Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程

镍柱纯化his蛋白步骤

镍柱纯化his蛋白步骤嘿，咱今儿就来说说镍柱纯化 his 蛋白的那些事儿！你想啊，这就好比一场奇妙的旅程。

首先呢，咱得准备好咱的“交通工具”，也就是镍柱啦。

这镍柱就像是一个特别的小房子，专门等着his 蛋白来入住呢。

然后呢，就是把含有 his 蛋白的溶液给弄过来，这就像是带着一群小伙伴准备去镍柱这个小房子里玩耍。

接下来可就关键啦！得让这些溶液慢慢地流过镍柱，这就好像小伙伴们一个一个地走进小房子。

这时候啊，那些带着 his 标签的蛋白就会被镍柱紧紧地抓住，嘿，就像是小房子特别喜欢这些带着特殊标记的小伙伴，把他们留下来一起玩呢。

等这些都完成了，可不能就不管啦。

还得把那些没有被抓住的其他杂质啥的给冲洗掉，这就好比把小房子里不相关的人给请出去，只留下我们想要的 his 蛋白。

那怎么把这些被抓住的 his 蛋白给弄出来呢？哈哈，这就需要一个小技巧啦！用一种特殊的溶液去冲洗镍柱，就像是给镍柱施了个魔法，让它乖乖地把 his 蛋白给放出来。

你说这神奇不神奇？这不就像是变魔术一样嘛！把那些混合在一起的东西，通过这么一系列的操作，就可以把我们想要的 his 蛋白给纯化出来啦。

在这个过程中，可千万要注意细节哦！要是不小心弄错了一步，那可能就得不到我们想要的结果啦。

就像搭积木一样，一块没搭好，可能整个就歪啦。

而且哦，每一步都得仔细认真，不能马虎。

比如说溶液的浓度啊，流速啊，这些都得控制好。

不然的话，就好像走路走偏了一样，可就到不了我们想去的地方啦。

纯化 his 蛋白可不简单呢，但只要我们按照步骤一步一步来，就一定能成功！你想想，当我们最后看到那纯化出来的 his 蛋白，得多有成就感呀！这不就像是经过努力终于爬上了山顶，看到了美丽的风景一样嘛。

所以呀，别害怕困难，大胆地去尝试吧！让我们一起在镍柱纯化his 蛋白的这个奇妙世界里探索，发现更多的惊喜和美好！怎么样，是不是觉得很有意思呀？那就赶紧行动起来吧！。

His标签融合蛋白纯化步骤

His标签融合蛋白纯化步骤（Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）1. 缓冲液配制◆L ysis Buffer 1 (under native condition)0.5mM Tris.HCl0.5M NaCl5%(w/v) glycerol10mM Imidazol100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteinsfrom E.coli)1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 )0.25% Tween 20 （or Triton 100）0.02% NaN3 (Optional)2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free，Recommended)200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional)1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional)50 mM NaF (Optional)1mM Na3VO4 (Optional)+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH此lysis buffer 适用于从E.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His标签的蛋白质。

仅在用于裂解E.coli细菌时，加入溶菌酶。

Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。

NaF是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。

注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA，因EDTA能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。

◆L ysis Buffer 2(under denature condition)50 mM Tris-Cl8 M Urea (or 6 M Gu-HCl)10mM Imidazole0.05% Tween 20Adjust pH to 8.0 using NaOH◆D ialysis/Tev cleavage Buffer50 mM Tris-Cl,pH8.0100 mM NaCl (depends on solubility of protein)2.5% glycerol0.5mM EDTA0.5mM DTT or TCEP◆缓冲液A：50mM Tris.HCl0.5M NaCl5% glycerol0.05% Tween 20用高浓度HCl调节pH值至8.0。

镍柱蛋白纯化

镍柱蛋白纯化镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，它通过靶蛋白的亲和性与含有Ni2+离子的镍柱发生相互作用，从而实现靶蛋白的分离与纯化。

