达托霉素在不同酸碱条件下产生的杂质及其结构研究
达托霉素新杂质及其来源研究
达托霉素新杂质及其来源研究夏兴;邵东;孙新强【摘要】达托霉素是一种正在临床使用的新型抗耐药菌抗生素.由于结构特点,其具有很多结构类似的杂质.在达托霉素样品中,通过HPLC分析发现了一种新的杂质,相对保留时间为0.82.经过分离纯化,获得了纯化的新杂质.UPLC-MS检测发现新杂质的分子量为1617.核磁共振分析,确定新杂质的侧链含有双键,推定新杂质为N-(3-癸烯酰基)-L-色氨酰基-D-天冬酰胺酰基-L-天冬氨酰基-L-苏氨酰基-甘氨酰基-L-鸟氨酰基-L-天冬氨酰基-D-丙氨酰基-L-天冬氨酰基-甘氨酰基-D-丝氨酰基-苏-3甲基-L-谷氨酰基-L-3-邻氨基苯甲酰基-L-丙胺酸-ε1-内脂.根据杂质的化学结构,推测该杂质可能来源于发酵过程中补加的癸酸.因此通过GC-MS分析了起始原料癸酸,发现其中含有少量癸烯酸,该结果证实了本研究的推测.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)005【总页数】6页(P574-579)【关键词】达托霉素;杂质;MS-MS分析;核磁共振【作者】夏兴;邵东;孙新强【作者单位】上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司,上海200240;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,新昌312500;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,新昌312500【正文语种】中文【中图分类】R978.1达托霉素是一种由13个氨基酸组成的新型脂肽类抗生素,是一种钙离子依赖型的抗生素。
在钙离子存在的条件下,它将以非共价键的形式与细胞膜上达托霉素结合蛋白(DBPs)结合。
达托霉素由微生物玫瑰孢链霉菌发酵生成的,具有在体外抗绝大多数的临床革兰阳性菌的作用,包括厌氧菌、肠球菌等耐药菌,且主要用于耐药菌,如耐万古霉素的肠球菌(VRE),耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等,在医学方面具有广阔的应用前景[1-2]。
达托霉素的化学结构复杂,结构如图1所示,其生产、纯化、运输、保藏环节的条件变化均会导致杂质的产生,影响产品质量和治疗效果。
环脂肽类抗生素达托霉素的研究进展
环脂肽类抗生素达托霉素的研究进展作者:章艳玲来源:《中国化工贸易·下旬刊》2018年第08期摘要:达托霉素是一种具有新型作用机理的能有效抑制耐药性病原菌的环脂肽类新型抗生素。
本文主要对达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用进行综述,以期为达托霉素的研究提供一定思路。
关键词:达托霉素;作用机制;合成方法;临床应用达托霉素是玫瑰孢链霉菌发酵产物脂肽类化合物A21978C的N-癸酰基衍生物,是由玫瑰孢链霉中通过非核糖体蛋白合成酶(NRPS)机制合成的由13个氨基酸和一个正癸酸脂肪酸尾组成的环脂肽类新型抗生素[1],其在体外对大多数革兰氏阳性菌均有抑制作用,而且对许多耐药菌,如耐万古霉素的肠球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球(MRSA)和凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS),仍具有较强的活性[1-2],被公认为万古霉素的最佳替代品。
近年来,达托霉素的有关研究报告有很多[3-8],本文从达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用方面进行报道。
1 达托霉素的作用机制达托霉素通过钙离子(Ca2+)依赖的方式靶向革兰氏阳性菌细胞膜。
最新的研究表明在枯草芽孢杆菌中,达托霉素优先插入到富含液脂的部位,造成细胞膜双分子层的扭曲,导致液脂聚集到插入位点补偿细胞膜流动性受到的影响。
催化细胞壁和细胞膜磷脂合成的关键酶定位于细胞膜中富含液脂的位置,如负责催化脂质II(lipidII)最后一步合成的MurG,催化磷脂合成的PlsX等。
达托霉素阻碍了MurG和PlsX 等重要蛋白与液脂的结合,导致蛋白定位异常和功能受损[8]。
通过干扰细胞膜磷脂的结构,扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成,细胞壁的破损最终导致细胞裂解和细菌死亡。
另外,它还能通过破坏细菌的细胞膜,改变细胞质膜的性质,使其内容物外泄而达到杀菌的目的,因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难[8]。
2 达托霉素的合成方法2.1 酶法半合成达托霉素达托霉素及A-21978C相关衍生物的最初制备是采用酶法半合成工艺。
微生物发酵生产达托霉素的研究进展
微生物发酵生产达托霉素的研究进展摘要】达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取出的具环脂肽结构复合物A21978中的一种,是一种酸性脂肽类抗生素。
达托霉素属于钙离子依赖性抗生素,在钙离子的存在下它以独特的作用模式破坏细胞膜的完整性,进而扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肤聚糖的生物合成,最终导致细胞死亡。
由于其不易产生交叉耐药的问题,因此主要用于治疗耐药菌引起的感染和疾病。
