a so b t a i n e d,i tw a sw i d e l y e x p r e s s e d i n v a r i o u s t i s s u e s.MO R C2p r o t e i n w a se x p r e s s e di nb o t h g r a n u l o s ac e l l sa n d m e m b r a n ec e l l so f h e a l t h yp i g s.T h er e s u l t s p r o v i d e d at h e o r e t i c a lb a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c h o nt h e m o l e c u l a r m e c h a n i s mo fMO R C2p r o t e i n r e g u l a t i n gp o r c i n e o v a r i a nd e v e l o p m e n t a n d f o l l i c u l a r a t r e s i a.K e y w o r d s:p i g s;M O R C2g e n e;c l o n i n g;e x p r e s s i o n;l o c a t i o nM i c r o r c h i d i a家族C W锌指蛋白(M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W-t y p e z i n c f i n g e r,MO R C)与减数分裂和精子发生相关,被称为小睾丸基因[1]㊂MO R C2是MO R C家族蛋白的一员,由多个保守的结构域组成㊂MO R C2蛋白包含G H K L-A T P酶结构域(G H K L-A T P a s e)㊁C W结构域和3个无规则卷曲(c o i l e d c o i l,C C)结构域[2-3]㊂MO R C2蛋白N-端的促旋酶㊁组氨酸激酶和G H K L结构域共同构成一个具有催化活性的A T P酶模块,该模块在调控染色质结构和基因表达方面起着关键作用[2]㊂MO R C2蛋白的G H K L结构域包含1个铰链的关键功能卷曲(C C1),而其他G H K L-A T P酶则不存在该结构域,推测该结构域在MO R C2蛋白功能调控中起重要作用㊂锌指C W结构域由4个半胱氨酸(C y s,C)残基与锌配价相连接,并含有2~4个保守的色氨酸(T r p,W)残基㊂锌指C W结构域是常见的与D N A 结合的转录因子的结构之一[4-5],可见MO R C2蛋白可作为转录调控因子调控基因的表达㊂植物和脊椎动物中大多数MO R C2蛋白C-端都含有1个C C结构域[3],这种结构存在于真核细胞染色质中,可以识别组蛋白和非组蛋白中的甲基化肽㊂因此, MO R C2蛋白是一个进化上保守的蛋白,其在动植物中具有类似的功能㊂MO R C2蛋白控制着多种细胞生理功能,是轴突腓骨肌萎缩症(C MT)和多种癌症的致病基因[6-10]㊂除此之外,MO R C2作为新的表观遗传调控因子在基因沉默㊁染色质重塑㊁D N A损伤修复等过程中起着至关重要的作用[3,11-12],但对其功能的研究主要集中在医学领域,尚处于探索阶段㊂研究发现,MO R C2被p21活化酶1(P A K1)磷酸化可促进D N A损伤修复[13]㊂D N A损伤后,P A R P1招募MO R C2到D N A损伤位点,催化MO R C2的P A R y l a t i o n,从而激活其A T P酶和染色质重构活性[11]㊂另外,MO R C2可作为表观遗传调控因子参与基因的表达调控,通过与人类沉默中枢(HU S H)复合物关联进而调节异染色质的形成和表观遗传基因的沉默[14]㊂目前MO R C2蛋白在正常细胞中的功能研究较少㊂有报道发现,在小鼠骨骼肌细胞23427期齐南南等:猪M O R C2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位(C2C12)中MO R C2通过抑制细胞分化促进细胞增殖[15];在脂肪细胞中M D M2可通过调节L I P I N1与MO R C2互作调节脂肪细胞功能[16];在小鼠的卵巢和睾丸中M O R C2基因的表达量较高,该基因的同源基因M O R C2b失活后抑制P R D M9对生殖细胞的调控,造成多种与减数分裂相关的基因错误表达,敲除M O R C2b基因的雌性小鼠卵巢发育受阻不能形成成熟的卵泡,最终丧失生殖功能[12]㊂由此推测,MO R C2可能参与了哺乳动物卵巢发育与繁殖的调控,但具体机制尚不清楚㊂卵巢发育与繁殖性能息息相关,目前国内外鲜有关于大型家畜(如猪)M O R C2基因结构与功能的报道㊂鉴于此,本研究克隆猪M O R C2基因序列并进行生物信息学分析,检测该基因在猪不同组织中的表达以及在卵巢组织中的定位情况,以期为进一步研究M O R C2基因的生物学功能和选育高繁殖力猪种提供参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1样品采集3头大长白三元杂交商品猪由南京竹顺生物技术有限公司提供,屠宰后采集心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁胃㊁肌肉㊁大肠㊁小肠㊁卵巢和子宫共11种组织,放入冻存管,立即投入液氮中贮存备用㊂取卵巢组织置于4%多聚甲醛中固定用于免疫组化检测㊂1.1.2主要试剂 K O D O n e T M P C R M a s t e r M i x (K MM-201,T O B O Y O)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;T