第五节 亲和层析
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
AC_XP
第七节 应 用
1. 2. 3. 4. 5. 6.
抗原、抗体的纯化 受体蛋白的纯化 糖蛋白的纯化 同工酶的纯化 亲和标记肽的纯化 核酸的纯化
|-O – CH2 – CH – CH2 – NH – Pro. | OH
二．手 臂 的连 接
接臂的方法： 1.手臂先接配体后偶联 2.手臂先偶联后接配体 NH2(CH2)nNH2 n=2 - 12 手臂的类型： 接手臂：
三． 蛋白质偶联的特殊问题
在较低 pH 偶联可减少蛋白质与活化琼脂糖的多 点结合。
5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
Scanning electron micrograph of an agarose gel
Magnification x 50,000
Ref: Anders S. Medin, PhD Thesis, Uppsala University 1995
Chroatography media
1.
E = 乳糖合成酶A蛋白 B = α- 乳清蛋白 E + A EA + B A = N – 乙酰 – D – 氨基葡萄糖
EAB
负洗脱
两元专一性三元专一性的源自亲和层析洗脱设计正洗脱 A = NAD+ B = AMP C = Py E = LDH
五、化学裂解
连二亚硫酸硫酸钠还原、高氯酸、盐酸胍 三氯醋酸、尿素
核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶
、
结合蛋白 激素及维生素：受体、载体蛋白 细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素
三、配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度
当配体亲和力高，且本身带电则固定化 配体浓度须降低
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析的原理及应用
亲和层析的原理及应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术方法。
它基于生物分子之间的特异性相互作用，例如抗原与抗体的结合。
亲和层析通过利用这种特异性相互作用，将目标分子从混合物中有效地分离出来。
亲和层析可以用于纯化蛋白质、分离细胞、筛选药物等多种应用。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的相互作用。
在亲和层析中，通常使用的是一对具有特定相互作用的分子，例如抗原与抗体、配体与受体等。
这对分子中的一个部分被固定在固相介质上，而另一个部分则与目标分子发生特异性相互作用。
亲和层析的步骤包括：•预处理：选择适当的固相介质，并将其与特异性相互作用的分子配对。
固相介质可以是固定在柱子或颗粒上的化学物质。
•样品加载：将待分离的混合物样品加到预处理后的固相介质上。
目标分子与固相介质上的特异性配对分子发生结合。
•洗涤：用缓冲液将非特异性结合的物质洗掉，以减少背景噪音。
•洗脱：用特定的洗脱液冲洗固相介质，破坏特异性相互作用，使目标分子从固相介质上解离出来。
•收集纯化物：通过收集洗脱液中的目标分子来获取纯化物。
3. 亲和层析的应用亲和层析在生物科学研究和工业领域中得到了广泛的应用。
以下是亲和层析的一些常见应用：3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于纯化蛋白质。
通过将特异性配对的分子与待分离蛋白质结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
亲和层析在蛋白质研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
3.2 细胞分离亲和层析可以用于分离特定种类的细胞。
通过将细胞与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标细胞从混合物中分离出来。
这在细胞学研究和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
3.3 药物筛选亲和层析可以用于筛选药物候选物。
通过将潜在药物分子与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以筛选出具有特定相互作用的药物候选物。
这在药物研发过程中有着重要的应用价值。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以用于DNA/RNA的纯化。
第五章亲和层析分离技术详解
多糖基质
环氧化物法
当前21页，总共43页。
多糖基质
苯醌法
当前22页，总共43页。
多糖基质 其他方法——甲苯磺酰氯
当前23页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
戊二醛法
当前24页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
肼法
当前25页，总共43页。
多孔玻璃与硅胶
当前26页，总共43页。
亲和配基固定偶联的密度的测定