【关键词】达托霉素;玫瑰孢链霉菌;发酵【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2016)31-0007-02The research progress of microbial fermentation production of supporting toxinLin Weiyue. Shenzhen Jiatai Pharmaceutical co., LTD., Guangdong Province, Shenzhen 518103, China【Abstract】To Joe drug extracted from rose spore of Streptomyces fermented with ring lipid compounds in A21978, a peptide structure, fat is a kind of acidic peptide antibiotics. Dependence of tora toxin belongs to calcium ion antibiotics, in the presence of calcium ions it destroy the integrity of the cell membrane by the unique role model, and disrupt the cell membrane transport of amino acids, which hinder the biosynthesis of bacterial cell walls skin glycan, eventually leading to cell death. Because of its not easy to produce cross resistance problem, so it is mainly used for treatmentof drug-resistant bacteria infections and diseases.【Key words】Toxin; Rose spore Streptomyces; Fermentation1.简介达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取出的具环脂肽结构复合物A21978中的一种,由一个十碳烷侧链与一个环状β-氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接组成,是一种酸性脂肽类抗生素,分子式为C72H101N17O26,分子量1620.67。
达托霉素杂质清单
项目报批 纯度高于95%
达托霉素杂质4 Daptomycin impurity 4
N/A
10mg 25mg 50mg 100mg 更大规格请咨询
项目报批 纯度高于95%
扬信医药代理各品种杂质对照品:舒更葡糖钠杂质,达托霉素杂质,依维莫司杂质,他克莫司杂质,阿奇霉素杂质,克拉维酸钾杂质,
红霉素杂质,克拉霉素杂质,林可霉素杂质,罗红霉素杂质,克林霉素杂质,恩曲他滨杂质,艾地那非杂质,瑞卢戈利杂质,艾氟康
项目报批 纯度高于95%
项目报批 纯度高于95%
结构式
达托霉素杂质2
Daptomycin50mg 100mg 更大规格请咨询
项目报批 纯度高于95%
达托霉素杂质3
Daptomycin impurity 3 883991-21-7
10mg 25mg 50mg 100mg 更大规格请咨询
唑杂质等;并提供COA、NMR、HPLC、MS等结构确证图谱。
专注各种杂质对照品
代理中检所/EP/BP/USP/LGC/TRC/TLC/MC/SIGMA/BACHEM/STD等品牌
达托霉素杂质种类整理列表
中文名称 达托霉素
英文名称 Daptomycin
CAS
规格
103060-53-3
10mg 25mg 50mg 100mg 更大规格请咨询
达托霉素杂质1 Daptomycin impurity 1 123180-72-3
10mg 25mg 50mg 100mg 更大规格请咨询
用途
达托霉素——标准条件
达托霉素——标准条件
检查项目放行标准限度
外观淡黄色至淡黄色、棕黄色比旋度17°--25°
鉴别⑴在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
⑵本品在221nm波长处有最大吸收。
⑶本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
酸度 3.0-5.0
有关物质内酯水解物不得过0.6%
β-异构体不得过0.35%
脱水达托霉素不得过1.5%RS-2(RRT 0.56)不得过0.15%未知单杂不得过0.15%
总杂不得过8.0%
残留
溶剂
异丙醇应不得过0.5%
微生物限度每10ml本品的细菌和霉菌、酵母之和不得超过1cfu,沙门氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每10ml不得检出。
内毒素每1mg达托霉素中含内毒素小于0.28EU 炽灼残渣不得过0.5%
重金属不得过百万分之二十
含量≥95%。
手性衍生化-HPLC法测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型
