亲和层析
亲和层析法
亲和层析载体的组成 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。
原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作 为固定相吸附剂；
当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和 固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合， 其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出；
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。
金属离子亲和层析
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基， 如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利 于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸 的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子 亲和层析得到分离。
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。
依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：
① 正确地预计被设计的配体构像
② 正确预计配体的亲和力
优良配体须具备的条件：
① 与待纯化的物质有较强的亲和力。
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 不利的。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法
亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规
模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤
亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理
亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：
2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。洗脱
条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。常用的洗脱方法包括
pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。洗脱后的目标蛋白
亲和层析原理
亲和层析原理
亲和层析原理是一种分子生物学技术，它可以通过结合蛋白质或其他大分子来识别、分离和分析样本中的分子。亲和层析原理最初由罗伯特·霍夫曼开发，在20世纪70年代末和80年代初受到关注，并开始被广泛应用于生命科学研究。它可以使用多种不同的技术，如普通吸附、替代吸附、抗原-抗体交互作用等，以提取样本中的蛋白质或其他大分子，从而为识别、分离和分析提供帮助。
亲和层析是一种十分有效的分离和分析技术，它的基本原理是利用亲和性来将目标分子从其他杂质分离出来，也就是说，它可以利用亲和性来增强分子之间的结合。这一技术的基本步骤是将目标分子与一种能够与之结合的叫做“亲和剂”的物质结合起来，然后将其放置在一种叫做“层析介质”的专用介质中。当亲和剂与目标分子结合时，所有其他不能与亲和剂结合的分子都会被隔离出来，而只留下与亲和剂结合的分子。
层析介质可以由具有亲和性的物质组成，以及能够提供分离支持的物质。其中一种常用的层析介质是硅胶，它具有很强的亲和性，可以将目标分子从样品中分离出来。
亲和层析技术除了可以用来分离和分析样品中的特定分子外，还可以用来对样品进行浓缩、纯化和重新构建，
以便进一步研究。它还可以用来将蛋白质分解成单个活性部件，以及用于诊断、毒性学研究和其他科学研究。
亲和层析技术的最大优势在于它的精确性和效率。它可以很快地将样品中的特定分子分离出来，而且可以获得比传统方法更高的精度。它也可以省时、省力，因为它可以在较短的时间内获得更多的结果。
亲和层析技术的应用非常广泛，在医学研究、制药、食品安全检测、环境监测等领域都有应用。它可以用来快速检测样品中的抗原，并鉴定出特定的抗体，以帮助识别某种疾病或其他特定情况。亲和层析技术也可以用来研究病毒感染的机制，以及研究细胞内的分子机制，以帮助了解疾病的发展和治疗方法。
亲和层析
间隔臂：用于克服空间位阻从而促进配体和靶分子的结 间隔臂：
合
封闭： 封闭：用亲水性低分子量化合物如乙醇胺来封闭残留的活
化基团
亲和层析操作
1、样品预处理 、 2、柱的填充和制备 、 3、 3、上样 4、洗涤 、 5、洗脱 、 6、再生 、
样品预处理
为了获得好的分辨率和延长柱子的使用寿命，上柱前尽量使 用离心或者过滤的办法去除颗粒性的污染物。 样品的体积和粘度 样品太粘，如果是因为样品的高浓度，可以使用上样缓冲液 稀释。 如果高粘度是由于核酸污染物引起，可以通过多聚阳离子高 分子化合物例如聚乙烯亚胺和硫酸鱼精蛋白除去，核酸引起 的高粘度可以使用核酸酶消化。
AU 2.0
1.5
1.0
Starting material Eluate
0 200 400 600 V olume (ml)
0.5
0.0
纯化 IgM 抗体
Sample: 75 ml cell culture supernatent containing αShigella IgM Column: HiTrap IgM Purification Binding buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M potassium sulphate, pH 7.5 Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析是一种蛋白质分离技术，是将亲水性聚合物——聚丙烯酰胺按预先设计的程序加入到样品溶液中，以胶束为架桥剂。当待测蛋白质在一定浓度梯度的聚合物溶液中通过胶束时，吸附在胶束上并随之进入疏水相中的待测蛋白质就会被高度保留在胶束周围，然后用洗脱缓冲液洗脱，最后将得到的疏水性高聚物的清液在超声波场作用下去除。由于蛋白质和聚丙烯酰胺之间的特异性吸附，使蛋白质在层析液中移动形成特征的拖尾现象。亲和层析是利用层析介质表面上所固有的吸附力，将物质分配到具有不同吸附能力的两相之间，形成彼此分离的各个分子层。亲和层析的种类很多，常见的有：亲和柱层析、疏水膜层析、液膜层析等。
亲和层析技术由英国纽卡斯尔大学与美国加州大学伯克利分校
共同开发的一种新型的蛋白质分离技术，它可以直接分离纯化蛋白质。亲和层析技术的原理基于吸附与解吸附的机理，当待分离物质从层析柱移动时，由于受到吸附介质的吸附，使得该物质的分子量下降，经分离后达到分子量高的蛋白质的峰展宽，而分子量低的蛋白质的峰缩窄甚至消失。这样就把峰位展宽或展宽消失的蛋白质区分开来，分别采集收集它们的蛋白质样品。这种方法对层析介质的选择十分重要。常用的层析介质有以下几种。 1、固相支持物质； 2、疏水固体颗粒；
3、多孔介质。
亲和层析亲和层析技术是在疏水性载体上，借助于疏水性基团对蛋白质的选择性吸附而进行分离纯化的。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合
能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组