➢ Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白
➢ 肝素亲和层析
当前40页，总共43页。
5.4.6 共价色谱
原理 （a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程
当前41页，总共43页。
共价介质的合成
引入硫醇基
引入双硫键
当前42页，总共43页。
共价色谱的吸附和解吸
1、上样预处理 2、吸附
当前6页，总共43页。
亲和层析分离技术
➢ 亲和层析的理论 ➢ 亲和介质的制备 ➢ 常见的亲和层析
当前7页，总共43页。
5.2 亲和层析的理论
当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡
E K d E 1 L M K lm E LM
Kd
E1 E
Klm EE1LLM M
当前8页，总共43页。
N N
N Cl
NH OH R
OH3S
SO3H
HO3S
SO3H
其中R为:
SO3H NN
当前36页，总共43页。
染料亲和层析
染料配基和蛋白质作用大小排列
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
Procion Blue MX-7RX
Cibacron Blue 2-RA
第五章亲和层析
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。
简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。
亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。
目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。
在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。
自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了飞速发展。
亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。
不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。
根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高说明与化合物的亲和性越强)：(1)较弱亲和，用氧化物吸附剂；(2)中等亲和，用水合物吸附剂；(3)较强亲和，用亲水性吸附剂；(4)极强亲和，用强水合物吸附剂。
第五章 亲和层析
3．配体结合量的测定
配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体
的量表示的。如用mg/ml 表示。
测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量
的参数。
具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
•
•
(1) ① ② (2)
直接测定法 2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定 间接测定法
亲和层析原理
生物分子之间特异性结合
抗原－－抗体
激素－－受体 酶－ － 底物、底物类似物、抑制剂、辅基 核酸－－互补链
第二节
亲和层析操作
配基
载体
一、载体的选择
理想的载体应满足下面的要求：
具有较好的物理化学稳定性 较多的活性基团 能够和配体稳定的结合 结构为均匀的多孔网状结构 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附
例如 实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，
可导致酶活力丧失83％，剩余酶活力17％。
问题： 该实验的现象，
究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17％的酶活力?
还是因为有少量的核酸酶未标记上而残存酶活力?
研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 待纯化的蛋白质 配体 待纯化的蛋白质
抗原
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素 含生物素的酶
肝素
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA 聚合酶
胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白 凝集素、糖苷酶
亲和层析的原理
亲和层析的原理亲和层析是一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
在亲和层析中，利用生物分子之间的特异性结合，将目标蛋白或其他生物分子从混合物中分离出来，从而实现其纯化和富集。
亲和层析技术已经成为生物化学和生物技术领域中不可或缺的一部分，被广泛应用于蛋白质纯化、抗体富集、药物筛选等多个领域。
亲和层析的原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是蛋白质与配体之间的结合，也可以是抗体与抗原之间的结合。