手性衍生化-HPLC法测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型刘浩;裘亚【摘要】目的应用柱前手性衍生化-HPLC技术测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型.方法取达托霉素溶于6mol/L盐酸溶液,经110℃水解7h,中和,在碱性条件下与Na-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺(FDAA)经微波辅助进行衍生化反应,再用非手性HPLC系统分离测定.结果各种氨基酸衍生物、FDAA以及反应副产物之间均可得到有效分离,仿制药与原研药的8种手性氨基酸的D,L-构型完全相同,也均与文献报道一致.结论该方法可应用于达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型的测定.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2016(041)001【总页数】6页(P45-49,69)【关键词】D,L-构型;手性氨基酸;达托霉素;手性衍生化;HPLC【作者】刘浩;裘亚【作者单位】上海市食品药品检验所,上海201203;上海市食品药品检验所,上海201203【正文语种】中文【中图分类】O657.7;R978.1+1达托霉素是1961年自玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵液中得到的一种酸性环脂肽类化合物,2003年9月美国FDA批准注射用达托霉素上市。
达托霉素不仅具有新颖的化学结构,且其作用模式也与任何一个已上市的抗生素不同,故不易产生耐药性[1]。
达托霉素的结构较为复杂,因结构鉴定技术的限制,曾经长期无法精确推测其分子结构。
原研的美国Lilly公司曾将其结构中的D-Asn2误认为2005年美国Cubist公司经一系列实验确认后对此公开予以纠正[3]。
多肽类化合物的一级结构决定了化合物的高级结构及功能,其中特定氨基酸的D,L-构型(绝对构型)的改变可能会导致化合物在稳定性和生物活性等方面产生显著的差异[4-6],如达托霉素的D-Asn2被替换成L-Asn2后的抗菌活性要比达托霉素低10倍以上[3]。
达托霉素的HPLC的方法学研究
达托霉素的HPLC的方法学研究摘要建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。
方法以达托霉素和一些杂质为对照品,采用高效液相色谱法进行测定。
色谱条件为色谱柱:Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5µm,流速:1.0ml/min,检测波长:223nm,进样量:25µl,柱温:25℃,梯度洗脱的流动相A:称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解,用磷酸调pH 至3.1,流动相B:乙腈。
结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。
[关键词] 含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性目录摘要 (3)一、仪器与药品 (5)二、方法建立与方法描述 (5)(一)、方法建立 (5)(二)、方法描述 (5)三、验证内容 (7)(一)系统适应性 (7)(二)降解实验 (8)(三)专属性 (8)(四)定量限LOQ和检测限LOD (9)(五)线性 (12)(六)相对校正因子的计算 (18)(七)精密度 (18)(八)准确度 (23)(九)溶液稳定性 (26)(十)耐用性 (28)四、结论 (29)五、典型图谱 (30)六、参考文献 (30)一、仪器与药品电子分析天平XP205 已校正高效液相色谱仪Agilent 1200 已校正磷酸二氢铵分析纯上海光铧科技有限公司20121215 乙腈色谱纯Merck UN1648 注射用水每日更新本厂自制纯化水每日更新本厂自制达托霉素对照品P1301,94.7% 本实验室内部标定水解物P1301,91.4% 本实验室内部标定β-异构体P1301,71.9% 本实验室内部标定脱水物P1301,86.6% 本实验室内部标定达托霉素样品S130301 浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述(一)、方法建立袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。
达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究
达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究刘欣;周宋汇;孙科【摘要】为优化达托霉素发酵条件,通过单因素实验和响应面方法研究了达托霉素发酵条件温度、pH值、接种量、通风量和搅拌转速.结果表明:优化后的发酵工艺条件为温度27.74℃、pH值8.36、接种量8.48%、通风量6.13 L/min、搅拌转速242 r/min,在此条件下达托霉素的产量可达880.48 mg/L,比最新报道的达托霉素发酵效价提高了132%.本方法大幅度提高了达托霉素产量,对达托霉素工业化生产提供了可靠的研究基础.【期刊名称】《中南民族大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2019(038)001【总页数】5页(P76-80)【关键词】达托霉素;发酵工艺条件优化;单因素实验法;响应面法;方差分析【作者】刘欣;周宋汇;孙科【作者单位】江苏省肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,南京医科大学附属肿瘤医院,南京210009;江苏省肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,南京医科大学附属肿瘤医院,南京210009;徐州生物职业技术学院生物工程系,徐州221006【正文语种】中文【中图分类】Q815达托霉素(doxymycin)是一种环状脂肽类抗生素,可以由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵得到.达托霉素对绝大多数G+菌具有杀灭的功能,更主要的是它可以作用于耐药菌如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金葡菌(VRSA)等[1,2],近年来成为医药界的研究热点.