分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可
以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③
由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质
间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟
大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成
分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了
飞速发展。亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。按层析原理可将层析分为以下9种：
1、亲和层析
利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理
特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法
引言
亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理
亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。其基本原理如下：
1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法
亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。以下是几种常用的亲和层析方法：
1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
亲和层析法原理硼酸
亲和层析法原理硼酸
亲和层析法是一种从混合物中分离出目标分子（即配体）的技术。该方法利用特定的亲和性分子（即配基）与所需分子结合的能力，将所需分子从混合物中拦截下来。此技术的原理与制备置换树脂相似。
通常，亲和层析法可分为以下几个步骤：
1. 预处理样品：将样品通过某些方法处理，以便使需要寻找的分子与其他分子分离。
2. 配基连接：将配基固定到某种材料（如氧化硅，丙烯酸树脂）上，以便捕捉目标配体。
3. 层析柱装填：将这种材料装入层析柱中，从而创建一个过滤混合物的过滤器。
4. 绑定目标：将样品流经层析柱，配基将配体捕捉下来。
5. 冲洗杂质：一旦所有目标分子都捕获，杂质就可以被冲洗掉。
6. 浓缩和洗脱：所需的分子可以通过复杂的方法浓缩和洗脱，以便得到纯净的样品。
这种技术信手拈来的用途包括纯化蛋白质，制备抗体，提取酶，以及从小分子药物中分离成分。
硼酸
硼酸是一种不规则的分子，由三个元素组成：硼，氧和氢。其化学式为H3BO3，通常以无色晶体或白色粉末形式存在。硼酸具有很高的水溶性，并且可以用于制造淀粉糖和其他产品。
硼酸常常被用作缓冲剂，因为它具有在水中保持稳定的PH值的能力。硼酸是一种较弱的酸，因此它可以用作在微生物学、细胞生物学和生物化学中的缓冲剂，以维持样品的一个稳定的PH范围。此外，硼酸还可以用作用于甲醛固定的样本的缓冲剂，在死细胞、组织样品中广泛使用。
除了作为缓冲剂外，硼酸还可以用作高温玻璃和火花塞陶瓷的材料，因为硼酸具有高熔点和高热稳定性。硼酸也被运用在清洗和杀菌产品中。
虽然硼酸不是一种危险的化学物质，但是有些人对其具有过敏反应。硼酸也可以自然地存在于食物中，特别是对过量的硼酸摄入可能会对人体造成负面影响。因此，人们需要保证自己食用的食品中不含有过多的硼酸，从而避免可能的健康问题。
亲和层析的原理
亲和层析的原理
亲和层析技术是一种基于生物化学原理的分离和纯化方法，它利用生物分子之
间的特异性相互作用来实现目标分子的富集和纯化。这种技术在生物医药领域得到了广泛的应用，尤其在蛋白质纯化和分析方面具有重要的意义。
亲和层析的原理基于生物分子之间相互作用的特异性。在这种技术中，通常会
利用亲和吸附剂将目标分子从混合物中选择性地富集出来。亲和吸附剂可以是具有特定亲和性的配体，也可以是对目标分子具有特异性识别能力的抗体或其他生物分子。通过在固定相上固定亲和吸附剂，将混合物通过柱层析的方式进行处理，目标分子会与亲和吸附剂发生特异性结合，而非目标分子则会被洗脱出来，从而实现目标分子的富集和纯化。
亲和层析技术的原理简单清晰，操作方便，且对目标分子具有较高的选择性和
专一性。这使得亲和层析成为生物分离和纯化中的重要手段。通过选择合适的亲和吸附剂，可以实现对不同性质的生物分子进行富集和纯化，包括蛋白质、核酸、细胞等。因此，亲和层析技术在生物医药领域的蛋白质纯化、药物筛选、生物分子分析等方面发挥着重要作用。
在实际应用中，亲和层析技术需要根据目标分子的特性选择合适的亲和吸附剂，并进行条件优化以实现最佳的分离和纯化效果。此外，还需要考虑到操作的规范性和实验的可重复性，以确保实验结果的准确性和可靠性。
总之，亲和层析技术作为一种基于生物化学原理的分离和纯化方法，在生物医
药领域具有重要的应用前景。通过深入理解其原理和优化操作条件，可以更好地发挥其在生物分离和纯化中的作用，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
strep亲和层析原理
strep亲和层析原理
strep亲和层析的原理是利用strep蛋白的两个生物活性部分：结合表位和二硫键形成表位。结合表位可以与目标蛋白质上特定的氨基酸残基形成高亲和性、高特异性的结合，而二硫键形成表位可以与固相载体蛋白结合。通过这一固定过程，目标蛋白质便可以与固相载体结合，而其他未结合的蛋白质则被洗脱，最后再通过还原剂将二硫键断裂，将目标蛋白质从固相载体上解离下来。这样，结合在固相载体上的目标蛋白质便可以以单分散的状态用各种物理手段(如光、热、酸、碱等)裂解。通过亲和层析技术获得的产物保持原有的空间构型和生物活性,这样进行有关生物学、化学和生物物理学研究，更加精准，简单。
亲和层析
七、亲和层析的应用
1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质 结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理
Figure 1. Loading affinity column.
Figure 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.
酶与杂质完全分开
2.洗脱方法 非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离 子强度、介电常数或温度使物质构象改变， 浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋 白质迅速恢复到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性 只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于 非专一吸附上去的杂蛋白
（四）再生 亲和层析拄可在一次层析后用大量洗 脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡， 经处理后的层析柱能再次使用。
[器材] 1.层析柱 2.恒温孵育箱 3.反应板
[试剂] 1.1mol/L NaCl洗脱液 2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液 3.Sephadex G-50 4.兔红细胞悬液 5.样品液 ：杂蛋白和凝集素
