实验八 亲和层析分离纯化蛋白质(14)
蛋白质亲和层析
蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。
该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。
以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。
一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。
通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。
常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。
二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。
2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。
3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。
去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。
4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。
5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。
6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。
三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。
2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。
3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。
4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。
蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
在装柱过程中凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱装柱结束后其凝胶表面应平整2021610取4mgml蓝色葡聚糖溶液6mgml细胞色素c溶液2mgml重铬酸钾溶液各6滴混合即为上柱样品
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速，使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min， 取小试管20支，每管 收集1ml，观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法有多种，常用的方法包括：亲和层析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、逆流层析、尺寸排除层析、亲和吸附等。
1. 亲和层析：利用目标蛋白与某种特定配体的特异性结合，将目标蛋白与其他非特异结合的蛋白质分离开。
2. 凝胶过滤色谱：通过选择性大小排除来分离蛋白质。
较大的蛋白质无法进入凝胶孔道，较小的蛋白质可以顺利通过凝胶，实现分离纯化。
3. 离子交换色谱：通过蛋白质与离子交换基质之间的电荷作用进行分离。
离子与蛋白质的电荷性质决定了它们在离子交换基质上的吸附和洗脱特性。
4. 逆流层析：利用生物化学吸附系数的差异分离纯化蛋白质，结合了某种特定的结合物质与逆流洗脱的过程。
5. 尺寸排除层析：根据蛋白质的大小或分子量差异进行分离纯化，较大的蛋白质会直接通过层析柱，较小的蛋白质则会在柱中留下并延时流出。
6. 亲和吸附：利用蛋白质与特定亲和配体之间的特异性结合进行分离纯化。
这种方法具有高选择性和高效率。
这些方法可以单独使用，也可以联合使用，根据目标蛋白质的特性和需求来选择合适的分离纯化方法。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白纯化亲和层析分离技术
蛋白纯化亲和层析分离技术每一种新思想形成的背后都在积极面对“死胡同”时失落；每一种新方法的产生也在处处留心每跨一步留下的脚印；就像不积跬步无以至千里，不积小流无以成江海，一点一点的走心劳动，时间会在某个点积累汇聚，来到你想要的时刻。
这篇文章的主角是蛋白纯化亲和层析技术，在此概述了蛋白纯化亲和吸附层析的原理、应用等，该技术同样经过多年的慢慢演变过程，中间经历了前人的经验和智慧，才发展形成现在的一种新技术，1910年时，淀粉吸附淀粉水解酶；1951年，免疫吸附剂能够分离抗体；1967年，胰蛋白酶的不容酶提纯胰蛋白酶抑制剂。
所以，给予你的实验，包括时间、经历、探索、思维、心态，慢慢磨练，等待想要的实验结果。
——致终在实验台边奋斗的你一滴小水滴，也在映射着大海的样子后来隔了很久很久，故事的结局：正如你看到蛋白质亲和层析技术适应于理化性质差异性较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析住。
它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。
蛋白纯化亲和层析的固相载体具有稳定的理化学性质，是一种含有较多化学反应基团的羟基多糖类介质，具有机械强度高，透性好，不溶于水，非特异性吸附少，多孔网状结构的特点。
常用的载体有琼脂糖凝胶，其他的载体如葡聚糖凝胶，多孔硅胶，树脂，纤维素等，固相载体首先与特定的配体共价偶联形成具有化学活性的基团，即载体的活化，常见的有溴化氰活化载体，即将含有氨基偶联到载体的多糖基上，以及环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体，其他的载体的活化剂还有戊二醛等。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行分离纯化。
这种方法具有选择性强、操作简便、纯化效果好等优点，因此在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。
亲和层析纯化蛋白的基本原理是利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行分离纯化。
配体可以是化学物质、抗体、酶等，而蛋白质则是与配体具有特异性结合的分子。
在亲和层析纯化蛋白的过程中，首先将配体固定在某种固相材料上，例如琼脂糖、硅胶、磁珠等，然后将混合物（包含目标蛋白质和其他蛋白质）加入到固相材料中，目标蛋白质与配体结合，而其他蛋白质则不结合。
最后，通过洗脱等步骤，将目标蛋白质从固相材料中洗脱出来，从而实现纯化。
亲和层析纯化蛋白的优点在于选择性强。
由于配体与蛋白质之间的结合是特异性的，因此可以选择性地纯化目标蛋白质，而不影响其他蛋白质的存在。
此外，亲和层析纯化蛋白的操作简便，不需要复杂的设备和技术，因此适用于大规模生产和实验室规模的纯化。
最重要的是，亲和层析纯化蛋白的纯化效果好，可以得到高纯度的目标蛋白质。
亲和层析纯化蛋白的应用非常广泛。
在生物化学和分子生物学领域，亲和层析纯化蛋白被广泛应用于分离纯化重要的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
此外，亲和层析纯化蛋白还可以用于药物研发、生
物制药等领域，例如纯化重组蛋白、抗体等。
总之，亲和层析纯化蛋白是一种非常重要的蛋白质纯化方法，具有广泛的应用前景。
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种广泛被应用于蛋白纯化的技术，在这种技术中，通过利用靶蛋白与某一亲和剂相互结合的特异性，达到将蛋白从混合
物中分离出来的目的。
具体流程如下：
1.选择适当的亲和剂：根据目标蛋白表面的属性，选择合适的亲和剂，例如特定抗体、金属离子（例如Ni2+）、亲和配体等。
2.制备亲和树脂：将亲和剂固定在树脂上，以制备亲和树脂。
3.样品制备：将含有目标蛋白的混合物制备好，例如细胞裂解物、过
滤液等。
4.样品沉积：将样品与亲和树脂混合，使亲和树脂中的亲和剂与目标
蛋白结合。
5.洗脱：将非特异性结合物和杂质用缓冲液进行洗脱。
6.蛋白洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度等，使
目标蛋白与亲和剂解离。
7.蛋白纯化：收集目标蛋白溶液，以得到纯化的蛋白。
需要注意的是，在亲和层析过程中，亲和剂选择、树脂选择以及缓冲
液的配比等，均会对纯化效果产生影响。
因此，需要根据各种参数进行优化，以得到更好的纯化效果。
chapter8亲和层析精品文档