达托霉素结构复杂,化学合成难度较大,通常采用生物发酵方法进行生产. 但是发酵法产量较低,一直限制其在我国的规模使用. 目前国内提高达托霉素发酵效价的研究多集中在对优良菌种的选育上,如采用联合抗性筛选法、紫外诱变方法、氦氖激光辐照-亚甲基胍复合诱变法来筛选优良菌种[3-5]. 最新的文献显示,周剑等[6]通过流加补料发酵方式最终使达托霉素产量达到380 mg/L. 本研究以本实验室筛选的诱变玫瑰孢链霉菌FN2015为发酵菌种,优化各项发酵条件,为大规模发酵生产达托霉素提供可供借鉴的理论基础.1 材料与方法1.1 材料与试剂玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus) FN2015,实验室保藏菌种.玉米浆试剂级;酵母浸膏、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、七水硫酸镁、三水磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、糊精等为国产分析纯试剂;消泡剂食品级.1.2 培养基斜面培养基:葡萄糖2.0%,酵母浸膏1.0%,氯化钠0.05%,七水硫酸镁0.1%,三水磷酸氢二钾0.05%,七水硫酸亚铁0.001%,琼脂粉1.8%.种子培养基:糊精2.5%,玉米浆0.5%,七水硫酸镁0.1%,三水磷酸氢二钾0.04%.发酵培养基:玉米淀粉水解糖3.5%,玉米浆0.5%,氯化钾0.05%,消泡剂0.01%.1.3 仪器与设备SHP-400智能生化培养箱(苏州威尔);无菌超净工作台(JB-CJ-1500FX,苏州佳宝) ;多振幅轨道恒温摇床(ZWY-103B ,上海圣科);机械搅拌式发酵罐(20 L,镇江东方);台式高速冷冻离心机(H1650R,上海齐闵);高效液相色谱仪(1260型,美国安捷伦).1.4 方法1.4.1 玫瑰孢链霉菌FN2015的培养取出保藏在超低温冰箱中的FN2015的孢子,接种到斜面培养基上,30 ℃、35%~55%的湿度下培养10~12 d,制备孢子悬液浓度为107 个/mL. 取1 mL孢子悬液接种到装100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,于恒温摇床中培养,培养条件为:28 ℃、200 r/min. 培养42 h后按9%的接种量接种到5 L小型发酵罐,发酵条件为:温度(28±1) ℃、搅拌转速240~300 r/min、空气流量6~7L/min、罐压0.05 MPa.1.4.2 发酵条件确定方法选取对达托霉素发酵影响显著的5个因素温度、初始pH值、接种量、通风量和搅拌转速进行单因素实验. 以某个发酵条件为变量,其他条件固定不变,通过实验确定此发酵条件.1.4.3 发酵条件优化方法以单因素实验的5个因素作为影响因子进行响应面实验,通过Box-Behnken试验水平设计[7],具体的实验设计如表1,其中温度为影响因子A、初始pH值为影响因子B、接种量为影响因子C、通风量为影响因子D、搅拌转速为影响因子E.表1 Box-Behnken实验因子水平设计Tab.1 Level design of Box-Behnken test factor因素水平温度/℃初始pH接种量/%通风量/(L/min)搅拌转速/(r/min)-1267.581.02000288.0101.22501308.5121.43001.4.4 达托霉素效价测定方法达托霉素的效价测定见文献[8].2 结果与分析2.1 单因素实验及结果2.1.1 发酵温度对达托霉素发酵结果的影响其他条件不变,选取不同发酵温度24、26、28、30和32 ℃,测定达托霉素的产量,从图1 可以看出当发酵温度为28 ℃时,达托霉素的产量最高为880.18mg/L,因此达托霉素发酵的最适温度为28 ℃.图1 发酵温度对达托霉素发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on doxymycin fermentation2.1.2 初始pH值对达托霉素发酵结果的影响在不同的发酵初始pH值条件下,当发酵初始pH值为8.0时(图2),达托霉素的产量最高为879.83 mg/L,所以选定达托霉素发酵初始pH值为8.0.图2 初始pH值对达托霉素发酵的影响Fig.2 Effect of initial pH value on the fermentation of doxymycin2.1.3 接种量对达托霉素发酵结果的影响选择不同的接种量 4%、6%、8%、10%和12%进行发酵,然后测定达托霉素的产量,从图3 可以看出当接种量为10%时,达托霉素的产量最高为881.52 mg/L,所以达托霉素发酵的最适接种量为10%.图3 接种量对达托霉素发酵影响Fig.3 Effect of inoculation volume on the fermentation of doxymycin2.1.4 通风量对达托霉素发酵结果的影响选取不同的通风量 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 L/min,测定达托霉素的产量,当通风量为6.0 L/min时(图4),达托霉素的产量最高为883.57 mg/L,因此达托霉素发酵最适的通风量设为为1.2 L/min.2.1.5 搅拌转速对达托霉素发酵结果的影响其他条件不变,分别选取不同的搅拌转速 150、200、250、300和350 r/min,测定达托霉素的产量,从图5 可以看出当搅拌转速为250 r/min时,达托霉素的产量最高,为882.69 mg/L,因此选择250 r/min作为发酵搅拌速度.