在亲和层析中，通常会使用具有特定亲和性的配体或抗体来固定在固定相（如琼脂糖、琼脂糖珠等）上，然后将混合物通过固定相，利用目标分子与固定相上的配体或抗体之间的特异性结合来实现目标分子的分离。
亲和层析的选择性和特异性是其最大的优势之一。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
此外，亲和层析还可以在温和的条件下进行，避免了对目标分子的结构和活性产生不可逆的影响。
因此，亲和层析在生物分离领域中具有广泛的应用前景。
亲和层析的原理还可以进一步细分为不同的类型，如亲和色谱、亲和吸附等。
在亲和色谱中，通常会利用配体与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离；而在亲和吸附中，则是利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现分离。
这些不同类型的亲和层析技术可以根据具体的实验需求进行选择和应用。
总之，亲和层析作为一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
亲和层析技术在生物化学和生物技术领域中有着广泛的应用前景，对于促进生物分离和纯化技术的发展具有重要意义。
第五节 亲和层析
2、基质的活化
亲和层析原理
亲和层析原理首先，亲和层析原理的基本原理是什么呢？亲和层析原理是利用生物大分子与其特异性亲和配体之间的非共价相互作用来实现目标生物大分子的选择性吸附和分离。
亲和配体通常是一种具有高亲和性的小分子化合物，它可以与目标生物大分子的特定结构域或功能基团结合，形成稳定的复合物。
在亲和层析过程中，混合物经过填料床层后，非特异性成分通过洗脱缓冲液被洗脱，而目标生物大分子则与亲和配体形成的复合物保持在填料上，最终通过改变条件将目标生物大分子从亲和填料上洗脱出来，实现其分离和纯化。
其次，亲和层析原理的应用范围非常广泛。
在生物技术领域，亲和层析技术被广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分离和纯化。
例如，利用亲和层析技术可以从复杂的细胞提取物中高效地纯化目标蛋白质，为后续的功能研究和结构分析提供高纯度的样品。
在制药工业中，亲和层析技术也被用于生物药物的生产和纯化过程中，例如单克隆抗体、重组蛋白等生物药物的制备工艺中都离不开亲和层析技术的应用。
此外，亲和层析原理还具有许多优点。
首先，亲和层析技术具有高选择性，可以实现对目标生物大分子的高效分离和纯化，避免了传统分离方法中多次反复操作的繁琐和耗时。
其次，亲和层析技术操作简单，不需要复杂的设备和操作条件，适用于实验室规模的小型分离和纯化工作。
最后，亲和层析技术还可以实现对生物大分子的非变性分离，保持目标生物大分子的天然构象和生物活性，有利于后续的功能研究和应用。
总的来说，亲和层析原理是一种基于生物大分子与特定亲和配体之间特异性相互作用的分离和纯化技术，具有广泛的应用前景和许多优点。
随着生物技术和制药工业的不断发展，亲和层析技术将在更多领域发挥重要作用，为生物大分子的研究和应用提供有力支持。
希望本文对您了解亲和层析原理有所帮助，谢谢阅读！。
亲和层析的原理与应用
亲和层析的原理与应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物化学物质的技术，它利用生物分子之间特定的相互作用（如抗原和抗体之间的结合）来实现对目标分子的选择性识别和富集。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子的相互作用，其中最重要的是抗原与抗体之间的特异性结合。
该技术依赖于抗体与目标分子之间的亲和作用，并通过将抗体固定在固定相上，使得只有与目标分子结合的物质能够与抗体发生相互作用。
亲和层析分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，样品中的目标分子与固定在固定相上的抗体结合。
而在洗脱步骤中，通过改变洗脱缓冲液的条件，使得与抗体结合的目标分子从固定相上解离，从而得到纯化的目标分子。
3. 亲和层析的应用亲和层析技术在许多生命科学领域中得到广泛应用，以下列举了其中几个常见的应用。
3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于大规模纯化特定蛋白质。
通过使用与目标蛋白质结合的特异性抗体，可以选择性地捕获和纯化目标蛋白质。
这种方法通常比其他纯化方法更简单且更高效。
3.2 药物开发在药物开发过程中，亲和层析可用于筛选和纯化潜在的靶点蛋白和药物候选物。
通过选择与给定药物结合的特异性亲和剂，可以实现对目标蛋白的快速分离和纯化。
3.3 癌症诊断亲和层析技术在癌症诊断中也具有重要应用。
通过使用特定的抗体，可以选择性地捕获和检测癌细胞标记物。
这种技术可用于早期癌症的诊断和监测。
3.4 生物传感器亲和层析可应用于构建生物传感器，用于快速、敏感地检测特定分子的存在和浓度。
通过将与目标分子特异性结合的抗体固定在传感器表面，可以实现对目标分子的选择性识别和定量分析。
3.5 基因工程亲和层析可以用于分离和纯化特定的核酸序列。
通过使用与目标DNA或RNA 序列特异性结合的亲和剂，可以选择性地捕获和纯化目标核酸分子。
4. 结论亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，基于生物分子之间的特异性相互作用。