本文将介绍镍柱蛋白纯化的基本原理、实验步骤以及注意事项。

基本原理镍柱蛋白纯化基于亲和层析的基本原理。

亲和层析是一种根据靶蛋白的化学或生物特性选择性地捕捉分离靶蛋白的方法。

镍柱蛋白纯化利用含有Ni2+离子的亲和层析介质作为捕捉靶蛋白的载体。

由于Ni2+离子与组蛋白中的组氨酸以及其他氨基酸存在较强的亲和力，镍柱中的Ni2+离子能够与靶蛋白中含有组氨酸或其他靠近组氨酸的官能团结合，实现了靶蛋白的分离纯化。

实验步骤镍柱蛋白纯化的实验步骤如下：1.细胞裂解与分离：首先需要将选择的表达靶蛋白的菌株用化学或机械方法破裂，并从细胞裂解液中分离靶蛋白。

2.杂质去除：利用超速离心等手段，去除裂解液中的大量无关蛋白质，以减少后续纯化的杂质。

3.镍柱柱层析：将镍柱填充到层析柱中，使之平衡，然后将分离的靶蛋白通过柱层析，利用其与镍柱中Ni2+离子的亲和力捕捉纯化。

4.洗脱：通过改变缓冲条件（如pH、盐浓度等），使得捕获靶蛋白的镍柱发生变化，最终使其与捕获的蛋白离开。

5.透析：将洗脱得到的靶蛋白透析回目标缓冲液中，以去除与纯化过程中引入的杂质。

注意事项1.掌握柱层析的平衡、清洗和洗脱条件，以避免蛋白质在分离过程中被损坏。

2.需要选择合适的表达菌株、表达载体以及诱导条件，以提高目标蛋白质的表达水平和纯化效率。

3.超速离心过程中，建议在4°C下高速离心，以避免破坏蛋白质结构。

4.纯化过程中需要掌握蛋白质的稳定状态和活性，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。

镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，该方法可以高效地从蛋白质混合物中纯化高丰度、高质量的靶蛋白质。

在实验过程中，需要注意掌握柱层析、表达菌株选择、超速离心和掌握蛋白质的稳定状态和活性等方面的技巧，以获得高质量的纯化结果。

镍柱纯化His

镍柱纯化His-tag蛋白1、我司用于纯化TEV蛋白酶。

2、我司镍柱的直径为d=50mm，底面积S=20cm2，高h=400mm，实际填料高为h=250mm。

所以填料体积为V=500ml3、生产实验步骤(1)用上样缓冲液平衡柱子和重悬细菌上样缓冲液配方（1L体积）40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL10mM 咪唑0.18克调节PH7.4平衡柱子缓冲液的体积为柱填料体积的10倍重悬菌缓冲液的体积为菌重量的15倍，如我们有2kg的菌，重悬菌缓冲液的体积为30L。

菌的破碎：破碎两遍，压力为800bar。

菌的过滤：当过滤体积只剩原体积的20%时开始稀释，稀释至的原体积的1/2，即15L。

所以我们要配的上样缓冲液体积为39L。

我们镍柱的上柱速度为20mL/min。

洗柱速度为60mL/min。

（2）用上样缓冲液洗柱子10个体积左右，（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）（3）用不同咪唑浓度的冲洗缓冲液冲洗柱子。

冲洗缓冲液的体积为2-5个体积。

（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）冲洗缓冲液的配方：（1L体积）例如咪唑浓度为20mM。

40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL20mM 咪唑0.18克调节PH7.4（4）用含高浓度的咪唑缓冲液洗脱蛋白。

洗脱缓冲液的配方：（1L体积）例如200mM咪唑。

实际使用可能需要更高浓度。

40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.9% NaCL 9克1% 甘油10mL200mM 咪唑0.18克调节PH7.4洗脱蛋白的速度为：20mL/min洗脱时等峰值开始上升时开始接。

峰前后低浓度的蛋白接一起。

中间的接一瓶。

（5）蛋白的储存：蛋白收集后立即1:1加甘油，-20℃保存。

甘油需先预冷，加甘油时由甘油加入蛋白中，边加甘油边搅拌，搅拌时不能产生气泡。

镍柱亲和层析蛋白纯化步骤

镍柱亲和层析蛋白纯化步骤镍柱亲和层析蛋白纯化步骤镍柱亲和层析蛋白纯化步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊镍柱亲和层析蛋白纯化的那些事儿。