[操作]
1.亲和层析分离 Sephadex G-50装柱，用1mol/L NaCl洗脱液平 衡5分钟,加样6滴。（方法同凝胶层析）加样 后立即开始收集洗脱液，每管收集3ml，控制 流速10~15滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换 0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液进行洗脱，每管收 集3 ml。收集约10管后，用1mol/L NaCl洗脱 液平衡柱5分钟，此柱即可再生。
dna亲和层析
dna亲和层析
DNA亲和层析是一种常用的分离和纯化DNA的方法。它利用DNA 与某些化合物或蛋白质之间的特异性相互作用，将目标DNA从混合物中分离出来。DNA亲和层析的原理是基于DNA与某些化合物或蛋白质之间的特异性相互作用，这种相互作用可以是静电相互作用、氢键相互作用、范德华力相互作用等。
DNA亲和层析的步骤包括：制备亲和层析柱、样品处理、样品加载、洗脱和回收。首先，制备亲和层析柱，选择合适的亲和基质，将其填充到柱子中。然后，将待纯化的DNA样品处理，去除杂质，使其达到适合亲和层析的纯度。接着，将样品加载到亲和层析柱中，目标DNA与亲和基质发生特异性相互作用，被捕获在柱子中。随后，进行洗脱，用洗脱缓冲液洗去非特异性结合的杂质，保留目标DNA。最后，回收目标DNA，用适当的缓冲液洗脱，得到纯净的DNA。
DNA亲和层析具有高效、高选择性、易于操作等优点。它可以用于分离和纯化各种类型的DNA，如基因组DNA、质粒DNA、RNA-DNA杂交物等。此外，DNA亲和层析还可以与其他技术相结合，如PCR、DNA测序等，用于分析和研究DNA序列、结构和功能等方面的问题。
DNA亲和层析是一种重要的DNA分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。随着生物技术的不断发展，DNA亲和层析技术将在基因工程、生物医学、农业等领域发挥越来越重要的作用。
亲和层析
族特异性配基-1
配基
Protein A Protein G Concanavalin A (伴刀豆球蛋白A) Cibacron Blue
特异性
IgG 的Fc 片段 IgG 的Fc 片段 Glucopyranosyl & Mannopyranosyl groups (吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团) 宽范围的酶，血清白蛋白
用游离的配基类似物竞争洗脱
用Glutathione Sepharose纯化GST标签蛋白
结合缓冲液: PBS + 1% Triton X-100 洗脱缓冲液: 10 mM 还原型谷光甘肽, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
用目标物质的类似物竞争洗脱
用Ni Sepharose分离组氨酸标签蛋白 结合缓冲液: 20 mM phosphate, 0.5 M NaCl,20-40 mM 咪唑 洗脱缓冲液: 结合缓冲液中加入500 mM咪唑（终浓度） 注意: 若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入 8M尿素或6M盐酸胍.
蛋白不挂NI柱的原因分析
1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高 2.PH太低（检查样品及缓冲液PH） 3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）
4.组氨酸标签在发酵或纯化时被酶解（加蛋白酶抑制剂 或将标签构建在蛋白另一端）
亲和层析分析
5. 琼脂糖凝胶亲和层析介质GSH-QT4 以琼脂糖凝胶基础层析介质QT4合成的。它可用于分离纯化 谷胱苷肽转硫酶和过氧化物酶等。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：15-20 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-10(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右 。
生物学性质。
亲和层析介质
♦载体（matrix） ♦配基（ligand）
载体的选择
♦ 不溶于水而高度亲水。 ♦ 化学惰性，没有或很微弱的物理吸附
和离子交换等非专一性吸附。 ♦ 足够数量的化学基团。 ♦ 较好的物理和化学稳定性。 ♦ 稀松的多孔网状结构。 ♦ 良好的机械性能。
载体的种类
♦ 琼脂糖凝胶 (sepharose) ♦ 聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel) ♦ 葡聚糖凝胶 (sephadex) ♦ 聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶 (Ultro-gel) ♦ 纤维素 (cellulose) ♦ 多孔玻璃 (Bio-Glass)
悬浮在等体积的水中
搅拌下加入溴化氰 （200 mg CNBr/ml凝胶）
4 mol/LNaOH调pH11左右
用5-10倍体积冷水洗涤
活化的载体
亲和吸附剂
加含配基 4℃下搅 水洗涤 的缓冲液 拌12 h
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32
（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B 经 CNBr 活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶 联。
1、配基的选择
亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和 势），KL 在10-4～10-8之间。 2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。
13
亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ）
14
2、配基的浓度
对 亲 和 势 比 较 低 的 时 候 （ KL≥104mol/L），增加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。
51
2、特殊性洗脱
亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法
特殊洗脱
裂解配基与载体的连接键。
断裂方法有： 硫酯键用羟胺处理30分钟； 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理； 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖 醇等处理。
非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发 生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定 化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低
非专一性洗脱
改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl －<I－<CF COO－<SCN－ <CCl COO－。 3 3 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