r i z o l㊁P r i m e S c r i p t T M R TR e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r反转录试剂盒㊁p M D19-T V e c t o r C l o n i n g K i t均购自T a K a R a公司;大肠杆菌D H5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;实时荧光定量试剂(N o v o S t a r t S Y B R q P C R S u p e r M i xP l u s,E096-01A)购自上海近岸科技有限公司;MO R C2蛋白一抗(D123592)购自生工生物工程(上海)股份有限公司㊂1.2方法1.2.1 总R N A提取及c D N A合成采用T r i z o l进行组织R N A提取;采用P r i m e S c r i p t T M R T R e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r反转录试剂盒进行反转录㊂去除基因组D N A反应:总R N A1μg,5ˑg D N A E r a s e rB u f f e r2μL,g D N A E r a s e r1μL,加去离子水至10μL㊂反应条件:42ħ2m i n㊂反转录反应:上面步骤的反应液10μL,P r i m e S c r i p tR T E n z y m eM i xⅠ1μL,R T P r i m e r M i x1μL,5ˑP r i m e S c r i p tB u f f e r24μL,R N a s e-f r e e d H2O4μL㊂反应条件:37ħ15m i n;85ħ5s㊂c D N A于―20ħ保存备用㊂1.2.2 引物设计及合成根据G e n B a n k中猪M O R C2基因预测序列(登录号:X M_005670853.3),利用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计克隆及定量引物,同时设计G A P DH内参基因(登录号:NM_ 001206359.1)定量引物,引物序列见表1㊂引物均由杭州尚亚生物技术公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħ片段大小P r o d u c tl e n g t h/b p用途P o u r p o s eM O R C2F:A T G G C T T T C A C A A A T T A C A G C A G T C T G A A T C R:T T A G T C C C C C T T G G T G A T C A G G T C C 683102克隆M O R C2F:T C A C C A A G A A G G A A G A C A C T AR:A G A T G A T G A C C A G C G T T C C 60252实时荧光定量P C RG A P DH F:G G A C T C A T G A C C A C G G T C C A TR:T C A G A T C C A C A A C C G A C A C G T60220实时荧光定量P C R1.2.3 P C R扩增及克隆 P C R扩增体系25μL:高保真酶1μL,上㊁下游引物各1.5μL,c D N A模板1μL,双蒸水20μL㊂P C R反应条件:98ħ预变性10s;98ħ变性10s,68ħ退火延伸20s,共40个循环;72ħ延伸7m i n㊂P C R产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,将目的片段纯化回收后连接到p M D19-T载体上,转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,利用氨苄青霉素L B固体培养基筛选阳性单克隆,经P C R验证后送至杭州尚亚生物技术公司进行测序㊂3342中国畜牧兽医49卷1.2.4生物信息学分析利用D N AMA N软件将扩增获得的猪C D S序列与N C B I上公布的8个物种的M O R C2基因C D S序列进行相似性比对;利用M e g a7.0程序构建系统进化树;使用E x P A S y-P r o t P a r a m在线软件(h t t p s:ʊw w w.e x p a s y.o r g/ p r o t p a r a m/)分析MO R C2蛋白理化性质及亲/疏水性;使用T MHMM2.0在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p? T MHMM-2.0)进行跨膜区预测;使用S i g n a I P5.0在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/ s e r v i c e.p h p S i g n a l P-5.0)进行信号肽预测;利用N e t O G l y c4.0(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e.p h p?N e t O G l y c-4.0)和N e t N G l y c1.0 (h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p? N e t N G l y c-1.0)在线软件进行糖基化位点预测;使用N e t P h o s3.1(h t t p:ʊw w w.c b s.d u t.d