亲和层析

配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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3、配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结合的部 位与载体进行偶联。 AMP-Sepharose亲和柱 腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，对脱氢酶 和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛 -3- 磷酸 脱氢酶有吸附力。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由 变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。
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引入手臂
在亲和层析中引入“手臂”示意图
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
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重氮化法
ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基 苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
பைடு நூலகம்31
碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为 羧基活化剂。 反应中的脲 衍生物可用 有机溶剂洗 涤除去。
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
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4、配基分子的大小
选用大分子配基。
甘氨酸 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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5、配基的类型
较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand）
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通用配基（general ligand）
用于一类物质的分离提纯。
用 NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的 通用配基等。

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三、 载体的活化与偶联
糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物 活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、配基浓度对亲和力的影响
为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值 ≥10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。
对于低亲和力系统，配基浓度。
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（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分 子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。 常用的“手臂 ”多为烃链 。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15

由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10 的“手臂”长为 10 个碳原子，产生一些负电荷，有 利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15 为 15 个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有 利于酸性蛋白的偶联。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基
须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基 团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂 具有较大的亲和力。
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（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
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（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
叠氮化法
重氮化法 (含氨基载体) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
有大量可修饰的酰胺基。
酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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叠氮化法
聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加 1mol/L的亚硝 酸，反应液搅90s； 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
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五、 亲和层析的吸附和洗脱
影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生
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（一）、影响吸附的条件
亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂” （2）疏水性配基
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复合亲和力
离子效应作用，又有疏水作用。
配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选 择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱
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1、非专一性洗脱
1、配基的选择
亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和 势），KL 在10-4～10-8之间。 2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。
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亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ）

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2、配基的浓度
对 亲 和 势 比 较 低 的 时 候 （ KL≥104mol/L），增加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。
技术要点
（1）找与底物专一 可逆结合的配基； （2）将配基通过共 价键偶联到基质； （3）配基与底物吸 附； （4）洗脱目标物。
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技术要点：
寻找可与底物(S)专一可逆结合的配基; 将配基（L）通过共价键偶联到基质，并 要求偶联后L与S的亲和力不变； L与S吸附并与杂质分离，将杂质洗出： 洗脱目标物，即分离纯化。
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和吸附剂：载体—配基
在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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亲和层析的原理
（ 1 ）配基固定化：配基与载 体偶联，结合成具有特异 亲和性的分离介质。 （ 2 ）吸附样品：亲和层析介 质选择性吸附生物活性物 质. （ 3 ）样品解吸：选择适宜的 条件使被吸附物活性物质 解吸。
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，应用受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
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第二节 亲和层析的基本操作 一、基质（载体）的选择
载体在亲和层析中的作用是使配基固定 化，同时提供了亲和对两物质特异性结 合的空间环境。
第二节 亲和层析的基本操作
1.理想的基质应满足下面的要求
具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过
具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速
方法
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高碘酸氧化法
多糖载体与 0.1mol/L 的高碘酸钠氧化反应 24 小 时会产生醛； 在温和条件下，醛与赖氨酸上的 ε-NH2 生成西夫 碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。
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环氧化法
碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生成 环氧化合物； 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。
非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发 生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定 化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低
非专一性洗脱
改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl －<I－<CF COO－<SCN－ <CCl COO－。 3 3 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
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（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B 经 CNBr 活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶 联。
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3、专一性洗脱
使用特异的配基作为洗脱剂
使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用 的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或 目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物
专一性洗脱
S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） （1）竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗 脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。 （ 2 ）当 ESI 稳定性与 EI 相同时， I 的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。 （3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。