33
34
3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10 的“手臂”长为 10 个碳原子，产生一些负电荷，有 利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15 为 15 个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有 利于酸性蛋白的偶联。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由 变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。
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引入手臂
在亲和层析中引入“手臂”示意图
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
用于一类物质的分离提纯。
用 NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的 通用配基等。
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三、 载体的活化与偶联
糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物 活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102
CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202 具有 10 个原子的“手臂”，未端具有羧基；
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四、 影响吸附亲和力的几个因素
KL
配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响
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3、专一性洗脱
使用特异的配基作为洗脱剂
使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用 的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或 目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物
专一性洗脱
S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） （1）竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗 脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。 （ 2 ）当 ESI 稳定性与 EI 相同时， I 的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。 （3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
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五、 亲和层析的吸附和洗脱
影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生
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（一）、影响吸附的条件
亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基
须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基 团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂 具有较大的亲和力。
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（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
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4、配基分子的大小
选用大分子配基。
甘氨酸 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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5、配基的类型
较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand）
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通用配基（general ligand）
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，应用受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
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重氮化法
ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基 苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
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碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为 羧基活Байду номын сангаас剂。 反应中的脲 衍生物可用 有机溶剂洗 涤除去。
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第二节 亲和层析的基本操作 一、基质（载体）的选择
载体在亲和层析中的作用是使配基固定 化，同时提供了亲和对两物质特异性结 合的空间环境。
第二节 亲和层析的基本操作
1.理想的基质应满足下面的要求
具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过
具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速
具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂” （2）疏水性配基
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复合亲和力
离子效应作用，又有疏水作用。
配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选 择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱
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1、非专一性洗脱
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和吸附剂：载体—配基