k/ s e r v i c e s/N e t P h o s/)进行磷酸化位点预测;使用U n i P r o t K B/S w i s s-P r o t在线软件(h t t p s:ʊw w w. u n i p r o t.o r g/)进行亚细胞定位预测;使用S MA R T 在线软件(h t t p:ʊs m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e/)进行结构域预测;使用P R A B I在线软件(h t t p s:ʊp r a b i.i b c p.f r/h t m/s i t e/w e b/h o m e)进行二级结构预测;使用S W I S S-MO D E L在线软件(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)进行三级结构预测;使用S T R I N G10.5在线软件(h t t p s:ʊs t r i n g-d b.o r g/)预测与MO R C2互作的蛋白㊂1.2.5实时荧光定量P C R进行组织表达谱分析 P C R扩增体系20μL:2ˑN o v o S t a r t S Y B R q P C R S u p e r M i x P l u s10μL,上㊁下游引物各0.5μL,模板1μL,R N a s e-f r e ed d H2O补足体系㊂P C R扩增条件:95ħ预变性1m i n;95ħ变性20s, 60ħ退火20s,72ħ延伸30s,共35个循环㊂采用2―ΔΔC t法计算其相对表达量㊂利用S P S S19.0软件对数据进行单因素方差分析(O n e-W a y A N O V A),数据用平均值ʃ标准差表示,以P<0.05为差异显著性判断标准㊂1.2.6免疫组化将固定好的猪卵巢组织用石蜡进行包埋,切片机切成5μm厚度的薄片置于载玻片上,37ħ烘干;利用二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精进行脱蜡处理;滴加3%H2O2浸泡10m i n去除内源性过氧化物氢酶;120ħ5m i n进行抗原修复, P B S洗2遍,加入1%B S A,37ħ孵育30m i n;加入一抗100μL(1ʒ100),4ħ过夜孵育;P B S洗3次,加入二抗,37ħ孵育30m i n;P B S洗3次,D A B室温孵育10m i n,自来水终止显色;将组织切片置于苏木素中染色30s,自来水冲洗后用70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯进行脱水处理;用中性树胶进行封片㊂2结果2.1猪M O R C2基因克隆测序以猪卵巢c D N A为模板进行P C R扩增,P C R 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,片段大小约为3102b p(图1),与预期相符㊂将该片段纯化回收后连接到p M D19-T载体上,挑取阳性克隆经P C R验证后送测序,所获序列与猪M O R C2基因预测序列(G e n B a n k登录号:X M_005670853.3)相似性达99.97%,在1796b p处由G突变为C,但没引起氨基酸的改变,说明成功扩增出猪M O R C2基因C D S区序列㊂图1猪M O R C2基因C D S区P C R扩增结果F i g.1P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t o f p o r c i n e M O R C2g e n eC D S2.2相似性比对及系统进化树构建利用M e g A l i g n软件将猪MO R C2蛋白的氨基酸序列与人(登录号:N P_001290185.1)㊁黑猩猩(登录号:J A A34109.1)㊁恒河猴(登录号:X P_ 015005504.1)㊁小鼠(登录号:N P_001152760.1)㊁牛(登录号:X P_027422090.1)㊁绵羊(登录号:X P_ 042090778.1)㊁鸡(登录号:X P_040540971.1)和斑马鱼(登录号:N P_001003994.1)进行比对,相似性分别为94.8%㊁94.6%㊁94.9%㊁91.9%㊁93.8%㊁93.9%㊁80.8%和64.3%(图2),表明MO R C2蛋白在不同物种间高度保守㊂以斑马鱼为外种群构建MO R C2蛋白系统进化树,结果显示,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与鸡和斑马鱼亲缘关系最远(图3)㊂43427期齐南南等:猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位图2 不同物种M O R C 2基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o fM O R C 2p r o t e i n i nd i f f e r e n t s pe c i es 图3 M O R C 2蛋白系统进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e o fM O R C 2p r o t e i n 2.3 生物信息学分析2.3.1 理化性质 猪M O R C 2基因编码1033个氨基酸,分子质量为117.44k u ,理论等电点为8.16,含有常见的20种氨基酸,其中谷氨酸(G l u )含量最多(10.1%),色氨酸(T r p )含量最少(0.9%),不含吡咯赖氨酸(P y l )和硒半胱氨酸(S e c );总负电荷氨基酸残基(A s p +G l u )为160个,总正电荷氨基酸残基(A r g +L ys )为164个(表2)㊂猪M O R C 2蛋白的失稳指数为57.46,为不稳定蛋白质,估计半衰期为30h㊂猪M O R C 2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白㊂表2 猪M O R C 2蛋白氨基酸组成T a b l e 2 A m i n o a c i d c o m p o s i t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 氨基酸A m i n o a c i d s 数量N u m b e r/个占比P e r c e n t a ge /%氨基酸A m i n o a c i d s数量N u m b e r/个占比P e r c e n t a ge /%A l a (A )797.6I l e (I )464.5A r g (R )848.1L e u (L )838.0A s n (N )302.9L y s (K )807.7A s p (D )565.4M e t (M )212.0C y s (C )131.3P h e (F )313.0G l n (Q )474.5P r o (P )767.4G l u (E )10410.1S e r (S )706.8G l y (G )444.3T h r (T )595.7H i s (H )131.3T r p (W )90.9T yr (Y )272.6V a l (V )615.95342中 国 畜 牧 兽 医49卷2.3.2 跨膜结构㊁信号肽及翻译后修饰 利用T MHMM2.0在线软件对猪MO R C 2蛋白进行跨膜区预测发现,该蛋白不含跨膜结构(图4)㊂利用S i gn a I P5.0在线软件对猪MO R C 2蛋白进行信号肽预测发现,该蛋白不含信号肽(图5)㊂表明猪MO R C 2蛋白既不属于跨膜蛋白也不属于分泌型蛋白㊂利用N e t N G l y c1.0㊁N e t O G l yc4.0在线软件对猪MO R C 2蛋白的糖基化位点进行预测发现,该蛋白存在3个N -糖基化位点,78个O -糖基化位点㊂通过N e t P h o s 3.1在线软件分析猪MO R C 2蛋白发现,该蛋白存在174个磷酸化位点㊂图4 猪M O R C 2蛋白跨膜区预测F i g.4 T r a n s m e m b r a n e d o m a i n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图5 猪M O R C 2蛋白信号肽预测F i g .5 S i g n a l p e pt i d e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 2.3.3 亚细胞定位 利用U n i P r o t K B /S w i s s -P r o t 在线软件进行蛋白亚细胞定位显示,猪MO R C 2蛋白主要定位于细胞核,其次是细胞质,线粒体中含有少量的MO R C 2蛋白,在其他的细胞器如高尔基体和溶酶体等中不表达(图6)㊂2.3.4 结构域 利用S MA R T 在线软件对猪MO R C 2蛋白进行结构域预测,结果显示,猪MO R C 2蛋白含1个G H K L -A T P a s e 结构域㊁1个经典的P f a m :z f -C W 结构域及3个C C 结构域(图7)㊂2.3.5 二级结构和三级结构 利用P R A B I 在线软件对猪MO R C 2蛋白二级结构进行预测发现,M O R C 2蛋白主要由α-螺旋㊁延伸链和无规则卷曲组成,占比分别为35.24%㊁8.62%和56.15%(图8)㊂利用S W I S S -M O D E L 在线软件对猪M O R C 2蛋白进行三级结构预测发现,与二级结构结果一致(图9)㊂2.3.6 互作蛋白 利用S T R I N G 在线软件蛋白质相互作用数据库预测发现,猪MO R C 2蛋白的互作蛋白较少,主要有MO R C 1㊁P A K 1㊁WD R 76㊁WD R 75㊁T R I M 28和S C H B P 1(图10)㊂63427期齐南南等:猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位图6 猪M O R C 2蛋白亚细胞定位预测F i g.6 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图7 猪M O R C 2蛋白功能结构域预测F i g.7 F u n c t i o n a l d o m a i n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in h ,α-螺旋;e ,延伸链;c ,无规则卷曲;t ,β-转角h ,A l p h ah e l i x ;e ,E x t e n d e d c h a i n ;c ,R a n d o mc o i l ;t ,B e t a t u r n 图8 猪M O R C 2蛋白二级结构预测F i g .8 S e c o n d a r ys t r u c t u r e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图9 猪M O R C 2蛋白三级结构预测F i g .9 T e r t i a r y st r u c t u r e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 7342中国畜牧兽医49卷图10猪M O R C2蛋白互作蛋白网络预测F i g.10P r o t e i n i n t e