这可是个超级有趣又神奇的过程哦！
呢，咱们得把准备工作做好。

就像要出门旅行得先收拾行李一样。

咱们得有新鲜干净的镍柱，还有各种试剂和设备都得准备齐全，别到时候手忙脚乱的。

然后呀，就是处理样品啦。

这样品就像是一群调皮的小孩子，咱们得让它们乖乖听话。

把含有目标蛋白的样品处理好，去除那些杂质和不需要的东西，让咱们的目标蛋白能够更加突出。

等它们接触得差不多了，就得开始清洗柱子啦。

这就像是给柱子洗个澡，把那些没有结合上的杂质都冲掉。

用各种缓冲液慢慢地冲洗，把柱子洗得干干净净的。

在整个过程中，咱们可得时刻盯着，就像看着自己心爱的宝贝一样。

注意观察各种现象，看看颜色有没有变化，流速是不是正常。

要是有啥不对劲的，赶紧想办法解决。

呢，收集到的目标蛋白还得进行检测和分析，看看纯度够不够高，质量好不好。

如果一切都很完美，那咱们就可以欢呼庆祝啦！
怎么样，朋友们，镍柱亲和层析蛋白纯化是不是很有趣呀？只要咱们一步一步认真做，就能得到咱们想要的纯净蛋白，为后续的实验打下坚实的基础！加油吧，小伙伴们！。

Ni柱亲和层析

北京卓冠科技有限公司邮政编码：100036
１
北京市海淀区复兴路乙 59 号巨星大厦 409 室
TEL：89631256
FAX：68161781
5、用分别含 10、20、50、100、200、300、400mM mM 咪唑的缓冲液 3 进行阶段洗脱，流速为 2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度
缓冲液 2 量(ml)
10 mM
98
2
20 mM
96
4
50 mM
90
10
100 mM
80
20
200 mM
60
40
300mM
40
60
400 mM
20
80
SDS-PAGE 流程：
1 BCA 法测量样品蛋白浓度 2 根据测定样品的蛋白浓度，算出 5-10µg/孔所需的体积。 3 向 1.5ml EP 管中加入含 5-10µg 蛋白的样品溶液，若体积小于 10µl，则加 20mM PBS pH7.4
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５
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缓冲液可以选择中性的磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，NaCl的含量为 0.15-0.5M，作为起始缓冲液。 7、缓冲液中的去污剂一般不会影响对蛋白的吸附作用。 8、蛋白被吸附时，经常会有一部分的螯合金属离子被替换。这种现象通常是可见的，
50μmol /ml ≤45mg/ml 45-165μm
300cm/h 3-10，在位清洗时 pH 范围可到 2-11
+4~8℃ 20%乙醇

Ni柱纯化His-tag蛋白质

Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native Protein）。

其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。

1.样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。

对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。

收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。

PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。

该步骤冰上操作。

3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。

该步骤冰上操作。

4)加入10% Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。

5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。

加入DNase, 使DNase 的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。

6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。

取上清，置于冰上备用或-20度保存。

2．层析1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。

2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程

Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程（编号：067）1、目的及适用范围利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。

2、主要仪器Ni柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机3、主要试剂3.1磷酸盐体系Binding buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0；Wash Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0；Elute Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0。

3.2 Tris盐体系Binding buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH8.0；Wash Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，60 mM imidazole，pH8.0；Elution Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，500 mM imidazole，pH8.0；Striping Buffer：20mM Tris，100mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0。

酸性Buffer：20mM 醋酸钠，500mM NaCl，pH4.0。

Charge Buffer：0.1M NiSO44、操作步骤4.1 Ni柱的预处理4.1.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子；4.1.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni；4.1.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni；4.1.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）；4.1.5用5个柱体积的Binding Buffer平衡柱子。

4.2蛋白的纯化4.2.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；4.2.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；4.2.3 将收集的菌体用Binding buffer重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；137。