在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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亲和层析的原理
（ 1 ）配基固定化：配基与载 体偶联，结合成具有特异 亲和性的分离介质。 （ 2 ）吸附样品：亲和层析介 质选择性吸附生物活性物 质. （ 3 ）样品解吸：选择适宜的 条件使被吸附物活性物质 解吸。
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甲苯磺酰氯法
甲苯磺酰氯法 在无水丙酮中进行。
优点：①活化反应迅速； ②偶联条件温和； ③偶联效率高。
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双功能试剂法
双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的化 学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、酚、 醇类等偶联。
方法
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高碘酸氧化法
多糖载体与 0.1mol/L 的高碘酸钠氧化反应 24 小 时会产生醛； 在温和条件下，醛与赖氨酸上的 ε-NH2 生成西夫 碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。
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环氧化法
碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生成 环氧化合物； 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。
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（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
叠氮化法
重氮化法 (含氨基载体) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
有大量可修饰的酰胺基。
酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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叠氮化法
聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加 1mol/L的亚硝 酸，反应液搅90s； 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
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（一）、糖类载体活化与偶联
溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
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溴化氰活化法
载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用 溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸” 中间体。 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨基 或芳香族氨基的配基偶联。
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亲和层析 Affinity chromatography
第一节 基本原理
生物分子能够区分结构与性质非常相近的 其他分子，选择性地与其中某一分子相结合。 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物 亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为亲 和结合。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原 理进行生物物质分离纯化的技术称为分离纯 化技术，其代表为亲和层析法。
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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3、配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结合的部 位与载体进行偶联。 AMP-Sepharose亲和柱 腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，对脱氢酶 和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛 -3- 磷酸 脱氢酶有吸附力。
技术要点
（1）找与底物专一 可逆结合的配基； （2）将配基通过共 价键偶联到基质； （3）配基与底物吸 附； （4）洗脱目标物。
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技术要点：
寻找可与底物(S)专一可逆结合的配基; 将配基（L）通过共价键偶联到基质，并 要求偶联后L与S的亲和力不变； L与S吸附并与杂质分离，将杂质洗出： 洗脱目标物，即分离纯化。
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非专一性吸附
亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
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离子效应
配基与载体 - 间隔臂的不 完全结合，将无关离子基 团引入吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附 剂会影响蛋白质的洗脱行 为。
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疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的 疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。
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（一）、配基浓度对亲和力的影响
为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值 ≥10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。
对于低亲和力系统，配基浓度。
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（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分 子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。 常用的“手臂 ”多为烃链 。