r a c t i o n n e t w o r k p r e d i c t i o n o f p o r c i n e M O R C2p r o t e i n2.4M O R C2基因在猪各组织中的表达利用实时荧光定量P C R检测M O R C2基因在猪不同组织中的表达情况,结果见图11㊂由图11可知,M O R C2基因在猪肝脏中的表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),在脾脏㊁胃㊁肾脏㊁大肠㊁小肠㊁子宫和卵巢中的表达量较高,在心脏㊁肺脏和肌肉中的表达量较低,显著低于其他组织(P< 0.05)㊂2.5M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位利用免疫组化技术检测M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位情况,结果见图12㊂由图12可知,M O R C2肩标不同字母表示差异显著(P<0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)V a l u e s w i t h d i f f e r e n tl e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t s m e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05)图11M O R C2基因在猪不同组织中的相对表达量F i g.11R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f M O R C2g e n ei n p o r c i n e d i f f e r e n t t i s s u e s蛋白在猪的健康初级卵泡㊁次级卵泡㊁成熟卵泡的颗粒细胞和膜细胞中表达量较高;在闭锁卵泡的颗粒细胞和膜细胞中表达量较低㊂表明猪MO R C2蛋白可能参与了猪卵泡闭锁调控㊂①A,初级卵泡(100ˑ);B,次级卵泡(40ˑ);C㊁D,成熟卵泡(40ˑ);E,初级闭锁卵泡及次级闭锁卵泡(100ˑ);F,闭锁卵泡(40ˑ)㊂②ң,不同级别的卵泡;T C,卵泡膜细胞;G C,卵泡颗粒细胞①A,P r i m a r y f o l l i c l e(100ˑ);B,S e c o n d a r y f o l l i c l e(40ˑ);Ca n dD,M a t u r e f o l l i c l e(40ˑ);E,P r i m a r y a n ds e c o n d a r y a t r e s i af o l l i c l e(100ˑ);F,A t r e s i a f o l l i c l e(40ˑ).②ң,D i f f e r e n t l e v e l s o f f o l l i c l e s;T C,F o l l i c l e t h e c a c e l l;G C,F o l l i c l eg r a n u l o s a c e l l s 图12M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位F i g.12L o c a l i z a t i o no fM O R C2p r o t e i n i n p o r c i n e o v a r i a n83427期齐南南等:猪M O R C2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位3讨论本研究获得猪M O R C2基因C D S区序列全长3102b p,编码1033个氨基酸㊂通过对不同物种的M O R C2基因编码氨基酸序列进行相似性比对发现,MO R C2在哺乳动物中高度保守,表明猪MO R C2蛋白可能与其他物种的MO R C2蛋白功能相似,在染色质重塑㊁表观遗传修饰㊁基因转录调控等过程中具有重要的作用㊂对于MO R C2蛋白的亚细胞定位,MO R C2蛋白存在核定位信号,有利于MO R C2进入细胞核进而起到调控基因转录调控的作用,目前关于该蛋白功能的研究也主要集中在细胞核中[11,17]㊂但研究发现MO R C2的定位可以从细胞核到细胞质发生改变,如C2C12细胞诱导分化后MO R C2从细胞核转到细胞质[15]㊂S a n c h e z-S o l a n a等[18]研究发现,MO R C2在脂肪细胞细胞质中的含量升高可促进A T P-柠檬酸裂解酶的活化㊂可见MO R C2蛋白不仅仅在细胞核内发挥作用,还与细胞质中的多种生物学功能相关㊂蛋白结构域预测结果显示,猪与人MO R C2蛋白相似,均具有1个G H K L-A T P a s e结构域㊁1个经典的z f-C W结构域及3个C C结构域[2]㊂动植物中,MO R C家族的G H K L-A T P a s e结构域是转座元件(T E)沉默和异染色质凝聚所必需的,推测猪MO R C2可能参与染色质重塑过程的调控㊂在动物MO R C蛋白家族中,C W结构域位于C-端C C 结构域的上游[9]㊂C W结构域可以与染色体重构蛋白结合,选择性识别甲基化H3K4,MO R C3/4是组蛋白H3K4m e3的结合物,而MO R C1和MO R C2的C W区域均缺乏组蛋白H3K4的结合能力,但HU S H和MO R C2可以选择性结合转录因子,促进组蛋白H3在L y s9位点的三甲基化(H3K9m e3)进而沉默转录[2],表明MO R C2不通过组蛋白H3K4途径进行表观遗传调控,而MO R C2通过C W区域进行表观调控的分子机制有待进一步研究㊂除此之外,A T P酶和C