该技术广泛应用于蛋白质纯化、药物开发、癌症诊断、生物传感器和基因工程等领域。
亲和层析原理
亲和层析原理亲和层析原理是一种利用生物分子之间特异性相互作用进行分离的技术。
其基本原理是利用亲和配体和靶分子之间的特异性结合来实现对靶分子的选择性捕获和分离。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和素等，而靶分子则是需要分离或纯化的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
在亲和层析过程中，样品混合物首先通过填料，亲和配体与靶分子结合，非特异性的成分被洗脱，最后通过改变条件来实现靶分子的解离和纯化。
亲和层析原理在生物化学领域有着广泛的应用。
例如，在蛋白质纯化方面，可以利用蛋白质与亲和配体的特异性结合来实现对目标蛋白的高效纯化。
在药物研发中，亲和层析技术也被广泛应用于药物靶点的筛选和鉴定。
此外，亲和层析还可以用于分离和纯化DNA、RNA等核酸分子，具有广泛的应用前景。
与其他分离技术相比，亲和层析具有许多优点。
首先，它具有高选择性和高分辨率，可以实现对目标分子的高效分禶。
其次，亲和层析技术操作简单，易于扩展和自动化，适用于大规模生产。
此外，亲和层析技术还可以在温和的条件下进行，有利于保持靶分子的生物活性。
然而，亲和层析技术也存在一些局限性。
首先，亲和层析柱的填料选择和修饰需要针对不同的亲和配体和靶分子进行优化，成本较高。
其次，亲和层析柱的再生和重复使用也是一个挑战，需要综合考虑填料的稳定性和再生性。
综上所述，亲和层析原理是一种重要的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对其基本原理、应用领域以及优缺点的了解，可以更好地应用亲和层析技术进行生物分离和纯化，推动生物医药和生命科学领域的发展。
亲和层析分析
酶的名称
醇脱氢酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶
己糖激酶 甘油激酶
来源
结合强度* 吸附剂1 吸附剂2
酵母
400
0
兔肌肉
0 >1 mol/L#
酵母
0
0
122
0
*以KCl浓度（mol/L）表示。 #需加5×10-3 mol/L还原辅酶I才能洗脱。
一种专一性的亲和吸附剂只能分离一种酶，虽然效 率高，但使用范围窄，如果能以一类酶的通用配基 制成亲和吸附剂，再仔细选择洗脱条件，将其逐个 分别洗脱下来，可以在短时间内分离纯化几个酶。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：0.5-1.0 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-6(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右。
多孔玻璃载体亲和吸附剂的制备
载体先在5％硝酸溶液中煮沸45 min，用水洗涤，在 115℃下烘干，1g干的清洁载体加入75 mL 10%的γ丙氨基三乙氧硅烷，后者溶解在甲苯中，回流12-24 小时，用甲苯、丙酮清洗，空气干燥。
活化载体“接臂”
“接臂”的前提：小分子作为配基，被分离物质是大 分子，空间位阻影响亲和吸附。
具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 酶与它的底物或竞争性抑制剂 激素（或药物）与它们的受体 维生素和它的特异结合蛋白 糖蛋白与它相应的植物凝集素等
亲和层析的优点
♦ 待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，一次操作即可得到较高 纯度的分离物质。
♦ 具有浓缩作用，纯化倍数高达几千倍。 ♦ 分离条件温和，有利于保持物质原有的
例如：SAH（S-腺苷酰-高半胱氨酸）可以作为 RNA、DNA和蛋白质转甲基化酶的通用配基。
转甲基化酶
《亲和层析》课件
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、 提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行 分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性 物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用， 如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互 补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大 分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层 析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆 结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层 析介质称为载体。
五、亲和色谱操作条件的选择