图4 通风量对达托霉素发酵影响Fig.4 Effect of ventilation on doxymycin fermentation图5 搅拌转速对达托霉素发酵影响Fig.5 Effect of stirring speed on the fermentation of doxymycin2.2 发酵条件的响应面优化2.2.1 回归模型建立以达托霉素产量为因变量Y,温度A、初始pH值B、接种量C、通风量D和搅拌转速E为自变量,利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行回归分析,建立多元回归模型[9-11]:Y=100.00+5.94A+16.58B+15.64C+8.37D+10.31E+10.75AB+4.69AC-3.38AD-5.47AE-8.05BC+14.38BD-3.06BE+0.93CD+7.27CE-12.52DE-17.49A2-13.51B2-18.94C2-27.28D2-15.27E2.以单因素结果为依据设计Box-Behnken试验的因素水平,响应面的实验结果见表2.表2 Box-Behnken试验结果Tab.2 Results of the Box-Behnken test序号ABCDE达托霉素产量/(mg/L)1-1-1000861.7921-1000863.633-11000865.59411000882.58500-1-10878.546001-10881.48700-110885.38800110876.6990-100-1864.72100100-1874.82110-1001873.571201001871.7313-10-100858.951410-100878.1515-10100853.691610100885.2817000-1-1877.63180001-1879.4019000-11875.292000011877.47210-1-100872.712201-100875.74230-1100868.372401100882.5025-100-10861.5426100-10864.9227-10010858.292810010879.482900-10-1872.62300010-1873.933100-101879.373200101872.7033-1000-1862.39341000-1869.4835-10001859.623610001869.49370-10-10870.5638010-10874.83390-1010869.0440********.684100000872.834200000872.834300000872.8344 00000872.834500000872.834600000872.832.2.2 达托霉素产量的方差分析对回归方程进行方差分析,分析结果见表3.表3 达托霉素产量回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the yield regression model of doxymycin方差来源平方和自由度均方F值Pr>F模型18436.8220921.84113.32626<0.0001A3482.38513482.38528.49827<0.0001 B2548.747212548.747226.36289<0.0001C1327.648111327.648117.468350. 0126D1208.386811208.386813.658360.00002E896.43821896.43828.368257 40.0013AB368.58361368.58366.6754210.0021AC73.8753173.87530.586433 0.0467AD56.8393156.83930.6498210.0864AE264.98451264.98454.7832900. 0058BC149.63861149.63862.9078320.0026BD87.5938187.59380.9080620.0 012BE272.74321272.74324.0468360.0038CD63.0843163.08430.7063270.00 95CE83.7593183.75930.8979640.0012DE268.48761268.48764.5863250.004 7A23638.743813638.743827.876490<0.0001B23217.764313217.764324.58 7253<0.0001C24831.738214831.738237.849085<0.0001D22158.46841215 8.468414.4725840.0003E2947.35721947.35727.4638920.0015残差2642.764725105.7106失拟2642.764720132.1382标准误差050R2=0.9643从表3可以看出:模型的F值为13.33,Pr>F小于0.0001,表明自变量(A、B、C、D、E)和因变量Y之间线性关系极显著,所建立的回归方程可以对真实曲面模拟;相关系数R2=0.9643表明模型拟合程度高,置信度高[7],可以利用建立的模型分析达托霉素产量的变化.利用Design Expert 8.0.6软件对回归方程进行一阶偏导求解[12,13],曲面最大点对应A=0.42、B=1.35、C=0.32、D=0.45、E=0.21,所对应的达托霉素发酵的条件分别为:温度27.74 ℃、pH值8.36、接种量8.48%、通风量6.13 L/min、搅拌转速242 r/min.2.2.3 达托霉素发酵条件实验验证为了验证响应面结果的可靠性,采用响应面实验条件(温度27.74 ℃、pH值8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速 242 r/min)进行小型发酵罐发酵实验,4个平行,结果显示,达托霉素的产量达到880.48 mg/L.3 结语达托霉素是一种新型抗生素,主要通过发酵法进行生产,但发酵产量一直不高限制了达托霉素的大规模使用. 