亲和柱层析操作规程(包涵体蛋白)

亲和柱层析操作规程（包涵体蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M PB bufferB 缓冲液(PH8.0)平衡Ni柱，直至流出液的pH为8.0；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M PB bufferB 缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含5mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含5mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含10mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含20mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含40mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含50mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含50mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含500mM咪唑的缓冲液B（pH8.0）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

蛋白纯化-Ni亲和层析柱法

.Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白纯化设备：纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden)HisTrapNi亲和层析柱：试剂：所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。

Binding Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑4224Elution Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑4242Stripping Buffer: 20 mMNaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 442220%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L0.1M NiSO: 称取2.6284g NiSO·6HO，加蒸馏水溶解，定容至100 mL244操作步骤：1 样品前处理取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM孔径过滤器过滤后待用。

2 Ni柱前处理上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。

3 上样经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。

4 平衡上样后的Ni柱将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer以5mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。

5 梯度洗脱以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经280SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。

利用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质

利用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质金属离子亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，其中最为广泛应用的是使用含有氨基膦酸（Imidazole）配体的镍柱。

该方法可以通过蛋白质与镍离子之间的亲和作用，实现对His标记蛋白质的选择性分离。

本文将介绍如何使用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的步骤和操作要点。

1. 蛋白质表达与纯化前的准备工作在进行蛋白质表达前，需要将目标蛋白的编码序列克隆至适合的表达载体中，并转化至表达宿主菌。

通常选择大肠杆菌作为表达宿主，而His标记通常插入至目标蛋白的N末端或C末端。

表达宿主菌感染后，通过诱导表达基因，使目标蛋白在细胞内大量表达。

2. 细胞收获与细胞破碎待表达菌株达到适当的浓度后，进行细胞收获。

采用离心等方式将菌株分离并收集。

随后，通过细胞破碎等方式将汇集到的细胞进行裂解，使蛋白质释放至裂解液中。

3. 镍柱填充与样品加载将合适尺寸和柱床材料的镍柱进行填充，将其与柱盒连接。

连接后，用洗涤缓冲液平衡镍柱，去除杂质和剩余离子。

之后，将裂解液进行预处理，去除细胞碎片和不溶性物质，得到清晰的样品液。

4. His标记蛋白质的特异性结合与洗脱将样品液缓慢地加载至预处理后的镍柱上，使蛋白质与镍离子发生特异性结合。

待样品通过后，用足够的洗脱缓冲液进行洗脱。

洗脱过程中，可逐渐增加洗脱缓冲液中的Imidazole浓度，以促进His标记蛋白质的洗脱。

5. 蛋白质纯化与储存经过上述步骤，可得到高纯度的His标记蛋白质。

使用蛋白质分析方法，如SDS-PAGE和Western blot等，对纯化后的样品进行验证。

验证合格后，可将蛋白质进行长期储存，或进一步进行后续的实验和研究。

通过金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的过程相对简单，但操作要点仍需注意。

在实验中，需注意离心、洗涤和洗脱步骤的温度、时间和缓冲液浓度等参数的控制。

此外，为提高纯化效果，可通过调整裂解液pH值、添加适量的盐类以及优化洗脱条件等方法进行优化。

带有His标签重组蛋白的纯化步骤

带有His标签重组蛋白的纯化步骤一、实验试剂Bind Buffer、Elution Buffer（500mM咪唑洗脱液）、20mM咪唑洗液、250mM咪唑洗脱液（目的蛋白洗脱液）、待纯化样品（含Vc蛋白）二、实验设备和材料填料（Ni SepharoseTM6Fast Flow）、纯化柱（带有滤膜）、可调节流速的塞子、500mL塑料瓶（正面经剪裁，配备20ml注射器管）、1L移液枪及相应枪头、100µL移液枪及相应枪头、10mL EP管或50mL离心管及相应板架、2mLEP管和1.5mL EP管及相应板架、冰盒；三、操作步骤（一）样品准备：（1）重组表达菌加IPTG后经低温（16˚C，摇速150rpm～180rpm）诱导表达8～16h，10000rpm离心5min，弃去上清（Amp＋LB）；（2）用PBS或Bind Buffer洗一次（重悬后在离心），加PBS或Bind Buffer （1/10的原上清体积量）重悬；（3）然后在冰水混合合物中超生破碎（工作时间5s，间隙时间5s，1个循环99次，一般6mL菌液1个～1.5个循环即可）（4）超声破碎后12000rpm（或10000g）4˚C离心10min，用5mL注射器小心吸取上清经0.45µm滤器过滤到干净的10mL EP管内（每管7mL）备用（如无需立即纯化，可暂存于-80˚C冰箱保存，使用时提前取出放冰上解冻）。