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系
相互作用
静电作用
氢键
疏水性相互作用 配位键
弱共价键
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
• 生物体内相互作用的分子对： • (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 • (2) 抗原—抗体。 • (3) 激素—受体。 • (4) 糖蛋白与凝集素, • (5) 生物素—生物素结合蛋白等
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
• 凝集素（Lectin）是指一种从各种植 物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖 蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血 球（含血型物质），故名凝集素。
• 常用的为植物凝集素 （Phytoagglutin，PNA），通常以其 被提取的植物命名，如刀豆素A （Conconvalina，ConA）、麦胚素 （Wheat germ agglutinin，WGA）、 花生凝集素（Peanut agglutinin， PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们 的总称。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
实验八 亲和层析分离纯化蛋白质(14)
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理
和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系：
实验试剂
低分子量标准蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400
30%丙烯酰胺（Acr） 10%SDS 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 10%过硫酸铵(AP)（现配现用） TEMED（四甲基乙二胺） 2样品缓冲液 10电极缓冲液母液（pH8.3） 染色液
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
实验步骤
一、装GST柱
1、清洗和装好层析柱，封闭出口。 2、加入2 mL PBS。 3、取1 ml GSH- Sepharose 4B填料，加入 柱子中。 4、打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于填料
亲和层析 分离纯化目标蛋白
实验目的
掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原 理和实验方法（第一部分） 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法 （第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价可逆结合
分子实验14蛋白质纯化
蛋白质纯化一、亲和层析1、绪论亲和层析是基于待分离物质，如蛋白质、多肽、糖蛋白和核酸等生物分子，与固定化在载体上的配基分子之间的专一性相互作用的一种色谱学方法。
通常是在载体（无机或有机介质）表面先键合一段间隔臂，再连接上配基。
间隔臂的作用是减少待纯化蛋白质（或其他生物大分子）与其相适应配基结合时的空间位阻。
这种固相化的配基将只能与其有生物特异亲和性的蛋白质分子相互作用而吸附，没有这种作用的其他生物分子不被吸附而流出层析柱，然后，改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来，于是达到分离纯化的目的。
2、材料AKTATM 层析仪，电脑，分部收集器缓冲液贮槽层析柱、HiTrap chelating HP 1ml和5ml偶联试剂，Ni2+洗柱缓冲液1M NaOH纯化缓冲液Binding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole6M guanidine hydrochloride, 1mM 2-mercaptoethanolpH8.0Washing Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole6M urea 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Refolding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Elution Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl,500mM imidazole1mM 2-mercaptoethanol pH8.0洗Ni缓冲液：20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH7.43、操作步骤（以纯化N-terminal (His)6-tagged recombinant protein produced in E. Coli为例1、亲和层析柱连AKTATM层析仪2、用5-10柱体积的去离子水走柱，去除保存在柱子中的20%的酒精3、走0.1M NiSO4入柱，至层析柱变蓝4、走10柱体积的去离子水平衡层析柱5、用Binding Buffer平衡层析柱纯化：1、将已准备好的样用AKTATM层析仪进柱2、用10柱体积的Binding Buffer平衡柱子3、走10柱体积的Washing Buffer4、复性：走线性梯度，共30柱体积，Washing Buffer 0%→Refolding Buffer 100%5、用Elution Buffer 将目的蛋白洗脱下来，并收集样品层析柱的再生和保存：1、走10柱体积的去离子水去除层析柱中的Buffer2、走10柱体积的洗NiBuffer洗掉Ni离子3、用10柱体积的去离子水平衡4、走1M NaOH入层析柱，并浸泡2h，去除层析柱中沉积的蛋白和其它杂质5、走10柱体积的去离子水和PH为7.0的缓冲液平衡层析柱，直到层析柱中性为止。
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
实验步骤
6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子， 液面应该完全没过电极。
7、点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点 30ul样品，每板胶点5ul Marker。
加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合 8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V； 9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束 10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液， 染色30min左右。 11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。
点样前沸水中加热3-5min。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理 和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集
0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis (29:1) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% APS（催化剂，最后加）
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx亲和层析在蛋白质纯化中的应用亲和层析(affinity chromatography, AC) 是一种简单易操作的生物大分子分离纯化的重要方法之一，它的基本原理是将与待分离纯化的目标产物具有亲和力的亲和配体固定在载体上(比如说，常用载体有琼脂糖、壳聚糖、纤维素、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等)，利用目标产物与亲和配体之间的特异性亲和力，使得亲和配体选择性地结合目标产物，从而达到分离纯化的目的。
亲和层析主要包括四个步骤：(1)制备亲和层析柱;(2)样品裂解液与亲和层析柱结合;(3)将杂质洗出;(4)洗脱目标产物。