W结构域协同作用于MO R C4与核小体核心粒子(N C P)的结合部位,增强D N A包裹组蛋白核心的能力,阻碍D N A相关蛋白(如转录因子)与N C P的结合[19]㊂由此可见,C W结构域对于MO R C2蛋白是非常必要的㊂C C结构域在MO R C2调控D N A 修复过程中起到重要作用,C C结构域已被证明在调节蛋白质-蛋白质和蛋白质-D N A相互作用,以及影响蛋白质稳定性和亚细胞定位方面发挥重要作用[3,20]㊂MO R C2通过其C C结构域形成同质二聚体,加强了染色质动力学进而促进D N A修复,敲除MO R C2蛋白C-末端C C结构域后可降低组蛋白H2A X磷酸化,阻止D N A修复蛋白B R C A1㊁53B P1和R a d51的募集,从而降低细胞存活率[3],但是C C结构域的功能还有待进一步研究㊂预测MO R C2的互作蛋白为MO R C1㊁P A K1㊁WD R76㊁WD R75㊁T R I M28和S C H B P1,其中MO R C1主要在雄性生殖细胞中表达,M O R C1基因敲除的小鼠雄性生殖细胞丢失且不育[12],该基因在雌性生殖系统中的研究鲜见报道㊂在鸡卵巢等级卵泡发育过程中,P A K1通过调控R A F-M E K-E R K 介导S L I T2对G C增殖的抑制作用[21],另外,P A K1可以磷酸化MO R C2[13],促进D N A损伤修复,但MO R C2是否与P K A1互作调控猪卵泡发育或闭锁有待进一步研究㊂目前,尚没有关于WD R75㊁S C H B P1和WD R76在卵巢发育或闭锁中功能的研究㊂由于MO R C2功能研究才刚起步,因此当前预测的MO R C2互作蛋白较少,随着对其功能研究的深入,可能会发现更多的MO R C2互作蛋白㊂D i n g 等[9]对M O R C2基因在人各组织中的表达分析发现,M O R C2基因在多个组织中均有表达㊂本研究中,M O R C2基因在猪不同组织中广泛表达,其中在肝脏中的表达量最高,在子宫㊁卵巢㊁大肠㊁胃㊁肾脏和脾脏中表达量较高,在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量较低㊂卵泡闭锁在哺乳动物卵巢中十分常见,卵泡闭锁可以出现在不同发育时期[22-23],最终造成卵子大量丢失,大大降低了雌性畜禽的生产性能㊂引起卵泡闭锁的机制非常复杂,研究认为,颗粒细胞凋亡是引起卵泡闭锁的标志性事件[24-26],截止目前,关于颗粒细胞凋亡的研究主要集中在自噬㊁氧化应激㊁m i R N A和l n c R N A等方面[27-32]㊂MO R C2是重要的凋亡调控因子,研究显示,小鼠M O R C2b基因敲除后引起卵泡发育障碍,造成雌鼠繁殖性能降低[12],推测MO R C2蛋白可能在卵巢发育或卵巢闭锁中起到重要的调控作用㊂本研究结果显示, MO R C2蛋白在猪各级健康卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达,在闭锁卵泡中的表达量较低,表明MO R C2蛋白可能参与了猪卵泡闭锁的调控,但具体的调控机理仍不明确,今后将进一步研究M O R C2基因在大型家畜(猪)卵巢发育及卵泡颗粒细胞凋亡中的作用㊂9342中国畜牧兽医49卷4结论试验成功获得猪M O R C2基因C D S区序列,猪MO R C2蛋白是一个进化上保守的蛋白,主要定位于细胞核,细胞质次之,线粒体中仅有少量表达,可能与MO R C1㊁P A K1㊁WD R76㊁WD R75㊁T R I M28和S C H B P1具有相互作用㊂M O R C2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最高,在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量最少㊂MO R C2蛋白在猪卵巢各级卵泡的膜细胞和颗粒细胞中均有表达,且在健康卵泡中的表达量高于闭锁卵泡㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]I N O U E N,H E S S K D,MO R E A D I T 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猪生长激素基因第二外显子区遗传变异的序列基础
猪生长激素基因第二外显子区遗传变异的序列基础姜志华;Rott.,OJ【期刊名称】《南京农业大学学报》【年(卷),期】1997(20)2【摘要】采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及ＰＣＲ产物的直接序列分析方法，对猪生长激素基因第二外显子区遗传变异的序列基础进行了研究。
ＰＣＲ扩增片段长度为２３０ｂｐ，包含全部的生长激素基因的第二外显子区序列（１６１ｂｐ）。
共分析了６头二花脸和６头长白猪，结果表明：在猪的生长激素基因第二外显子区，共有７处碱基替换，依次为５０７处的Ｃ／Ｔ替换、５２０处的Ｃ／Ｔ替换、５４６处的Ｇ／Ａ替换、５５５处的Ｇ／Ａ替换、５５６处的Ｃ／Ａ替换、５９５处的Ｃ／Ｔ替换及６３４处的Ｃ／Ｔ替换。
只有５０７、５４６、５５５和５５６处的突变可引起氨基酸序列的变异，其余均为无意义突变。
采用ＧＣＧ软件包对限制酶酶切图谱进行分析。