（二）装柱取填料2mL加入纯化柱中（可以先加2mL超纯水，用Marker笔标出位置），用超纯水洗5～7次（此步骤不需控制流速），除去储存液中的酒精，每次7mL。

（三）结合（1）用Bind Buffer洗3次（过柱时，用可调节流速的塞子将流速调至5s左右滴一滴的速度，下同），每次7mL，平衡柱子；（2）堵住下口，吸取7mL样品（使用用0.45µm滤器过滤；同时取100µL样品备用，SDS-PAGE鉴定时使用，下同）加入柱中，堵住上口，旋转柱子，使填料（镍柱）与样品充分混匀，4˚C垂直静置20～30min后（此时填料已沉到底部），打开上、下柱口，控制流速，回收滤液（滤液可取样100µL作对照），然后用4mL Bind buffer洗一次；（3）重复上一步骤2～3次；（4）打开上、下柱口，控制流速，收集滤液并取100µL样品取样备用；（5）用Bind buffer洗5次，每次4mL。

亲和层析纯化重组蛋白

亲和层析纯化重组蛋白【实验目的】学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。

【实验原理】利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。

【器材与试剂】1.实验仪器摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽2.实验试剂蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,镍离子螯合树脂(His.Bind Resin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/LTris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液: 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 m mol/L Tris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑,20 mmol/L Tris-Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵,标准分子量蛋白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1% SDS,pH8.3;1.5mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS, 10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸3.实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)(工程菌)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。

Ni柱亲和层析

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缓冲液 2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4 的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，
0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g，咪唑 34g和脲 480 g，加热溶解后定容到 1000ml。
尤其是使用有色的金属离子时，比如 Cu2+，所以使用几次后可以先把金属离子洗下来，然后再重新螯合金属离子。
4）洗脱
1、线性降低或一步降低 pH。大多数蛋白在 pH6-4 会被洗脱下来，也可以在 pH 3-4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸、磷酸盐缓冲体系。 2、竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如 0-0.5M咪唑， 0-50 mM组氨酸，0-2M NH4Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。 3、EDTA、EGTA 等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。 4、所有上述情况中，缓冲液中必须加入 0.15-0.5M 的 NaCl 以消除离子交换作用。 5、当螯合离子配基是Cu2+时，有以下的三种操作方式：降低 pH：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4 洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 3.5 竞争洗脱：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 1M NaCl， pH 7.4 洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 1M NH4Cl， pH 7.4 脱落洗脱：上样缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4 洗脱缓冲液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4 使用降低 pH 和脱落洗脱都会使金属离子掉下来，下次使用就得重新螯合金属离子。