亲和层析因具有简单易操作、选择性高、载量大以及分离纯化的蛋白纯度较高等优点，因而被广泛应用于在生物大分子的纯化，如结合蛋白、酶、抗体、抗原、DNA、RNA、病毒、细胞等生物大分子的纯化。
本文就亲和层析在近几年蛋白质纯化中的应用作一介绍。
1 亲和层析的类型亲和层析的类型主要有：生物亲和层析(BAFC)、免疫亲和层析(IAFC)、固定化金属离子亲和层析(IMAC)、拟生物亲和层析(BMAFC)以及特殊基团亲和层析等。
科研人员可以根据自己实验的实际需要选择相应的亲和层析方法来达到实验目的。
2 亲和层析在蛋白纯化中的应用蛋白的分离纯化是蛋白组学研究中一个非常重要的环节，蛋白质能否有效的分离纯化关系到整个实验的成败。
2011年Arnold等用有机小分子1A4，2A8，2A9以及2A10作为亲和配体，与N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)共价结合制备成亲和层析柱，纯化了不同的抗体，其中以2A10作为亲和配体所制得的亲和层析柱纯化得到的抗体产率大于90%，纯度大于80%，这与以蛋白A为配体亲和纯化的抗体的产率和纯度相当，然而小分子为配体的亲和层析柱却解决了以蛋白A为配体易污染、不稳定的难题。
乙酰胆碱酯酶维持乙酰胆碱在动物体内平衡起着非常重要的功能作用，对乙酰胆碱酯酶的研究有着极其深远的意义。
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实验步骤
1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。 3、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇 匀，加入两块玻璃板间。 4、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min， 至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用 滤纸条吸干残余的水。 5、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加 入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理
和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系：
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合） GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B） GST融合目标蛋白 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
亲和层析 分离纯化目标蛋白
实验目的
掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原 理和实验方法（第一部分） 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法 （第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价可逆结合
酶-底物 酶-底物类似物（酶的竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
实验试剂
低分子量标准蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400
30%丙烯酰胺（Acr） 10%SDS 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 10%过硫酸铵(AP)（现配现用） TEMED（四甲基乙二胺） 2样品缓冲液 10电极缓冲液母液（pH8.3） 染色液
样品制备
待纯化蛋白：GST标记的纤维素酶 来源：重组大肠杆菌 提取方法：超声波破细胞释放GST-纤维素酶 条件：超声处理3秒，间歇5秒，共15分钟。 4000rpm离心5分钟，取上清（混合蛋白质溶液） 上柱。
SDS-PAGE样品制备
1号样： 过柱前的蛋白溶液25uL，加5uL 5X上 样缓冲液。 2号样： 洗脱的蛋白溶液（2号管）25uL，加5uL 5X上样缓冲液。 3号样： 洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。 点样前沸水中加热3-5min。
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis (29:1) 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 10% SDS TEMED（加速剂） 10% APS（催化剂，最后加） 总体积
实验步骤
6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子， 液面应该完全没过电极。
7、点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点 30ul样品，每板胶点5ul Marker。
加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合
8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V；
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
实验步骤
一、装GST柱
1、清洗和装好层析柱，封闭出口。 2、加入2 mL PBS。 3、取1 ml GSH- Sepharose 4B填料，加入 柱子中。 4、打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于填料
logMW=K-bm
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝 胶浓度相同。 电荷、分子筛效应。
不连续系统: 缓冲液离子成分、pH、 凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。
浓缩效应
（三个不连续性） 1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）
2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3 种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低， 比Gly高。 3、电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位 梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位 梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳 极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中 间层。
12%分离胶
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
5%浓缩胶
试剂名称 ddH2O 30% Acr-Bis （29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8） 10%SDS TEMED 10%AP（最后加） 总体积 5% 1.7 mL 0.43 mL 0.31 mL 25 uL 10 uL 25 uL 2.5 mL
二、纯化目的蛋白
1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。
2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束
10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液， 染色30min左右。 11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
实验结果分析
绘制标准曲线：log MW Fra bibliotek K - bm
蛋白质区带中心至分离胶上沿距离 相对迁移率= 溴酚蓝至分离胶上沿距离 以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移 率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁 移率即可在标准曲线上查出其分子量。