本研究在单因素实验的基础上,采用响应面法对达托霉素发酵工艺条件进行优化,优化后发酵工艺条件为温度27.74 ℃、pH值 8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速242 r/min,在此条件下达托霉素的效价可达880.48 mg/L,比最新文献[14-17]报导的结果高出50%~132%,发酵效价大幅度提高,此次研究对工业化发酵生产达托霉素具有重要的参考价值. 要进一步提高发酵的效价,在发酵过程中最好筛选出合适的前体,采用流加方式发酵,这将是本研究下一步的工作.参考文献【相关文献】[1] 何美儒,金志华,胡升,等.补加葡萄糖对玫瑰孢链霉菌发酵产述托霉素的影响[J].中国医药工业杂志,2012,43(8):662-665.[2] 周剑,黄建峰,张引,等.低能离子注入诱变达托霉素高产菌株及其发酵的研究[J].中国抗生素杂志,2012,37(8):587-592.[3] PARTHIBAN K,VIGNESH V, THIRUMURUGAN R.Characterization and in vitro studies on anticancer activity of exopolymer of Bacillus thuringiensis S13[J].African Journal of Biotechnology,2014,13(21):37-44.[4] 于红,杨文菊,刘波,等.RRLC定性检测食用油中10种抗氧化剂的条件研究与应用[J].新疆医科大学学报,2011,34(2)172 -174.[5] 余继叁,洪葵,林海鹏,等.玫瑰孢链霉菌NRRL11379产达托霉素前体物A21978C的发酵培养基优化[J].安徽农业科学,2008,36(19):7974-7976.[6] 周剑,张引. 达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵[J].中国抗生素杂志,2018,7(43):817-823.[8] 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antioxidant liposome containing vitamin C and folic acid[J].J Microencapsul,2018,6(9):1-9.[15] SUN H, YAN P, LU P,et a1.Effects of exogenous addition of vitamin C on ε-poly-L-lysine fermentation by Streptomyces[J].Food and Fermentation Industries, 2018, 44(9):29-35.[16] 薛海萍,高婷婷,杨骏,等.红景天苷磷脂复合物的体外透皮试验[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(9):9-11.[17] DAS M K,KALITA B,et al.Design and evaluation of phytophospholipid complexes (phytosomes)of rutin for transdermal application[J].J Appl Pharm Sci,2014,4(10):51-57.。
一种达托霉素的提取纯化方法
2. 如权利要求1 所述的提取纯化方法,其特征是所述的:1)、富集:A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂,吸附后收集树脂,装入解吸柱中;B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸;C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液洗脱解吸柱,收集解吸液;D、解吸液纳滤浓缩;2)、粗提取:A、酸性柱层析:调浓缩液pH 至中等酸性;上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水溶液阶梯梯度洗脱;纳滤浓缩;B、中性柱层析:调浓缩液pH 至中性,向浓缩液中加入1-5% 盐;上柱后用含30-45% 低分子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱,洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍;用20-30% 低分子醇水溶液洗脱,收集洗脱流分;调pH 至中性;纳滤机浓缩;3)、精制:A、中性柱层析:浓缩液中加入1~5% 盐,调整浓缩液pH 中性;上柱后用5% 低分子醇水溶液洗脱层析柱,洗脱量为柱体积的6-9 倍;用10-20% 低分子醇水溶液洗脱,洗脱量为柱体积的8-13 倍,收集洗脱流分;收集的流分调pH 至中性;用HPLC 法检测所收集的流分,合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分,纳滤机浓缩;B、酸性柱层析:调浓缩pH 至中等酸性;上柱后,采用低分子醇和挥发性酸水溶液组成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱,洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集,在洗脱量达到8~14 倍柱体积时停止洗脱;合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分;4)、冻干:冷冻干燥至粉末后,在20℃ ~30℃,压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时,得成品。
3. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法,其特征是所述的步骤1)中的大孔吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种;步骤2)的中的层析柱填料为PRP 512、C18、或C8 中的任一种,步骤3)层析柱的填料选用C18 或C8。
4. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法,其特征步骤1)中是所述的解吸剂为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种。
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的检测 和分析 ,进行 了结构认 定。除T4 个 已知杂质之外 ,获得 了一 个未报道 的杂质 ,为达托霉素氨 基酸 内酰 胺断裂后的开环
抗 生 素 , 由1 3 5 " 氨 基 酸 组成 ,其 中 1 0 个 氨 基 酸 组成
1 个 氨 基酸肽 环 ,另有 3 个 氨基 酸排 列成 线状 ,这3 个
输 、保 藏 环节 的条 件 变化 均会 导 致 杂质 的产 生 , 影 响 产 品质 量 和 治疗 效 果 。为评 价 药 物 的 安全 性 、 杂
Ke y wo r d s Da p t o myc i n; I mp ur i t i e s ; HPLC a n a l ys i s ; M S— MS
达 托 霉 素 是 由玫 瑰 孢 链 霉 菌产 生 的一 种 环脂 肽
起 的感 染[ 1 - 2 ] 。 达 托 霉 素 的化 学 结构 复 杂 ,其 生产 、纯 化 、运
va l u e s . I n t hi s p a p e  ̄i mp ur i t y pr o il f e of d a pt o my c i n i n d i fe r e nt pH v a l ue s wa s s t ud i e d . Us i ng a n a l y t i c a nd p r e p a r a t i ve HPLC, iv f e r e l a t e d i mp ri u t i e s o f da p t o myc i n we r e o bt a i ne d. The s t r u c ur t e s o f i mp ri u t i e s we r e i de n t i ie f d b y MS a n d
7 6 0
中国抗生素杂志2 0 1 3 年1 0 月第3 8 卷第 1 0 期
文章编号:1 0 0 1 . 8 6 8 9 ( 2 0 1 3 ) 1 0 — 0 7 6 0 — 0 5
达托霉素在不 同酸碱 条件下产生的杂质及其结构研 究
张定丰 ・ 夏兴 , 3 /苏永槐 - 饶敏 2 孙 新 强 戈梅 ,
Z h a n g Di n g - f e n g , Xi a Xi n g 2 一 , S u Yo n g — h u a i , Ra o Mi n 2 , S u n Xi n — q i a n g a n d Ge Me i
( 1 Z h  ̄ i a n g Me d i c i n e C o . , L t d . Xi n c h a n g P h a r ma c e u t i c a l F a c t o r y , Xi n c h a n g 3 1 2 5 0 0 ;
2 S h a n g h a i He a l t h Cr e a t i o n C e n t e r o f Bi o p h a r ma c e u t i c a l R&D, S h a n g h a i 2 0 0 2 4 0 ;
3 S c h o o l o f P h a r ma c y , S h ng a h a i J i a o T o n g U n i v e r s i t y , S h a n g h a i 2 0 0 2 4 0 )
Ab s t r a c t Da p t o my c i n i S a n e w a n t i — r e s i s t a n t a n t i b i o t i c . wh i c h c a n d e r i v e t o v a r i o u s i mp u r i t i e s i n d i f f e r e n t p H
产物 。
关键词:达托霉素;杂质 ;HP L C 分析 ;MS . MS 分析
中 图分 类 号 :R 9 7 8 . 1 文 献标 志 码 :A
St u dy o n c ha r a c t e r i z a t i o n o f i m pu r i t i e s d e r i ve d f r o m da pt o my c i n i n d i f f e r e nt pH
( 1 浙江医药股份有限公司新 昌制药厂 ,新 昌 3 1 2 5 0 0 :2上海来 益生物药物研发 中心 有 限责任公司,上海2 0 0 2 4 0 1 3上海交通大学药学院,上海 2 0 0 2 4 0 )
摘要 :达 托霉素是一种正在 临床使用 的新型抗耐药菌抗生素 。由于结构特 点 ,其在不 同的p H值下会 产生不同的杂y s i s . Be s i d e s f o u r r e p o r t e d i mp u r i t i e s , a n u n r e p o  ̄ e d i mp u r i t y wa s o b t a i n e d a n d i d e n t i ie f d a s l a c t a m h y d r o l y s i s p r o d u c t .