可溶蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程

可溶蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程—From CXY Day1一、配制溶液1.Binding Buffer PH8.0 1L20mM Tris 2.42g500mM NaCl 29.2g20mM imidazole 1.36g2.Elution Buffer PH8.0 200ml20mM Tris 0.484g500mM NaCl 5.85g500mM imidazole 6.8g二、表达蛋白3.挑单克隆至4ml LB(Amp)中，37℃生长~12h4.1:50转接至40ml LB(Amp)中，37℃生长过夜Day25.1:50转接至2L LB(Amp)中，37℃生长2h6.加1mM IPTG诱导4h（留样）7.8000rpm，4℃离心8min，弃上清（留样）8.80ml Binding Buffer重悬沉淀，冰上超声至清亮9.最大转速，4℃离心30min，收上清准备上样（留样）三、纯化1.开机打开开关->机身2个OK->other: record on->Flow path: pump A Inlet A2,column position position8->Alarm&Mon: Alarm Pressure 0.4->X-Axis 200ml->Y-Axis UV1 -20~200 Cond 0~702.清洗机器，排空气泡FlowRate 10~20ml/min，走平UV1 CondUV1值调零：Alarm&Mon: AutoZero UV3.B泵充满Elution BufferFlowRate 10~20ml/min，Gradient 100% B，走平UV1 Cond4.A泵充满水，机器用水冲掉Elution BufferFlowRate 10~20ml/min，Gradient 0% B，走平UV1 Cond5.接柱子、洗柱子Ni柱：Hitrap FF（5ml 柱体积，流速0~8ml/min）FlowRate 1ml/min，清洗柱子，乙醇换成水，走平UV1 Cond6.挂Ni（0.1M NiSO4，过滤不高压）FlowRate 4ml/min，A泵水换成NiSO4，走平UV1 Cond7.平衡柱子FlowRate 4ml/min，A泵NiSO4换成Binding Buffer，走平UV1 Cond8. 上样，收集柱后（留样）FlowRate 4ml/min ，A 泵Binding Buffer 换成样品，走平UV1 Cond ，将废液管接至柱后瓶9. 洗非特异结合蛋白FlowRate 4ml/min ，A 泵样品换成Binding Buffer ，走平UV1 Cond ，将废液管接至废液瓶10. 洗脱蛋白FlowRate 4ml/min ，Flow path: FractionCollector 5ml ，清洗2管收集管后开始洗脱，每次洗脱走平UV1 CondNi 柱洗脱通常不用连续梯度，应用阶梯梯度，每个梯度走3~4柱体积，走平UV1 Cond 4% B8% B12% B一般出杂峰16% B 20% B50% B 100% B11. SDS-PAGE 鉴定纯化产物上样柱前柱后，5+20μL12. 清洗柱子及机器FlowRate4ml/min ，Gradient 100% B ，每步走平UV1 Cond->0.1M EDTA （洗Ni 至柱子褪色）->0.5~1M NaOH （清洗柱子）->Binding Buffer （置换OH -）->水（清洗离子）->20%乙醇（保存柱子）13. 卸柱子FlowRate4ml/min ，Gradient 0% B ，每步走平UV1 Cond->水（清洗A 泵）->20%乙醇（保存机器）。

15重组蛋白纯化——NI亲和柱纯化包涵体

Ni-NTA Beads亲和层析纯化6His融合标签包涵体蛋白
1. 样品制备：包涵体蛋白样品
1.1 将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中，8,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole pH 8.0，1mM PMSF) ,加入0.2～0.4mg/ml溶菌酶。

（PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。

）
1.2 将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞。

1.3 将破碎液转移至离心管中，10,000rpm，4℃离心20～30min，去掉上清,沉淀为包涵体。

1.4 步骤1.2和1.3可以重复一次。

1.5 按照原菌体:包涵体溶解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，8M尿素，pH 8.0）=1:10(W/V)将包涵体悬浮溶解，此为包涵体溶液。

（包涵体溶液可用于变性条件下His标签蛋白的纯化。

）
2. 样品纯化
纯化方法与“上清可溶性表达重组蛋白的纯化”章节His标签融合蛋白Ni-NTA的纯化方法完全相同，不同点在于纯化过程所有溶液都在上述实验基础上都添加8M尿素。

镍柱蛋白纯化

镍柱蛋白纯化一、原理镍柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与 Ni2+发生螯合，螯合后的 Ni2+能与 HIS 上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。