1．吸附条件的选择 (1）吸附反应条件 吸附条件最好是自然状态下 配体与目的分子之间反应的最佳条件，如缓冲液中 盐的种类、浓度及pH等条件。如果对配体和配基 之间的结合情况不太了解，就必须对盐种类、浓度 和缓冲液的pH进行条件摸索。如果对配体和蛋自 的结合情况比较了解，可以人为设定反应条件，促 进吸附。例如，金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白 IgG之间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐 浓度、调节pH来增强吸附。 (2）流速的控制 流速也是影响吸附的一个因素 流速不能太快；否则，影响吸附程度。
2、常用载体
（1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差， 不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特 异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用 不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有 关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定 相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
在亲和层析中常用小分子化合物 (如小分子底物、辅 酶、抑制剂等) 作为配基亲和吸附大分子物质 (如酶 等) 。当配基小分子与载体相连接时，载体所形成的 空间位阻会影响到配基与亲和物的密切吻合，往往 不能形成有效的吸附。活化后的琼脂糖要求与带游 离氨基的配基相连接，如果配基不具有游离的氨基， 就无法与载体相连接。
化了 8000 倍。这种技术不但能用来分离一些在生 物材料中含量极微的物质，而且可以分离那些性质 十分相似的生物物质。 此外,亲和层析法还有对设备要求不高、操作
简便、适用范围广、特异性强、分离速度快、分离 效果好、分离条件温和等优点；其主要缺点是亲和
吸附剂通用性较差，故要分离一种物质差不多都得 重新制备专用的吸附剂。另外,由于洗脱条件较苛 刻，须很好地控制洗脱条件，以避免生物活性物质 的变性失活。
3．配基与载体的结合位点
在多肽或蛋白质等大分子作配基时，由于 它们具有的数个可供偶联的功能基团，必 须控制偶联反应的条件，使它以最少的键 与载体连接，这样有利于保持蛋白质原有 的高级结构，从而使亲和吸附剂具有较大 的亲和能力。
4、载体孔径 载体的孔隙是配体向配基接近的运动通道， 所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有 决定性影响。
（3）葡聚糖凝胶
它是经环氧氯丙烷交联，具有立体网格的 多糖类物质，其物理及化学性能比较稳定。 亲和柱的不可逆吸附杂质（如变性蛋白、 脂类等）可用强碱处理除去。与琼脂糖凝 胶相比较，葡聚糖凝胶孔径太小，特别是 经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小， 所以它的应用也受到一定限制。
（4）聚丙烯酰胺凝胶
（2）配基与配体的结合应是专一的和可逆的
配基与分离对象的结合应为专一性结合和可逆，这 样才能保证分离与纯化的效果。如用牛胰蛋白酶抑 制剂作配基就不能保证得到单一的胰蛋白酶，因为 它与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶都有亲和作用。
（3）配基应具有化学活性和稳定性
配基分子上需具有与载体偶联的化学基因，且使偶 联反应尽可能简便、温和，以减少反应时配基亲和 力的损失和载体结构改变。 （4）配基的分子大小必须合适。 常见的配基及洗脱液见教材p91表4-11
（三）载体的活化与偶联
载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配 基连接，偶联前，一般须先活化。 载体表面经过活化后产生的活性基团可以在 简单的化学条件下与配基上的氨基、羧基、 羟基或醛基等功能基团发生共价结合反应， 这一过程称为配基的键合。载体表面活性基 团必须具有通用性和高效性，可以与上述配 基上的常见基团发生简单、快速的反应。
一、原理
亲和层析的设计原理和过程大致分为以下三步：
（1）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支
撑载体偶联或共价结合具有特异亲和性的分离介 质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附酶或其 它生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作
用，故不能被吸附而被洗涤除去。
（3）样品解吸：选择适宜的条件使吸附的亲和介
聚丙烯酰胺的叠氮衍生物进一步和甘氨酰酪氨酸反 应，可制得酪氨酰衍生物。这种衍生物可以和带有氨 基的配基偶合。
形成氨基衍生物 带酰胺基的聚丙烯酰胺衍生物 可与脂肪族二胺反应制得氨基衍生物，它能与带羧基 的配基偶合。脂肪族二胺中的烃链可以作为配基的 “手臂”，利用烃链的长度，可以控制“手擘”的长 短。
第八章 色谱分离技术
第五节 亲和色谱分离技术
亲和色谱分离技术