【总页数】5页(P67-71)【关键词】猪;生长激素基因;第二外显子;序列【作者】姜志华;Rott.,OJ【作者单位】南京农业大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】S828.2【相关文献】1.猪生长激素基因启动子区的序列变异研究 [J], 王荣梅;张细权;杨关福2.猪TLR4基因外显子1新等位基因的分离及遗传变异分析 [J], 潘章源;叶兰;朱璟;杜子栋;黄小国;朱国强;包文斌;吴圣龙3.黑稻CHS基因外显子Ⅱ部分序列遗传变异分析 [J], 邓文辉;张涛;吴三桥;李新生4.合作猪DRB基因外显子3遗传变异分析 [J], 李越洲;张勇5.藏鸡主要组织相容性复合体B-LBⅡ基因第二外显子序列遗传变异分析(英文) [J], 徐日福;李奎;陈国宏;强巴央宗;张玉波;林丽;樊斌;刘榜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：苏玉虹，刘东鑫，宋慧娟，曾瑞霞，巴彩凤，王洪才【摘要】目的克隆猪Calsarcin-2（Cs-2）基因，并探讨其在猪组织中的表达特点。
方法利用RT-PCR方法扩增猪Cs-2基因编码区的序列；采用Northern 杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同组织和不同部位骨骼肌中分析Cs-2基因表达情况及转录本个数、大小。
结果猪Cs-2基因片段长934 bp,含有1个897 bp的开放阅读框（ORF），编码298个氨基酸，与已报到的人Cs-2基因氨基酸序列相似性为93%；猪Cs-2基因仅在骨骼肌中表达，不同骨骼肌中表达量有所不同，以背最长肌最高；此基因在骨骼肌中只有一个转录本，大小为1.26 kb。
结论猪Cs-2基因序列与已报道的人、鼠Cs-2基因具有高度同源性，主要在骨骼肌中特异表达。
【关键词】猪；Cs-2基因；组织表达谱Cloning of Encoding Region and Analysis of Tissue ExpressionProfile of Pig Calsarcin-2 GeneSU Yuhong, LIU Dongxin, SONG Huijuan,ZENG Ruixia, BA Caifeng, WANG Hongcai(Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective To clone swine Cs-2 gene and to investigate the character of tissue expression in pigs. Methods The sequence of porcine gene Cs-2 was amplified by RT-PCR. The numbers and size of porcine Cs-2 transcripts in skeletal muscle were obtained with Northern blotting and the expression levels in multiple tissues were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results The length of porcine Cs-2 cDNA was 934 bp containing an ORF of 897 bp, which encoded a 166 amino acids. Homology of amino acids sequence between the amplified porcine and the reported human Cs-2 was 93%. There was only one transcript among different skeletal muscles whose size was nearly 1.26 kb, but not detected in the other tissues including heart,liver,spleen,lung and kidney.The expression levels of Cs-2 gene varied among different skeletal muscles. It was the highest expression in musculus longissimus dorsi. Conclusions There are great similarities in the porcine Cs-2 gene, human gene and murine Cs-2 gene, which are expressed mainly in skeletal muscles.Key words：pig; Cs-2; tissue expression profile猪肉是人类蛋白质主要来源之一，其基本组成单位是肌纤维，与肉质性状存在相关性。
研究发现：不同品种猪的肌纤维类型转化规律基本一致，但转化率不同，肌肉代谢束内肌纤维类型的组成直接影响全身肌肉量和食用品质。
肌肉中红肌纤维（慢反应纤维）所占比例越大，白肌纤维（快反应纤维）所占比例越小，肌肉品质相对就越好［1］。
很多基因及其产物影响肌肉的肌纤维类型。
有报道指出活化的钙调磷酸酶促进慢反应纤维基因表达［2］。
Frey等以钙调磷酸酶的催化亚基和半乳糖基因激活转录因子的DNA结合结构域组成的融合蛋白为诱饵，双杂交筛选出Calsarcin基因家族的2个成员：Cs-1,Cs-2；Calsarcin蛋白家族能同钙调节酶催化亚基相互作用，诱导细胞内信号传导，调节快慢骨骼肌纤维之间的转化［3］。
人、鼠的Cs-2基因主要在骨骼肌快反应纤维中表达，人中转录体大小约为1.5 kb，鼠的约为1.35 kb。
利用比较基因组学方法，本课题组2006年克隆了猪Cs-2基因，并初步分析了该基因的结构与功能［4］。
本研究在上述工作基础上对猪Cs-2基因进行组织表达谱分析，为进一步研究此基因的结构与功能提供科学依据。
1 材料和方法1.1 实验样品采集同品种、同日龄、同环境饲养的三头成年本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织。