影响蛋白质 / 多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密度、层析条件（ pH 、盐的种类和浓度、添加剂等）、缓冲液的配制（500ml PH=7.4）Nacl 14.625g20mM 咪唑 1.8g （5~50mM ）Nacl14.625g 100 mM9g 200mM 18g400mM 咪唑 45g600mM 咪唑 63g50mlBinding buffer: PB50mlWashing buffer: PB 50 mMNacl5mM10 mM15 mM20 mM40Mm 14.625g 0.45g 0.9g 1.35g 1.8g 3.6gElution buffer: PB三、操作步骤此步骤过镍柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镍柱的速度要严格控制 2.5ml /min ，中间镍柱不能进气泡1、5倍镍柱体积去离子水洗涤，去除空气和20%乙醇(5ml /min)2、5~10 倍镍柱体积Binding buffer 平衡3、上蛋白样品4、5 倍镍柱体积Wsahing buffer 洗脱杂蛋白(HIS 标签含有 6 个组氨酸，结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度5、5 倍镍柱体积Elution buffer 洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度6、5 倍体积去离子水清洗掉缓冲液7、20%乙醇保存于4℃注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来四、镍柱重生 (介质使用约3-20 次，具体与原料来源、样品体积等有关 )1. 镍柱用去离子水清洗2. 5倍镍柱体积EDTA 重生镍柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA ，pH7.4)3. 5 倍体积Binding buffer 平衡4. 5 倍体积去离子水清洗5. 20 倍体积1M NaoH 洗涤6. 水洗至中性7. 5 倍柱体积挂镍8. 用 5 倍体积以上的纯水清洗层析柱，去除游离的金属离子9. 20% 乙醇保存4℃五、注意事项1、推荐在中性至弱碱性的条件下（PH 7~8）结合重组蛋白，磷酸盐Buffer 是常用的缓冲液，Tric-cl 在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度2、避免在Buffer 中包含EDTA 或柠檬酸盐等螯合剂3、若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有Buffer中添加6M盐酸胍或8M 尿素4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团，如：NH4 ，甘氨酸，精氨酸，Tris5、各种Buffer 中不能含有高浓度的强还原剂，比如DTT ，防止二价NI 被还原6、不能含有离子型的去垢剂，比如SDS,防止Ni 流失7、Buffer 里可加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度可高达50%8、Buffer中Nacl浓度应在300 Mm ~2M 之间9、可加入非离子型去垢剂如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。

HIS镍柱纯化方法

纯化前准备1.推荐在中性至弱碱性条件下(pH 7-8)结合重组蛋白.磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric—Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。

2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。

3.若重组蛋白以包涵体形式表达,在所有的buffer中添加6 M盐酸胍或8 M尿素4.避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如:NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等5.各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,，比如DTT,防止二价Ni被还原；6.不能含离子型的去垢剂,比如SDS，防止Ni流失;7.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%(v/v）8.缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间;9.可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍,在SDS—PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法,如低pH值法等可被应用,详见说明书Binding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。

但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱.合适的咪唑浓度需要优化。

Buffer 的准备所用的水及化学物质须是高纯度的。

Buffer 在使用前需经0。

45μm滤膜过滤。

所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。

推荐buffer （使用前用0。

45 μm filter过滤）Binding buffer：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl20—40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！) Elution buffer ：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！)1. 样品准备样品需被充分溶解。

镍柱亲和层析酶的纯化MicrosoftWord文档

镍柱亲和层析原理：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。

组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.用Ni亲和层析柱纯化His标签融合蛋白时需要注意哪些事项：1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni 被还原；4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染相关内容：组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al. 1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

HIS镍柱纯化方法

纯化前准备1.推荐在中性至弱碱性条件下(pH 7-8)结合重组蛋白.磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在一般情况下可用,但要注意它会降低结合强度.2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂.3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M盐酸胍或8 M尿素4.避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如：NH4，甘氨酸，精氨酸,Tris，等等5.各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；6.不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；7.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）8.缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2％,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1.包含尿素的样品可直接进行SDS—PAGE分析，若样品中包含盐酸胍,在SDS—PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应用，详见说明书Binding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大,重组蛋白纯度越高。

但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。

合适的咪唑浓度需要优化.Buffer 的准备所用的水及化学物质须是高纯度的.Buffer 在使用前需经0。

45μm滤膜过滤。

所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。

推荐buffer （使用前用0。

45 μm filter过滤）Binding buffer：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl20—40 mM 咪唑pH 7。

4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl500 mM 咪唑pH 7。

4 (咪唑浓度是蛋白依赖的，可变!）1。