(affinity chromatography,AFC,简称 亲和层析法) 是专门用于生物大分子的色 谱分离技术，它是一种基于生物活性物质 之间的可逆、具有专一性作用的分离技术。 即是基于固定相的配基与生物分子间的特 殊生物亲和能力来进行相互分离的。它也 属于一种吸附色谱分离法。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
四、影响吸附剂亲和力的因素
1、配基的浓度
在亲和势比较低的时候（ KL ≥ 10-4个摩尔/L ）， 增加配基浓度有利于吸附。
例如，将 N6-（ 6 氨基已烷）-安培-Sepharose 的 用无配基的 Sepharose 稀释 200 倍，使甘油激酶, 乳酸脱氢酶的吸附能力降低；同样的 NAD+亲和 柱用无配基的 Sepharose 稀释 21 倍，使乳酸脱氢 酶吸附能力下降。与此相反，如果将上柱的酶稀 释 200 倍 ， 则 N6- （ 6 氨 在 已 烷 ） - 安 培 Sepharose 的亲和柱吸附甘油激酶和乳酸脱氢酶的 能力不变；将上柱酶稀释 21 倍，则 NAD+亲和柱 对乳酸脱氢酶的吸附能力不变。
三、亲和吸附剂的制备
亲和吸附剂的制备包括三步： 1、载体的选择
2、配基的选择
3、载体的活化与偶联 1、亲和层析对载体的要求
（一）载体的选择
载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同 时提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。 配基与亲和配体的结合势必受到载体的影响。
（1）载体必须能充分功能化，也就是说载体要具 有足够数量的功能基团，或能方便地引入多量的 化学活性基团，以使与配基进行共价连接之用。 （2）载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性， 尽量减少非专一吸附。这样的载体就能耐受亲和、 洗涤、洗脱等各种条件下的处理而不改变其膨胀 度、网孔结构和硬度等性质。此外，载体还应不 易为酶破坏，也不能为微生物所利用。这样可使 亲和固定相便于使用和保存。 （3）载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。载 体的亲水性往往是保证被吸附生物分子稳定性的 重要因素之一。同时，亲水性还有助于达到亲和 平衡，并减少因疏水力造成的非特异性吸附。
（ 4 ）载体应具有多孔的立体网状结构，能使被 亲和吸附的大分子自由通过。高度的多孔性对大 分子自由流动是必需的，同时也为提高配基及配 体的亲和有效浓度提供了条件，使之接近溶液中 的状态，这种状态十分有利于亲和对的两种成份 在自由溶液中发生的相互作用。 （ 5 ）理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀 的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的流 速。通常，精细载体小珠的分离作用能极大地促 进扩散速率低的生物大分子达到扩散平衡，由细 小的凝胶颗粒填充的亲和层析过程，流速虽慢些， 但分离效果良好。
（2）琼脂糖凝胶
它是由 D-半乳糖和 3、6-脱水-L-半乳糖相结合的链状多 糖，商品名为Sepharose。用于亲和层析的主要为交联珠 状凝胶。其琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商 品称为 Sepharose 2B,4B 和 6B(Pharmacia) 和 Utrogels 一 -2 ，一 -4 ，一 -6 （ LKB ）。这类载体能使吸附物质 保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松 孔径大，流速快。例如， Sepharose 4B 的分子量排阻极 限达上百万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团， 非专一性吸附少。 Sepharose CL 是用二溴丙烷处理的交 联琼脂糖，它的稳定性明显增加，能在的 pH 3~14 中应 用， Sepharose CL 凝胶的这种稳定性，扩大了亲和柱制 备时化学反应选用的范围，并能经受比较剧烈的洗脱条 件。通过溴化氰及环氧乙烷类试剂活化，引入活性集团， 并在极温和的条件下连接上较多配基，吸附量较大。
（二）、配基的选择
按照亲和层析的原理，原则上亲和层析的任 何一方都可作为配基，配基的选用主要取决 于分离对象。如分离酶蛋白时可选择小分子 的底物，也可选择大分子的抑制剂。而作为 理想的配基应符合以下要求。 （1）配基与配体有足够大的亲和力
它是配基对互补分子间的作用力，是制 备高效亲和性的重要参数。亲和性亲和力大 小，可用层析时洗脱体积粗略地加以估计。
(3）吸附时间的控制 延长吸附时间也可促进吸 附，可以在进料后不洗脱，静置一段时间后再进 行后续层析步骤。
(4)进样量的大小 减小进样量，将体积较大的原 料分次进料，可以提高吸附效果 。
2．清洗条件的选择
配体与蛋白之间的亲和力是很强的，并且属于特 异性结合，能够耐受使非特异性蛋自质脱落的清 洗条件。洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附 条件与目的分子洗脱条件之间。例如，如果蛋白 质在0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液中吸附、洗脱条件 是0. 6 mol/L的NaCl溶液，则可考虑用0.3 mol/L的 NaCl溶液清洗。