所有组织样品采集后迅速置于液氮中冷冻后-80 ℃保存。
1.2 总RNA的提取采用Trizol一步法提取3头本地大白猪不同组织的总RNA。
苏玉虹，等：猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析辽宁医学院学报2008年10月，29(5)1.3 利用电子克隆策略设计引物以人的同源基因cDNA为信息探针,利用BLAST工具在猪EST数据库中调取同源性序列（标准:长度≥200 bp，相似性≥80%）。
筛选出的ESTs利用Gene Tool 2.0软件进行拼接，以拼接序列重叠群为模板，综合考虑引物设计的各项原则，在Primer Premier 5.0软件中设计引物扩增ORF全长序列。
引物序列及退火温度如下：CS2-F：5＇-TCCACAATGCCGCTCT-3＇，CS2-R：5＇-GAATCATGATGCAAAGG-3＇，退火温度51℃。
1.4 RT-PCR 反应首先以Oligo(dt)15为引物，反转录酶催化cDNA第一链的合成；其次，以cDNA第一链为模板，以CS2为引物进行RT-PCR，PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 PCR产物的克隆与测序PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化后，与pMD18-T Vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用α互补作用筛选白色菌落。
用碱裂解法抽提质粒，经PCR及EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性质粒送上海生工进行双向测序。
细菌转化、质粒抽提、酶切鉴定均按分子克隆实验指南［5］稍加修改进行。
1.6 Northern杂交按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit说明书进行操作。
以CS2引物扩增的934 bp片段标记地高辛作为探针来杂交本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织的总RNA。
1.7 组织表达谱分析利用半定量RT-PCR方法检测Cs-2基因在本地大白猪4个非肌肉组织（肝、脾、肺、肾）及5个不同部位肌肉组织（心肌、股二头肌、头半棘肌、背最长肌和内脊肌）中的表达丰度。
为避免基因组污染，利用猪管家基因GAPDH作内标，以CS2引物扩增条带亮度与内标的比值作为表达丰度。
GAPDH基因(GenBank登录号为AF017079)引物序列如下：正向引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3’，反向引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3’。
PCR结束后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并利用图像分析软件Gene Tools分析结果。
2 结果2.1 RT-PCR 扩增结果图1所示，在三头本地大白猪的背最长肌组织中，CS2引物的RT-PCR扩增特异性条带位于900 -1000 bp之间，大小与预期结果一致。
2.2 阳性克隆子的双酶切鉴定引物CS2的扩增产物与载体连接后转化到大肠杆菌内，提取的质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。
由图2可知，双酶切产物与PCR扩增产物一致，表明所提取质粒中含有扩增的目的片段。
2.3 猪Cs-2基因的测序与分析2.3.1 cDNA序列及相似性将扩增片段双向测序后，用Sequencher 4.1.4软件拼接，得到一条934 bp的cDNA整合序列，并提交到GenBank，登录号为DQ058294。
该cDNA序列包括897 bp的全长CDS序列，编码298个氨基酸。
根据物种间剪切位点的保守性分析，获得了该序列5个外显子的连接点，如图3所示。
将此CDS序列与人Cs-2基因cDNA 序列（GenBank登录号为NM_021245）和小鼠Cs-2基因cDNA序列（GenBank登录号为NM_021508）进行BLAST比对，结果显示它们之间的相似性分别为91%和87%。
至此，可将克隆、拼接得到的934 bp的基因片段命名为猪Cs-2基因。
下划线部分为起始密码子和终止密码子；斜体加黑部分为预测的猪Cs-2基因外显子的连接部位2.3.2 氨基酸序列分析由猪Cs-2基因ORF推导的氨基酸序列与人、小鼠Cs-2基因的氨基酸序列之间的相似性分别为93%和89.6%，说明Cs-2蛋白在哺乳动物中相当保守。
此外，Cs-2蛋白同人、鼠的calsarcin家族的其它两个成员比较发现：calsarcin家族成员的氨基端和羧基端的氨基酸序列比较保守，中间的氨基酸变化较大。
Prosite数据库搜索发现Cs-2蛋白存在多种模序，有天冬氨酸糖基化位点，葡萄糖胺聚糖结合位点，十四(烷)酰化位点，酰胺化位点及多种磷酸化位点，包括蛋白酶C磷酸化位点，依赖于cAMP、cGMP蛋白磷酸化位点以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点。
经SOPMA软件预测，其二级结构为：α-螺旋占16.44%；β-转角占8.39%；延伸链占18.79%；无规卷曲占56.38%。
2.4 Northern 杂交探针与本地大白猪的背最长肌、内脊肌、头半棘肌及股二头肌总RNA的杂交图均可见杂交信号带，显示该基因在肌肉组织中只有一个转录本，约为1.26 kb，但在心、肝、脾、肺、肾组织中不表达。